专利名称：一株h1n1亚型猪流感病毒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株HlNl亚型猪流感病毒及其应用。
背景技术：
猪流感(Swine influenza, SI)是由A型流感病毒引起的一种急性、传染性猪的呼吸道疾病，其通过不断抗原漂移或抗原转变实现进化，导致亚型众多，难以根除。目前猪流感病毒已有 HlNl、H1N2、H3N2、H1N7、H2N3、H3N1、H3N3、H3N6、H4N6、H5N1、H9N2 等 11 种血清亚型，其中在猪群中广泛流行的主要有古典猪H1N1、类禽H1N2和类人H3N2亚型。同时猪流感是一种免疫抑制性疾病，经常导致猪群并发或继发其他病毒或细菌的感染，使疫情更为复杂,死亡率增高,给畜牧业造成巨大的经济损失。猪体内同时具有唾液酸α-2，3半乳糖(SA α-2，3_Gal)和唾液酸α-2，6半乳糖 (SAa -2，6_Gal)，所以具有同时感染禽、马和人流感病毒的能力，被认为是导致新型流感毒株产生的重要中间宿主，被称为“基因混合器”，是造成流感大流行的重要潜在危险因素。 2009年3月起始于美国和墨西哥的HlNl亚型流感疫情，再次证实了猪流感在兽医和人类公共卫生学中的重要地位。研制安全有效的猪流感疫苗是控制猪流感疫情、减少人类流感隐患和保证畜牧业健康发展的重要保障，而选取合适的猪流感病毒株则为研制安全、有效的猪流感疫苗的首要条件。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一株HlNl亚型猪流感病毒及其应用。为实现上述发明目的，本发明首先提供一株HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/ Shanxi/D5/2011 (HlNl) (Swine influenza virus)，其保藏号为 CGMCC No. 5323。本发明还提供含有治疗有效量的A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)的疫苗。其中， 所述的A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)优选为灭活的病毒。在本发明优选的实施方案中，所述疫苗还可含有药学可接受的佐剂。其中，所述的佐剂可为本领域公知的任何适合制备疫苗的佐剂，优选为以下任何一类佐剂中的一种或几种I)无机佐剂如白油、铝佐剂、Montanide ISA 206 VG (简称206)佐齐[J、 Montanide ISA 70M VG (简称 70M)佐剂、Montanide ISA70essai Mi (i = 1-8)[简称 70Mi (i = 1-8)]佐剂等；2)表面活性剂佐剂如 MF59、ISCOM 、ISC0MA-TRIX 等；3)内源性及生物源性佐剂，如蜂胶、0DN, QS21、SAF、CAMPs、HgM-CSF、IL-12、IL-2、 大肠杆菌不耐热肠毒素、多糖类物质等。在本发明另一优选的实施方案中，本发明的疫苗可为油乳剂疫苗、铝胶疫苗、蜂胶疫苗。进一步，本发明还提供A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1)在制备治疗猪流感药物中的应用。本发明的HlNl亚型猪流感病毒无外源病原污染，在鸡胚和细胞上均具有较高的增殖能力，攻毒BALB/c小鼠和猪流感阴性仔猪后可观察到明显的临床症状，剖检病变典型，而且该HlNl亚型猪流感病毒免疫原性良好，以其制备的油乳剂灭活疫苗免疫猪后对同源病毒攻击的保护效率达100%，为一株良好的猪流感疫苗候选毒株。本发明的病毒株分尚自疑似流感病猪的肺病料，证实分尚出的病毒具有血凝活性，RT-PCR证实具有流感HA基因片段，与Hl亚型猪流感病毒单因子阳性血清的HI试验为阳性，初步鉴定为Hl亚型，且电镜观察具有流感病毒粒子形态特征。将该病毒株命名为流感病毒4/5 丨1^/51^1 丨/1)5/201101謂1)，并于2011年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院，中国科学院微生物研究所)，简称CGMCC，保藏登记号为CGMCC No. 5323。
图I 为 HlNl 亚型猪流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1)电镜照片。图2为正常的MDCK细胞电镜照片。图3 为接种 HlNl 亚型猪流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011(HlNl)48h 后的 MDCK 细胞电镜照片。图4为正常小鼠肺脏照片。图5为攻击HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (H1N1)6天后小鼠肺脏照片。图6为正常猪肺脏照片。图7为攻击HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl) 3天后猪肺脏照片。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例I HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1)的分离鉴定(I)HlNl 亚型猪流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)的分离从山西某猪场采集疑似猪流感病猪的肺病料剪碎，按Ig 5ml加入含青霉素 (1000U/ml)、链霉素(1000 μ g/ml)的灭菌生理盐水，组织研磨器研磨后反复冻融3次，经 4000r/min离心IOmin,取上清液,一次性过滤器过滤后经尿囊腔接种9 11日龄SPF鸡胚, O. 2ml/胚，35°C恒温箱孵育，弃去接种24h内死亡的鸡胚，接种72h后收获存活鸡胚的尿囊液。(2)血凝活性检测按照常规方法对收获的鸡胚尿囊液进行血凝活性检测，取96孔血凝板，第一排加入待检病毒原液100 μ I，后面每孔加入50 μ I I X PBS,吸取50 μ I病毒原液2倍倍比稀释至11孔，最后一孔留作对照，加入I %鸡红细胞悬液，混勾后直室温感作30min，结果证实所分尚的病毒具有血凝活性。(3) RT-PCR 鉴定提取该病毒RNA，以流感病毒的随机引物反转录成cDNA，应用猪流感病毒的HA基因引物进行PCR扩增，可得到符合预期大小的片段，经测序证实为流感HA基因片段。