专利名称：：一个类受体蛋白激酶基因及其表达载体和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程领域，公开了ー个类受体蛋白激酶基因及其表达载体和应用。
背景技术：
：小麦白粉病是由小麦白粉病菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)引起的真菌性病害。小麦白粉病过去主要发生在冷凉、潮湿、多雨地区，近年来出现由南向北逐渐加重之势，给小麦生产带来了越来越严重的危害，在白粉病大发生的年份可使小麦严重减产。防治白粉病最经济有效的方法是使用抗病品种，但由于病原菌小种变化快，我国现有的部分品种已逐渐失去对白粉病的抗性。分离和鉴定新的抗白粉病基因，利用基因工程手段转入感病品种，开展小麦抗病分子育种，可以提高小麦的抗病性。近年来抗白粉病基因研究工作进展迅速，陆续有新基因被发现的报道。迄今己在小麦基因组的44个位点鉴定了60个主效的抗白粉病基因，并且大多数基因已经被定位到具体的染色体或者染色体特定区段上(McintoshR，YamazakiY，DubcovskyJ，eta丄しatalogueoigenesymbolsforwneat[A」·In:AppelsR,EastwoodR,LagudahE,etaleds.ProceedingsofIlthinternationalwheatgenetsymposium.[C].Sydney,Australia=SydneyUniversityPress,2008)小麦抗白粉病基因共有两类来源一类来源于普通小麦，包括Pmla、Pmle、Pm3、Pm5b_5e、Pm9、PmlO、Pml1、Pml4、Pml5、Pm23、Pm24、Pm28、Pm38和Pm39；第二类来源于小麦近缘种属，包括Pmlb、Pmlc,Pmld,Pm2,Pm4a、Pm4b、Pm5a、Pm6、Pm7、Pm8、Pml2>Pml3>Pml6、Pml7>Pml9、Pm20、Pm21、Pm25、Pm26、Pm27、Pm29、Pm30、Pm31、Pm32、Pm33、Pm34、Pm35、Pm36禾PPm37。来自四倍体提莫菲维小麦(Triticumtimopheevii,2n=4X=AAGG)2G染色体上的抗白粉病基因Pm6，在我国大部分地区仍表现为高效抗性，尤其是成株抗性強。以含有白粉病抗性基因Pm6的小麦材料做供体，与小麦品种Prins连续回交、自交，结合抗病性鉴定，培育出以“Prins”为背景的Pm6渐渗系IGVI465(纪剑辉，曹爱忠，王海燕，覃碧，王苏玲，孔芳，陈佩度，刘大钧，王秀娥。利用基于PCR的分子标记区分普通小麦-提莫菲维小麦渐渗系。遗传，2007，四(10)=1256-1262)ο本实验室前期利用IGVI465和!3rins为亲本，配制了遗传作图群体，利用该群体对Pm6进行了精細定位。在遗传作图的基础上，对Pm6所在区域与短柄草和水稻进行了比较基因组学研究，结果发现在Pm6所在区域小麦、水稻和短柄卓具有民好的共线性(BiQin,AizhongCaoetal.Collinearity-basedmarkerminingiorthelinemappingofPm6,apowderymildewresistancegeneinwheat.TheorApplGenet.2011，123:201-218.)。
发明内容本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种类受体蛋白激酶基因I^aLRR-RLK〗。本发明的另ー目的是提供该基因的表达载体。本发明的又一目的是提供该基因和表达载体的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现类受体蛋白激酶基因TaLRR_RLK2，来自普通小麦I^rins-提莫菲维渐渗系IGVI465，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。该类受体蛋白激酶基因编码的蛋白质TaLRR-RLK2，其氨基酸序列为SEQIDNO.2。含有所述的类受体蛋白激酶基因TaLRR_RLK2的表达载体。所述的含有权利要求1所述的类受体蛋白激酶基因TaLRR_RLK2的表达载体优选以pBI220为出发载体，将权利要求1所述的iTaLRR-RLI^基因插入pBI220的BamHI和KpnI酶切位点间所得。所述的类受体蛋白激酶基因TaLRR_RLK2在构建抗白粉病小麦品种中的应用。