羊源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及羊源性成分鉴定及其制品中多物种种 源成分的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 羊肉是我国人民食用的主要肉类之一，既能御风寒，又可补身体，是冬季的进补佳 品。其肉质与牛肉相似，但肉味较浓，味道鲜美。羊肉肉质细嫩，含有丰富的蛋白质，脂肪和 胆固醇较猪肉和牛肉少，矿物质钙、磷、铁、钾、碘等含量较猪牛肉高，营养全面。李时珍在 《本草纲目》中说："羊肉能暖中补虚，补中益气，开胃健身，益肾气，养胆明目，治虚劳寒冷， 五劳七伤"，可见羊肉具有极高的食疗价值。
[0003] 自2012年12331食品药品安全热线开通以来，关注度逐年增加，而食品类反映的 主要问题是肉制品掺假，例如牛羊肉中掺入鸭肉、猪肉等。2013年江苏无锡的"掺假羊肉" 事件，犯罪嫌疑人用狐狸、水貂、老鼠等未经检验检疫的动物肉制品冒充羊肉，流入了多家 知名火锅店；亦或是成为羊肉串的成分。近年来，羊肉掺假事件常有发生，特别是接二连三 曝光的制售假羊肉案件，引发社会广泛关注。羊肉掺假的方式一般是：掺杂猪肉、鸭肉、狐 狸肉等其他价格较低的肉类；或者直接用猪肉、鸭肉掺上羊油、香精、羊肉粉等。此外，在饲 料、皮张中掺假的现象也时有发生；例如某些不法商贩用相对廉价的猪皮冒充羊皮制品，欺 骗消费者，从中牟取暴利。因此，针对羊源性制品建立一套科学、准确、快速、低廉的检测方 法是十分必要的。
[0004] 日常生活中人们通常依靠感官和经验进行动物产品鉴别，但是随着加工方法的改 进和各类制品中掺假成分的多元化、种类的复杂化，这种方法已远不能达到对动物源性制 品掺假现象进行控制与监管的目的。随着现代分子生物学的发展，以聚合酶链式反应（PCR) 为基础的技术已成为动物源性成分鉴定的核心方法。同时，DNA也因其高稳定性和在不同组 织中的同一性被选作比蛋白质更可靠的分析靶点。目前，根据线粒体基因组DNA序列差异设 计物种特异性引物所建立的PCR方法已有大量报道（GhovvatiS，NassiriMR，Mirhoseini SZ,HeraviMA,JavadmaneshA.Fraudidentificationinindustrialmeatproductsby multiplexPCRassay.FoodControl, 2009, 20(8) :696-699；GirishPS,AnjaneyuluAS R,ViswasKN,ShivakumarBM,AnandM,PatelM,SharmaB.Meatspeciesidentification bypolymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism(PCR-RFLP) ofmitochondrial12SrRNAgene.MeatScience,2005,70(1):107-112；DooleyJ J，PaineKE，GarrettSD,BrownΗM.DetectionofmeatspeciesusingTaqMan real-timePCRassays.MeatScience，2004, 68 (3): 431-438·)，且被列入了 中国权威的检 测技术标准（步迅，张全芳，刘艳艳.一种同时鉴定山羊、绵羊、猪和鸭肉源性的荧光标记基 因复合扩增方法[P]，中国专利：CN103397101A，2013-11-20 ;张英杰，刘月琴，陈睿赜，刘彦 琴，郭云霞，李雪梅，杨佳栋，锡建中.一次性鉴别羊肉、鸡肉、鸭肉、猪肉的PCR检测方法及 试剂盒[P]，中国专利：CN104099405A，2014-10-15.)。但是线粒体DNA拷贝数多，在不同组 织中含量不同，稳定性差且难以进行定量分析。而动物细胞核基因组DNA序列具有高度的 物种特异性，能够避免非特异性扩增，更加适合用作PCR定性和定量分析。目前，国际上以 细胞核DNA序列为目标序列，用于鉴别肉源的PCR检测方法大多只能区分开牛、羊、猪、鸡、 鸭等常见肉制品（黄明，程欣，杨静，黄继超，周兴虎.一种快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分 的方法[P]，中国专利：CN103525908A，2014-01-22 ;黄明，黄玮玲，杨静，徐幸莲，周光宏.一 种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法[P]，中 国专利：CN102864243B，2013-9-25)。而肉产品市场掺假的复杂性（例如，我国多地的"混 合羊肉"事件中有不法分子将狐狸、水貂、老鼠等动物肉，添加进羊肉里销往江苏、上海等地 的农贸市场；欧洲"马肉风波"以马肉冒充高档牛肉等）表明，一种更加快速、简便、准确、全 面的肉类掺假的检测方法成为当今市场最为迫切的需求，而目前能用于同时鉴别马、狐狸、 水貂、鼠等多种动物种源性成分的PCR检测方法尚未见报道。此外，在饲料、皮张中动物源 性成分掺假的现象也时有发生。因此，建立用于鉴别多物种的快速检测方法将对食品安全 的监管具有重要的实践意义。
