采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法
【专利说明】采用焚光RT-PCR技术检测周氏嗤小蜂Hsp60基因表达的方 法
[0001] 本发明得到：国家自然科学基金（31201730);天津市高等学校科技发展计划项目 (20110602);天津师范大学博士基金（52XB1003)及天津市动植物抗性重点实验室开放基金 的资助。
技术领域
[0002] 本发明涉及生物技术领域，涉及用于检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的特异性引 物，更具体的说是一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法。主要 用于周氏啮小蜂Hsp60基因表达调控机理及其生态防治的研究，研究结果可为科学利用天 敌昆虫周氏啮小蜂进行生物防治提供理论基础。
【背景技术】
[0003] 热激蛋白Heat shock protein (Hsp)是一类在生物体内广泛存在的，对体内外 环境变化极为敏感的高保守性蛋白质，广泛参与了各种生理代谢途径，近年来已成为生物 研究领域中的一个热点。根据其分子量的大小可将其分为不同的蛋白家族，其中Hsp60与 温度胁迫应激性密切相关。温度是影响生物体生存至关重要的环境因子，只有在一定的温 度范围内生物体才能进行物质能量代谢以维持正常生理活动，超出温度的耐受范围都会使 生物的生长发育停滞甚至死亡。一般来说生物体受到高温或低温刺激后，蛋白合成量会有 显著变化，用以增强抗逆境能力。由于热激蛋白会在胁迫消除后一段时间内保持一定的含 量使生物体更好生存，可以认为其存在对于生物体适应环境有着重要作用。
[0004] 周氏嗤小蜂CAoi/ioiaciMea Yang是我国重要入侵物种美国白蛾 (Drury)的重要寄生性天敌，体长1. 1-1. 5mm，群集内寄生于美国白蛾蛹 中，是抑制美国白蛾的主要天敌因子，对控制美国白蛾的危害起到重要作用。除寄生于美国 白蛾外，还可寄生于鳞翅目的枯叶蛾科、毒蛾科、舟蛾科、尺蛾科、菜蛾科和双翅目的蝇科、 寄蝇科及鞘翅目的叶甲科和瓢甲科等。
[0005] 通过野外释放C??抑可以达到有效防治美国白蛾的目的。然而，在野外环境 下，C??似的活力会受到多重因素的影响，其中，温度作为一个主要生态因素，会影响C craea的生命力。在合适的温度范围投放小蜂，才会起到更好的防治效果。
[0006] 实时荧光PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧 光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光PCR技 术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光 PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。目前，已 广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，近年 来，实时荧光PCR技术在动物生态防治中也得到了广泛的应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是公开一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达 的方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下： 设计一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的特异性引物，其特 征在于包括符合荧光PCR反应特点的特异上下游引物：Hsp60-F :5' -TGCGATGAACAACGAATA -3，；Hsp60-R:5，-CGTCAATAGTGAAGCGACT-3，； 本发明所述特异性引物快速检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法，其特征在于按如 下步骤进行： (1)使用下述引物进行该基因的检测： 符合荧光PCR反应特点的该序列特异上下游引物： Hsp60-F :5'-TGCGATGAACAACGAATA-3' Hsp60-R :5,-CGTCAATAGTGAAGCGACT-3' (1)总RNA的提取：采用各种通用的RNA提取方法，从周氏啮小蜂成体中提取总RNA; (3) cDNA合成：以周氏啮小蜂总RNA为模板合成cDNA，反应体系为20μL; (4) 实时荧光PCR:以上述合成的cDNA为模板，上述（1)中Hsp60-F和Hsp60-R、GADPH-F 和GADPH-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所 得3个平行管的Ct值取平均数。
[0009] (5)周氏啮小蜂在不同温度下Hsp60基因相对表达量计算： 实时荧光PCR后，当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用ΛΛCT法计算不同 温度下Hsp60基因相对于内参GADPH基因的mRΝΑ相对表达量。
[0010] 本发明所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为25μ mol/L的贮存液， 工作浓度为〇. 5μmol/L。
[0011] 本发明进一步公开了采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的特 异性引在制备检测周氏啮小蜂适应外界环境变化方面的应用。实验结果表明：图1为不同 温度下周氏啮小蜂Hsp60基因的相对表达量。从图中看出无论是高温还是低温都可以影响 周氏啮小蜂体内的Hsp60的表达。在低温胁迫的情况下，随着温度的不断降低，周氏啮小蜂 体内的Hsp60的相对表达量呈上升的趋势，并且在-7°C时达到最大表达量；在高温胁迫的 情况下，随着温度的不断升高，周氏啮小峰体内的Hsp60的相对表达量也呈上升的趋势，但 在40°C时达到最大表达量。这对于以后在何种室外温度下放飞白蛾周氏啮小蜂防治美国白 蛾具有重要意义。
[0012] 本发明提供的特异性引物快速检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法与现有技 术相比的有益效果是： (1)本发明采用的实时荧光RT-PCR技术与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由自动 化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光PCR技术 全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。实时荧光RT-PCR 技术也免除了常规PCR中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间。
[0013] (2)在通过RT-qPCR的方法研究不同温度下Hsp60基因表达的变化，结果显示在 不同温度条件下周氏啮小蜂体内的Hsp60基因的表达水平处于一个动态过程中，高温和低 温胁迫都使周氏啮小蜂体内Hsp60有一个高的表达量，在40°C和_7°C体内表达量最大。
[0014] (3)因此本发明提出研究了周氏啮小蜂适应外界环境的变化，避免受到胁迫因子 对自身的伤害的保护机制，对于防治美国白蛾有重大意义，为绿色防治林业害虫提供了一 个新的思路和技术。
[0015] 周氏啮小蜂热激蛋白Hsp60基因，其cDNA序列和编码氨基酸的序列如表1、表2所 7Jn〇
[0016] 表 1
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专 业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本 发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。本发明中 所述的提取白蛾周氏啮小蜂总RNA的提取，cDNA的合成，实时荧光定量RT-qPCR等方法都 是本领域成熟的技术，试剂盒TransScript?RT、TransStart?TopGreenqPCRSuperMix等 都可以从生产商家购买。
[0019] 实施例1: 获得白蛾周氏啮小蜂Hsp60基因序列 实验材料取自室内传代培养的白蛾周氏啮小蜂(培养条件：于人工气候箱（PQX-350H) 中，温度25°C，相对湿度60%~80%，无光黑暗)。取羽化后24h内的雌性周氏啮小蜂，于解剖 镜下切取触角，立即浸于RNAlater(Ambion公司，AM7020)中；每200头雌性白蛾周氏啮小 蜂的触角贮存于一个1. 5mL离心管中，共搜集8管