所述的含类受体蛋白激酶基因TaLRR_RLK2的表达载体在构建抗白粉病小麦品种中的应用。有益效果本发明首次从小麦种克隆得到了一个类受体蛋白激酶基因TaLRR_RLK2及其所编码的蛋白质TaLRR-RLK2，为小麦中首次报道。将其插入表达载体pBI220，得到的该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感白粉病小麦品种对白粉病的抗性。TaLRR-RLK2用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，能够获得具备白粉病抗性的小麦种质。图lpBI220:TaLRR_RLK2超量表达载体图谱图2与白粉菌互作的表达⑶S基因的表皮細胞a白粉菌侵入⑶S表达的表皮細胞后未形成吸器；d白粉菌侵入⑶S表达的表皮細胞后形成吸器CO分生孢子；pp侵入钉；ha吸器；hy菌丝图3利用瞬间表达研究Ta-LRR_RLK2基因对吸器形成的影响和抗白粉病效应具体实施例方式实施例1含有Pm6的小麦IGVI465中ー个受白粉菌诱导的类受体蛋白激酶基因的克隆本研究的前期已完成了对Pm6的精細定位。在精細定位的基础上，对Pm6所在区域与短柄草和水稻进行了比较基因组学研究，结果发现在Pm6所在区域小麦和水稻、短柄卓具有才民好的共线性(BiQin,AizhongCaoetal.Co丄丄inearity-basedmarkermimngiortnelinemappingofPm6,apowderymildewresistancegeneinwheat.TheorApplGenet.2011，123:201-218)。本研究在与Pm6所在区域具共线性的短柄草和水稻基因组序列中预测了一个富含亮氨酸的类受体蛋白激酶基因(LRR-RLK)，预测在小麦IGVI465的Pm6所在区域也存在一个与模式物种中的类受体蛋白激酶基因同源的基因，这个基因可能是Pm6基因的候选基因。根据水稻、短柄草的LRR-RLK基因，在外显子区域上设计引物RLK-FTTCACGCCAATTTGAAAACA(SEQIDNO.幻和RLK-R:CGATATTGCAGGCCCATAGT(SEQIDNO.4)。因IGVI465在四叶期开始对白粉菌具有抗病性，推测其抗病基因的表达在四叶期才开始表达，所以为了从IGVI465中分离到抗病基因，对四叶期的IGVI465进行了白粉菌诱导，即将感病材料上繁殖的白粉菌孢子直接从叶片上抖落到IGVI465的叶片上，并于白粉菌接种后M小时取叶片供RNA提取。以IGVI465在四叶期受白粉菌诱导的叶片所提取的RNA反转录的cDNA为模板，以RLK-F和RLK-R为引物，进行RT-PCR，获得了ー个3000bp左右的基因片段。该基因片段与水稻和短柄草的LRR-RLK同源，预测为小麦IGVI465中的LRR-RLK基因，命名为I^aLRR-RLK〗。进ー步根据TaLRR-RLK2的基因片段为模板，分别设计5’RACE和3’RACE引物，利用快速扩增cDNA末端技术(RACE)，从IGVI465中克隆TaLRR-RLK2的5，端和3，端序列，进而获得iTaLRR-RLK的全长序列。5，RACE程序如下5，RACEouterprimer序列为"CCAGAAGAGATGAATCTCAAGAAAG，，(SEQIDNO.5),5'RACEinnerprimer序列为‘‘CCTTTCTTATGTCAAAGTTCTGCTC”(SEQIDNO.6)。以四叶期受白粉菌诱导的IGVI465的cDNA为模板，用5，RACEouterprimer和接头外引物(CCAGAAGAGATGAATCTCAAGAAAG，SEQIDN0.13)进行第一轮PCR反应，取1μ1第一轮PCR产物作为第二轮PCR模板，用5’RACEinnerprimer和接头内引物(CCTTTCTTATGTCAAAGTTCTGCTC，SEQIDΝ0·14)进行第二轮PCR，第二轮PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收产物并克隆测序，分离到5’端片段。3，RACE程序如下3，RACEprimer序列为“ATATATATGTCCAGGGTGAGCGTAA”(SEQIDΝ0·7)，通用引物AP序列为“GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTT”(SEQIDΝ0·8)。