HlOBacTMEcoli，转变为杆粒。利用蓝/白斑法筛选出含有重组杆粒的克隆。在LB培养基中培养含有重组杆粒的大肠杆菌，抽提重组杆粒，并冻干保存，备用。
[0042]4、昆虫细胞的转染和杆状病毒粒子的收集。
[0043]①Sf9细胞计数，取12.5cm2新细胞培养瓶，每瓶加入9 X 10 5个细胞，并以全培培养12-24h，使细胞贴壁；②溶解2 μ g纯化重组杆状病毒重组质粒于100 μ L无添加成分的Grace’s培养基中；③将转染试剂充分摇匀后，取10 μ L加入100 μ L无添加成分的Grace’s培养基中，混匀；④将②和③所得溶液混匀，室温孵育30min，同时以2mL含10% FBS的Grace’ s培养基洗涤待转化的细胞并弃去洗涤液；⑤取0.8mL无添加成分的Grace’ s培养基加入④所得质粒于转染剂的混合液中，轻轻混匀，总体积约lmL，加入④步洗涤完成的待转化的细胞中，27°C继续培养5h ;⑥移除质粒、转染试剂混合物，加入2mL含10% FBS的Grace’s培养基，27°C孵育，直至病变现象产生?’⑦5天后，lOOOrpm离心lOmin收集细胞培养液中的病毒粒子，转移上清到冻干管中，贴上标签，置于4°C冰箱中避光保存。由于昆虫细胞表达系统具有突出的优点:表达水平高、易于放大、生产的蛋白带有适当的翻译后修饰，而且细胞生长条件简单等优势。本发明通过研究发现采用杆状病毒表面展示系统展示的重组PCV-2 0RF2蛋白其蛋白特性与天然蛋白更接近，且蛋白表达产量更高。
[0044]5、杆状病毒粒子的扩增以及PCV-2 0RF2蛋白的表达。
[0045]①取适当体积的杆状病毒粒子原液加入到汇聚度90%的新鲜传代的sf9细胞中，27旦温培养箱中，静置lh，每隔15min轻轻晃动一次；②去掉培养瓶中的培养液，加入新鲜的含10% FBS的Grace’ s培养基，27°C恒温培养箱中恒温培养3天后，lOOOrpm离心lOmin收集细胞培养液中的病毒粒子，转移上清液到冻干管中，贴上标签，置于4°C冰箱中避光存放得到的病毒粒子可重复上述①-③步骤，以获得更高滴度的病毒粒子；⑤加入高滴度的杆状病毒病毒粒子到汇聚度达95%的新鲜传代的sf9细胞中，27°C恒温培养箱中，静置lh，每隔15min轻轻晃动一次；⑥去掉培养瓶中的培养液，加入新鲜的含10% FBS的Grace’s培养基，27°C恒温培养箱中恒温培养?’⑦40_44h后，轻轻倒尽细胞上清培养液，加入预冷的细胞裂解液，冰上静置30min ;⑧收集细胞裂解液，加入等体积的2 X SDS凝胶加样缓冲液上样缓冲液，混匀，100°C保持lOmin SDS-PAGE检测蛋白质的表达情况。
[0046]6、PCV-2 0RF2 蛋白的回收。
[0047]蛋白分离:目标可溶性蛋白展示完成后，将5步得到的杆状病毒粒子溶液于18000-22000rpm，4°C离心15分钟，收集沉淀，既得表面展示有PCV-2 0RF2蛋白的杆状病毒粒子，后用原体积十分之一的纯水重悬杆状病毒粒子得杆状病毒粒子溶液，用终浓度为500-1000单位/L的凝血酶切割杆状病毒表面的PCV-2 0RF2蛋白，切割完成后将溶液于18000-22000rpm，4°C离心15分钟，收集上清，并将上清过0.22 μ m微孔滤膜。