[0005] 此外，就检测方法而言，目前多采用荧光PCR检测（曹琛福，宗卉，张彩虹等.驴 或驴源性成分实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针[P]，中国专利：CN102311999A， 2012-1-11 ;黄明，黄玮玲，杨静，徐幸莲，周光宏.一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉 成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法[P]，中国专利：CN102864243B，2013-9-25)、 酶切检测（章安，尤金花，解福生，师秀梅.一种鉴定动物皮张的方法[P]，中国专利： CN1294277C，2007-1-10 ;姚永刚，陈仕毅，刘益平.一种快速鉴别5种家畜肉和肉干制品种 类的方法[P]，中国专利：CN101712996,2010-5-26)或者通过扩增片段大小（乔建军，孙艳 华，张智禹，关丛笑.多重PCR检测食品中肉类来源的引物组及试剂盒[P]，中国专利：CN 101962675B，2013-2-6)等来进行判断。但是荧光检测方法对设备的要求高且花费较大； 酶切检测方法则费时费力；而多重PCR通过扩增片段大小来鉴别动物肉源严重限制了可检 测物种的数量，且引物间常相互干扰或形成二聚体，影响检测结果的可信度。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种可用于羊源性制品特异性检测的 引物；
[0007] 本发明的第二个目的在于提供用于羊源性制品检测的检测试剂盒；
[0008] 本发明的目的还在于提供羊源性制品掺假鉴定方法。
[0009] 为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行 羊基因组特异DNA序列的筛选，经过牛科非羊亚科的牛、水牛，非牛科的猪、马、驴、鼠（大 鼠、小鼠、仓鼠）、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐和水貂等的基因组DNA及不同的羊品种DNA中的 检测，筛选在羊中特异的、在其他物种中不存在或同源性低的DNA片段作为检测分子。经过 大量分析和实验工作，最终获得可供检测使用的特异DNA序列，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 1 所示。
[0010] 基于此，本发明首先提供一种羊特异性引物，其特异性扩增SEQIDNo. 1所示的核 苷酸序列或该序列的特异性片段。
[0011] 优选地，引物长度为18~27bp。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片 段长度、反应温度等多方面。
[0012] 优选地，该引物序列如下：
[0013] 0VIS-F-.5'-AGGTTCCAGCCTCACCAGTGA-3r
[0014]OVIS-R： 5r -ACTGCTTGTGTCTCTGATGCCA-3r ；
[0015] 或该引物向Y、3<端延伸或修饰得到的仍能特异性扩增SEQIDNo.1所示序列 的引物。
[0016] 进一步，本发明提供含有上述特异性引物的检测试剂盒。
[0017] 优选地，所述试剂盒还进一步包括以下引物中的一种或多种：
[0018] (1)对猪基因组DNA进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对I:
[0019]SUS-F: 5' -GCAATGCTCCAAGGACTTAGTGA-3'
[0020] SUS-R： 5r -TGTGCTCAAATAGGAAGGTTGTCA-3r ；
[0021] (2)对普通牛基因组DNA进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Π:
[0022]B0S-F：5r -CAGTGAGGACATCAGCCTAGAGT-3r
[0023] BOS-R：5r -CTGCTCCTAGCCATCAGTGGA-3r ；
[0024] (3)对水牛基因组DNA进行扩增生成水牛特异性扩增片段的引物对III:
[0025]BUBALUS-F:5, -GAAGAAGAGGGAGGGGTAGACAA-3,
[0026] BUBALUS-R：5r -CAGAACTAGTGAAGGCGGCA-3r；
[0027] (4)对马属（马、驴）基因组DNA进行扩增生成马属特异性扩增片段的引物对IV:
[0028]EQUUS-F： 5r -TGGCTCTGAAGATGATGAGGCTG-3r
[0029]EQUUS-R： 5r -GAGGCAATGATTTTGTTCTGCGT-3r ；
[0030] (5)对兔基因组DNA进行扩增生成兔特异性扩增片段的引物对V:
[0031] 0CU-F: 5' -TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3，
[0032]OCU-Rj' -GCCTTAGAGTAG