以IGVI465的cDNA为模板，以3，RACEprimer和AP为引物进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收产物并克隆测序，分离到了3’端片段。分别根据上述5’和3’端片段设计全长扩增弓I物TaLRR-RLK2-F(TAGAGCACCAGGCAGATAGCCA,SEQIDNO.钔及iTaLRR-RLI^-R(ACTGCAMTCGTACGCGCGTCCAA，SEQIDN0.10)，以四叶期IGVI465受白粉菌诱导后的cDNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物回收并克隆，获得大小为3310bp的序列。序列分析显示该序列包含ー个0RF，其中5，-肌1(非翻译区)4仙？、3'-UTR221bp、ORF(开放阅读框)3045bp(SEQIDNO.1)，编码1014个氨基酸(SEQIDNO.2)。经SMART软件(http://smart,embl-heidelberg.de/)分析，该基因编码ー个跨膜蛋白，在N端具有M个氨基酸組成的信号肽，ー个由23个氨基酸組成的疏水跨膜域，胞内含有ー个由268个氨基酸組成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域(S/TPK)。水稻基因注释数据库GAAS(http/Vricegaas·dna.affrc.go.jp/)分析发现该基因在胞外有11个富含亮氨酸重复(LRR)，具有这种蛋白结构的基因为富亮氨酸重复的类受体蛋白激酶(LeucineRich-RepeatReceptor-LikeKinases,LRR-RLKs)，将该基因命名为TaLRR-RLK2。实施例2TaLRR_RLK2基因瞬间表达载体的构建以经白粉菌诱导的IGVI465中克隆的I~aLRR-RLK2基因cDNA为模板，使用引物对RLK-ATG-BamHI-F(CGGGATCCATGGGGCGGAGGAGGCA,SEQIDN0.11)和RLK-TGA_KpnI-R(GGGGTACCTCAACGGCCTTCGTCCA,SEQIDNO.12)进行PCR扩增，回收扩增片段。用BamHI和KpnI对扩增产物进行双酶切，将酶切产物插入到BamHI和KpnI双酶切后的载体pBI220((JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMW.LrJSfusions:beta_glucuronidaseasasensitiveanaversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.1987,6:3901-3907.))TaLRR-RLK2置于35S启动子后面的多克隆位点处。由此将目标基因TaLRR-RLK2克隆到强启动子35S的下游，获得表达载体pBI220:Ta-LRR-RLK2(图1)。经测序验证，表明载体构建成功。实施例3利用瞬间表达方法将TaLRR_RLK2基因转入小麦叶片瞬间表达方法是ー种可靠且快速鉴定基因功能的方法(ktiweizer，Pokornyetai.ATransientAssaysystemfortheFunctionalAssessmentofDeiense-RelateaGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999，12:647_654.)。*石if究利用瞬间表达方法，将质粒DNA包裹到金属微粒外层，借助基因枪将金属微粒和基因轰击到小麦叶片的表皮細胞，然后统计轰击TaLRR-RLK2細胞的白粉菌吸器指数与未轰击TaLRR-RLK2細胞的白粉菌吸器指数，明确目标基因是否具有白粉病抗病功能。载体DNA与金属微粒包裹的程序如下制备钨粉称取30mg的钨粉于1.5mleppendorf管中，加入Iml70%酒精，涡旋3-5min后静置15min，使钨粉完全沉淀。12000rpm离心Imin后弃上清。加入ImlddH20水，涡旋混勻后，离心弃上清(重复三次)。最后加入500μ150%甘油涡旋混勻，以备用。包裹子弹吸取5μ1涡旋均勻的钨粉于1.5ml的印pendorf管中，加入5μ1质粒DNA(总量应为lyg)。边涡旋边向印pendorf管内滴加50μ12.5ΜCaCl2，然后加入20μ10.IM亚精氨(现配先用)，涡旋;3min。静置Imin后离心2s，弃上清。加入140μ170%酒精，充分涡旋，离心ム，弃上清。然后加入140μ1100%酒精，充分涡旋，离心2s，弃上清。