样品，并于-20°C下低温保存，样品制备 完成后送华大基因科技服务有限公司（http://www.genomics,cn/index)进行转录组测序。
[0020] 应用高通量测序平台IlluminaHiSeq? 2000对周氏啮小蜂触角样本进行转录组 测序，采用Trinity软件对每个读取序列片段进行聚类后拼接成unigene，再结合生物信 息学软件进行靶标序列cDNA全长的判定，进行Blast同源序列检索予以确认，得到Hsp60 基因cDNA序列和编码氨基酸的序列。
[0021] 实施例2: 总RNA的提取 选取30头左右白蛾周氏啮小蜂进行不同温度处理，高温处理（lh)为28°C、32°C、36°C、 40°(：和42°(：;低温处理（111)为11°(：、6°(：、1°(：、-3°(：、-7°(：。处理后产物立即使用或保存 于-20 °C冷冻。
[0022] (1)取30头左右白蛾周氏啮小蜂置于1. 5mL的无菌离心管内，倒入液氮并迅速用 研磨棒进行充分研磨。将600μLTrizon溶液加入离心管，静置5min。
[0023] (2)将200μL氯仿加入离心管，剧烈振荡15s，静置3min。
[0024] (3) 4°C下12000rpm离心15min，将上层无色水相转入新无菌离心管中，加入 400μL异丙醇，_20°C下放置 20min，12000rpm离心lOmin。
[0025] (4)小心倒掉管中液体，保留沉淀，加入600μL75%乙醇洗涤沉淀。4°C下7500rpm 离心5min，再重复一次乙醇洗涤沉淀操作。
[0026] (5)小心弃去上清液，室温干燥2min。将RNA沉淀溶于20μLRelution Buffer中， 必要时可55°C -60°C水浴10min。
[0027] (6)所得沉淀即为白蛾周氏啮小峰总RNA，产物立即使用或冷冻保存于-70°C。
[0028] 实施例3 : cDNA的合成 以实施例2所述白蛾周氏啮小蜂总RNA作为模板。取一消毒的0.2mL离心管，加入以 下反应体系（20yL体系）：Total RNA 5yL，or Random Primer (N9) (0.1yg/yL)lyL， 2XTS Reaction Mix 10μL, TransScript?RT/RI Enzyme Mix 1μL, RNase-free Water 3 μ L，混匀。
[0029] 反应条件为25°C水浴保温10分钟，42°C水浴保温30分钟，85°C高温加热5分钟， 以使离心管中存留的TransScript?RT失去活性。产物立即使用或保存于-20°C冷冻。
[0030] 实施例4 : 荧光定量PCR反应体系和条件 (1) 引物设计： 根据所述周氏嗤小蜂Hsp60基因的全长序列，使用Primer 5软件设计适用于实时焚 光PCR检测的特异性引物，引物序列如下： Hsp60-F :5'-TGCGATGAACAACGAATA-3' Hsp60-R :5,-CGTCAATAGTGAAGCGACT-3' PCR产物预计长度为108 bp 同时，根据转录组数据库里提供的周氏啮小蜂GADPH基因的cds序列设计用于实时荧 光PCR内对照的引物，引物序列如下： GADPH-F :5'-GAGGTGGTAGAGCCGCTTCC-3' GADPH-R :5'-TTTAGCTTTGATCGCGTCGT-3' PCR产物预计长度为154 bp (2)实时荧光PCR:运用SYBR Green嵌合荧光法进行RT-PCR分析。使用CF96X PCR仪 (Bio-Rad)进行PCR反应。以上述实施例3中合成的cDNA为模板，使用Hsp60-F和Hsp60-R、 GADPH-F和GADPH-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，扩 增后所得3个平行管的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的反应 循环数）取平均数。
[0031] 实时荧光PCR扩增体系设置如下：
实时荧光PCR扩增参数设置如下： 50°C 120s； 95°C 120s ;95°C Is ;6(TC 30s (40个循环）； (3)白蛾周氏啮小蜂在不同温度下Hsp60基因相对表达量计算： 当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用ΛΛCT法计算各个温度下Hsp60基因 相对于内参基因的的m R NA相对表达量，用SPSS 19. 0软件进行单因素方差分析，Duncan 氏新复极差法检验不同处理间差异显著性。
[0032] 图1为不同温度下周氏啮小蜂Hsp60基因的相对表达量。从图中看出无论是高温 还是低温都可以影响周氏啮小蜂体内的Hsp60的表达。在低温胁迫的情况下，随着温度的 不断降低，周氏啮小蜂体内的Hsp60的相对表达量呈上升的趋势，并且在-7°C时达到最大 表达量；在高温胁迫的情况下，随着温度的不断升高，周氏啮小峰体内的Hsp60的相对表达 量也呈上升的趋势，但在40°C时达到最大表达量。这对于以后在何种室外温度下放飞白蛾 周氏啮小蜂防治美国白蛾具有重要意义。
【主权项】
1. 一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的特异性引物，其特征在 于它是由符合荧光PCR反应特点的特异性上下游引物： Hsp60-F:5'-TGCGATGAACAACGAATA-3' ；Hsp60-R:5'-CGTCAATAGTGAAGCGACT_3'〇2. -种采用权利要求1所述的特异性引物快速检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方 法，其特征在于按如下步骤进行： 使用下述引物进行该基因的检测： 符合荧光PCR反应特点的该序列特异上下游引物： Hsp60-F:5'-TGCGATGAACAACGAATA-3' Hsp60-R:5,-CGTCAATAGTGAAGCGACT-3' (2) 总RNA的提取：采用各种通用的RNA提取方法，从周氏啮小蜂成体中提取总RNA; (3)cDNA合成：以周氏啮小蜂总RNA为模板合成cDNA，反应体系为20μL; (4)实时荧光PCR:以上述合成的cDNA为模板，上述（1)中Hsp60-F和Hsp60-R、GADPH-F 和GADPH-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所 得3个平行管的Ct值取平均数； (5) 周氏啮小蜂在不同温度下Hsp60基因相对表达量计算： 实时荧光PCR后，当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用ΛACT法计算不同 温度下Hsp60基因相对于内参GADPH基因的mRNA相对表达量。3. 权利要求1所述快速检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法，其中每条引物分别配 制成浓度为25 ymol/L的贮存液，工作浓度为0.5 ym〇l/L〇4. 权利要求1所述的采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的特异性 在制备检测周氏啮小蜂适应外界环境变化方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60相对表达量的方法。本发明中周氏啮小蜂Hsp60实时荧光RT-PCR检测方法的建立，为研究周氏啮小蜂Hsp60表达调控机理及其生态防治奠定基础。研究温度的变化对于周氏啮小蜂体内Hsp60基因表达量的影响，研究结果可为科学利用天敌昆虫周氏啮小蜂提供理论基础，这对于以后在何种室外温度下放飞周氏啮小蜂防治美国白蛾具有重要意义。本发明为在mRNA水平对Hsp60基因的相对定量分析提供了技术平台。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105296654
【申请号】CN201510838225
【发明人】李敏, 张新玥, 王凤竹, 李婷婷, 朱耿平, 刘强
【申请人】天津师范大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月26日