[0048]蛋白纯化:①取Ni柱流干，后用水洗3-5个柱体积，再用0.1M的EDTA溶液洗3个柱体积，之后再用水洗3-5个柱体积，然后再用pH 8.0的ΝΤΑ-0缓冲液洗3个柱体积，之后再用0.1M NiS04溶液洗5个柱体积并流干；②用pH4.2的0.2M醋酸钠平衡液洗3个柱体积，之后再用pH 8.0的ΝΤΑ-0缓冲液洗柱子，直到流出液与洗脱液的pH —致时，停止洗脱；③用lmL/min的流速将提取的蛋白质溶液上柱子上样完成后用pH 8.0的ΝΤΑ-0缓冲液洗柱子至G250不变蓝为止；⑤后分别用20mM、60mM、200mM和500mM的咪唑溶液洗脱柱子，直至检测G250不变蓝为止，洗脱过程中分别收集流出的液体，并将液体测定浓度后冷冻干燥既得重组PCV-2 0RF2蛋白干粉。
[0049]蛋白分离纯化后用SDS-PAGE和Western blot方法进行检测，首先配制蛋白溶液，然后进行检测，检测过程中第一抗体用猪圆环病毒病阳性血清，第二抗体用HRP标记的兔抗猪IgG，以标定表达的猪圆环病毒囊膜蛋白0RF2。
[0050]对比实验:
[0051 ] 对比实验中采用空载质粒进行，其余步骤和上述步骤一致。
[0052]从图3中可以看出采用本发明的方法，利用本发明的杆状病毒表面展示系统和蛋白回收方法可以有效的表达PCV-2 0RF2蛋白，并能对该目标蛋白实现快速回收和分离纯化。
[0053]最后所应说明的是，以上【具体实施方式】仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1.一种重组杆状病毒表面展示系统，所述展示系统除含有表达载体外，其特征在于，还包括特定基因片段，所述特定基因片段包括:GP64信号肽、缺失信号肽的目的可溶性蛋白cDNA、蛋白标签、酶切位点以及终止密码子。2.根据权利要求1所述的重组杆状病毒表面展示系统，其特征在于:所述缺失信号肽的目的可溶性蛋白cDNA基因片段位于GP64信号肽与蛋白标签之间。3.根据权利要求1所述的重组杆状病毒表面展示系统，其特征在于:所述表达载体为pFastBacl vector04.根据权利要求1所述的重组杆状病毒表面展示系统，其特征在于:所述蛋白标签为MyC、His、GST或HA，优选为His标签。5.根据权利要求1所述的重组杆状病毒表面展示系统，其特征在于:所述终止密码子为TGA，TAA或TAG，优选为TAG。6.利用权利要求1-5任一项所述重组杆状病毒表面展示系统回收可溶性蛋白的方法，其特征在于: 1)构建表达载体及转化大肠杆菌:首先通过基因扩增方法得到含有目的可溶性蛋白核酸序列的基因片段，将得到的基因片段插入到表达载体中，然后转化大肠杆菌，酶切位点选用凝血酶的切割位点；基因片段插入表达载体的步骤包括:首先对表达载体进行消化处理，然后在连接酶的作用下将表达载体与核酸序列进行连接，形成完整的环状质粒，最后将环状质粒转化到大肠杆菌DH5a中； 2)表达载体验证:在得到大肠杆菌Amp抗性转化株后，挑取部分转化株，在含有Amp浓度为80-120 μ g/mL的LB液体培养基中过夜培养，抽提质粒，使用酶切消化处理质粒DNA ;通过琼脂糖凝胶电泳分析重组质粒是否插入正确的位点，同时用PCR方法对阳性转化株进行分析，最后，将找到的阳性重组子进行测序，验证转化质粒的正确性； 3)表达目的可溶性蛋白用重组杆状病毒粒子克隆的制备:提取阳性重组子的质粒DNA，并将其转化进入大肠杆菌DHlOBacTMEcoli，转变为杆粒；利用蓝/白斑法筛选出含有重组杆粒的克隆，在LB培养基中培养含有重组杆粒的大肠杆菌，抽提重组杆粒，冻干保存，备用; 4)昆虫细胞的转染和重组杆状病毒粒子的收集:①sf9细胞计数，取12.5cm2新细胞培养瓶，每瓶加入9 X 105个细胞，并以全培培养12-24h，使细胞贴壁；②溶解2 μ g步骤3)得到的纯化重组杆状病毒质粒于100 