最后加入15μ1100%酒精，充分涡旋，以备使用。实施⑶S基因单转化时，将含有⑶S基因表达载体pAHC25(ChristensenAH，QuailPH.Ubiquitmpromoter-basedvectorsfornigh—levelexpressionοιselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996,5:213-218.)的质粒DNA与钨粉包裹；当实施TaLRR-RLK2与GUS基因共转化时，将含有TaLRR-RLK2基因表达载体pBI220:TaLRR-RLK2的质粒DNA与含有GUS基因表达载体PAHC25的质粒DNA按摩尔浓度11的比例混合，包裹钨粉。当⑶S基因与TaLRR-RLK2基因进行共转化时，Marker基因⑶S转入的细胞也是iTaLRR-RLI^转入的細胞。因⑶S基因表达的细胞经染色整个细胞呈现蓝色，所以本研究以蓝色細胞作为TaLRR-RLK2的表达細胞。基因枪轰击程序如下剪下长约6cm的小麦幼苗叶片端部，平行贴在载玻片上，每张玻片贴6片叶片左右。基因枪使用PDSIOOO/He系统，采用1350psi的可裂膜片，真空度为^inHg。轰击后将叶片置于垫有润湿滤纸的瓷盘内，罩以打有小孔的保鲜膜，保湿并透气，18-20°C恢复培养4h后，高密度接种白粉菌分生抱子。接种4后用GUS染液(配方为0.lmol/LN￡i2HP04z/NaH2zP04缓冲液(ρΗ7·0)，含10mmol/LEDTA，5mmol/L铁氰化钾和亚铁氰化钾，0.lmg/mlX-Gluc,0.1%TritonX_100，20%甲醇，)真空渗透10min，37°C染色12h,然后用70%酒精脱色2天直至叶片变成白色为止，最后利用浓度为0.6%的考马斯亮蓝对白粉菌孢子染色。实施例4TaLRR_RLK2抗病功能的分析白粉菌侵入小麦叶片表皮細胞后，在表皮細胞中产生的指状物称为吸器。吸器不能正常产生是叶片细胞对白粉菌具有抗性的重要指标。在⑶S表达的細胞中，吸器会被⑶S染色液染成蓝色，在显微镜下容易辨认(图幻。在GUS基因转化細胞后，通过统计与白粉菌互作的⑶S表达细胞中，吸器形成的細胞所占的比例(％)，即为“吸器指数”(khweizer，Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentoiDefense-RelatedGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999，12:647-654.)。吸器指数越小，表明抗病性越強。本研究利用“吸器指数”作为抗病強弱的衡mfefeo权利要求1.类受体蛋白激酶基因iTaLRR-RLI^,其特征在于核苷酸序列为SEQIDNO.1。2.权利要求1所述类受体蛋白激酶基因编码的蛋白质TaLRR-RLK2，其特征在于氨基酸序列为SEQIDNO.2。3.含有权利要求1所述的类受体蛋白激酶基因TaLRR-RLK2的表达载体。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的含有权利要求1所述的类受体蛋白激酶基因TaLRR-RLK2的表达载体是以PBI220为出发载体，将权利要求1所述的TaLRR-RLK2基因插入PBI220的BamHI和KpnI酶切位点间所得。5.权利要求1所述的类受体蛋白激酶基因TaLRR-RLK2在构建抗白粉病小麦品种中的应用。6.权利要求3或4所述的含类受体蛋白激酶基因TaLRR-RLK2的表达载体在构建抗白粉病小麦品种中的应用。全文摘要本发明属于基因工程领域，公开了一个类受体蛋白激酶基因及其表达载体和应用。类受体蛋白激酶基因TaLRR-RLK2的cDNA序列为SEQIDNO.1及其编码的氨基酸序列为SEQIDNO.2。该基因来自普通小麦Prins-提莫菲维渐渗系IGVI465，为在小麦中首次报道。通过瞬间表达将该基因转化感病小麦品种Prins，结果表明TaLRR-RLK2的过量表达可以降低Prins的吸器指数。因此，TaLRR-RLK2可望用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，有望提高小麦的白粉病抗性。文档编号C12N15/54GK102533812SQ20121001242公开日2012年7月4日申请日期2012年1月16日优先权日2012年1月16日发明者刘洋洋,曹爱忠,王海燕,王秀娥,肖进,覃碧,邢莉萍,陈婷婷申请人:南京农业大学