μ L无添加成分的Grace’ s培养基中将转染试剂充分摇匀后，取10 μ L加入100 μ L无添加成分的Grace’ s培养基中，混匀；@将②和③所得溶液混匀，室温孵育30min，同时以2mL含10% FBS的Grace’s培养基洗涤待转化的细胞并弃去洗涤液；⑤取0.8mL无添加成分的Grace’s培养基加入④所得质粒于转染剂的混合液中，轻轻混匀，总体积约lmL，加入④步洗涤完成的待转化的细胞中，27°C继续培养5h ;⑥移除质粒、转染试剂混合物，加入2mL含10% FBS的Grace’ s培养基，27°C孵育，直至病变现象产生；@5天后，lOOOrpm离心lOmin收集细胞培养液中的重组杆状病毒粒子，转移上清到冻干管中，贴上标签，置于4°C冰箱中避光保存。 5)重组杆状病毒粒子的扩增以及目的可溶性蛋白的表达:①取适当体积的重组杆状病毒粒子原液加入到汇聚度90%的新鲜传代的sf9细胞中，27°C恒温培养箱中，静置lh，每隔15min轻轻晃动一次；②去掉培养瓶中的培养液，加入新鲜的含10% FBS的Grace’ s培养基，27°C恒温培养箱中恒温培养?’③3天后，lOOOrpm离心lOmin收集细胞培养液中的病毒粒子，转移上清液到冻干管中，贴上标签，置于4°C冰箱中避光存放；④得到的重组病毒粒子重复上述①-③步骤，以获得更高滴度的病毒粒子；⑤加入高滴度的重组杆状病毒粒子到汇聚度达95%的新鲜传代的sf9细胞中，27°C恒温培养箱中，静置lh，每隔15min轻轻晃动一次；⑥去掉培养瓶中的培养液，加入新鲜的含10% FBS的Grace’s培养基，27°C恒温培养箱中恒温培养40-44h后，轻轻倒尽细胞上清培养液，加入预冷的细胞裂解液，冰上静置30min ;⑧收集细胞裂解液，加入等体积的2XSDS凝胶加样缓冲液上样缓冲液，混匀，100°C保持lOmin SDS-PAGE检测蛋白质的表达情况； 6)目的蛋白的回收:目的可溶性蛋白展示完成后，将上述步骤5)得到的重组杆状病毒粒子溶液于18000-22000rpm，4°C离心15分钟，收集沉淀，既得表面展示有目的可溶性蛋白的重组杆状病毒粒子，后用少量的纯水重悬重组杆状病毒粒子得重组杆状病毒粒子溶液，用终浓度为500-1000单位/L的凝血酶切割重组杆状病毒粒子表面的可溶性蛋白，使带有特定标签的目的可溶性蛋白与杆状病毒分离，然后用带有特定标签的分离柱对目的蛋白进行回收纯化，最后得到高纯度的目的蛋白。
【专利摘要】本发明公开了一种重组杆状病毒表面展示系统及回收可溶性蛋白的方法，所述展示系统除含有表达载体外，还包括特定基因片段，所述特定基因片段包括：GP64信号肽、缺失信号肽的目的可溶性蛋白cDNA、蛋白标签、酶切位点以及终止密码子；回收目的可溶性蛋白的方法包括：构建表达载体及转化大肠杆菌、表达载体验证、表达目的可溶性蛋白用重组杆状病毒粒子克隆的制备、昆虫细胞的转染和重组杆状病毒粒子的收集、重组杆状病毒粒子的扩增以及目的可溶性蛋白的表达和目的蛋白的回收。本发明得到蛋白的活性、产量等各个方面都有极大的改进和完善，提高了可溶性蛋白的回收效率，适用于大规模的工业应用。
【IPC分类】C07K1/14, C12P21/02, C12N15/866, C12N7/01, C12N5/10
【公开号】CN105368798
【申请号】CN201510957313
【发明人】沈鹤霄, 黄科, 刘瑾, 易汪雪, 马峰
【申请人】武汉金开瑞生物工程有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月17日