(4)外源病毒检测提取病毒的RNA和基因组DNA，RNA应用随机引物反转录成cDNA，以病毒的cDNA 和基因组DNA为模板，通过PCR或RT-PCR方法进行禽源和猪源外源病毒的检测，所检禽源病毒包括H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒 (IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、J亚型白血病病毒(内源ALV-J)、J亚型白血病病毒 (外源ALV-J)、禽网状内皮增值病病毒(REV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、禽呼肠孤病毒(REO)、 传染性喉气管炎病毒(ILT)、马立克病毒(MDV)、禽腺病毒(AAV)、禽痘病毒(FPV);所检猪源病毒包括猪瘟病毒(CSFV)、蓝耳病毒(PRRS)、伪狂犬病毒(PRV)、猪支原体(Mhp)。检测所用引物均参考相关文献合成。结果表明所分病毒无禽源和猪源外源病毒污染。(5)血凝抑制实验分别应用抗新城疫病毒(NDV)和减蛋综合症(EDS276)的阳性血清对所分离的病毒进行常规微量法HI试验，结果病毒与抗NDV和EDS276阳性血清的HI均为阴性，然后以抗Hl亚型猪流感病毒单因子阳性血清、抗H3亚型猪流感病毒单因子阳性血清、抗H5亚型猪流感病毒单因子阳性血清、抗H7亚型猪流感病毒单因子阳性血清、抗H9亚型猪流感病毒单因子阳性血清对所分离的病毒进行微量平板法凝集抑制试验。结果所分病毒与抗H3、H5、 H7、H9亚型猪流感病毒单因子阳性血清的HI试验均为阴性，但与Hl亚型猪流感病毒单因子阳性血清的HI试验为阳性。(6)亚型鉴定经HI试验初步确定所分病毒为Hl亚型，再通过RT-PCR方法以猪流感型特异性 PCR鉴定引物进一步鉴定所分病毒为HlNl亚型。HlNl亚型特异性PCR鉴定引物均参考相关文献合成，引物序列如下Hl-F AGCAAAAGCAGGGGAAAATAA ；Hl-R TGCATTCTGGTAGAGACTTTG ；Nl-F TTGCTTGGTCRGCAAGTGC ；Nl-R YCWGTCCAYCCATTWGGATCC (7)电镜观察将收获病毒的鸡胚尿囊液超速离心，沉淀用灭菌TNE重悬，重悬病毒液经过磷钨酸负染后进行电镜观察。结果如图I所示，电镜下SIV病毒粒子呈圆形、椭圆形，少数呈不规则的形状，可见病毒囊膜和纤突，直径约为60 120nm，具有流感病毒粒子形态特征。经鉴定，分离到的病毒株为HlNl亚型猪流感病毒的新病毒株，命名为A/Swine/ Shanxi/D5/2011(H1N1)，并于2011年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No. 5323。实施例2 HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/201 UHlNl全基因组序列测定及进化村绘制(1)8个基因片段的RT-PCR扩增参考已发表的HlNl亚型猪流感的相关资料，设计合成流感病毒8个基因HA、NA、 NP、PB1、PB2、PA、M、NS的RT-PCR引物，引物序列参见表I。提取病毒的RNA并应用随机引物反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增8个基因片段，其中PB2、PB1、PA3个长片段采用分段扩增，得到分段扩增的两端产物后再采用重叠PCR法扩增全长。其余5个片段HA、NA、NP、 M和NS—次性扩增全长。表I猪流感病毒8个基因片段的引物序列
引物名称引物序列PCR扩增的目的基因片段HA-FTATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGHAHA-RATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTNA-FTATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTNANA-RATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTNP-F NP-1565RTATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTA ATATCGTCTGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTTNPPB2 -IF PB2 -1205RTAGGAGCGAAAGCAGGTC TCYTCYTGTGARAAYACCATPB2- IPB2-1105F PB2 -2341RTAYGARGARTTCACAATGGT GGAGTAGAAACAAGGTCGTTTPB2-IIPBl-IF PBl -1262RATTTAGCGAAAGCAGGCA TTRAACATGCCCATCATCATPBl- IPBl -1142F PBl -2341RARATACCNGCAGARATGCT TGGAGTAGAAACAAGGCATTTPBl-IIPA-IF PA-1498RGGGAGCGAAAGCAGGTAC TNGTYCTRCAYTTGCTTATCATPA- IPA-747F PA-2233RCATTGAGGGCAAGCTTTC CCGGAGTAGAAACAAGGTACTTPA- IINS-IFTATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTGNSNS-890RATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTM-IFTATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAGMM-1027RATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT(2) PCR产物的回收纯化RT-PCR产物用I %的琼脂糖凝胶进行电泳,按Gel Extraction kit的说明书回收和核酸纯化。(3)基因的克隆和PCR鉴定纯化后的HA、NA、NP、PBl、PB2、PA、NS、M 基因的 RT-PCR 产物与 PMD-18T 载体连接并转化T0P-10感受态细胞。蓝白斑筛选，挑取培养基上的白色菌落，37°c摇床中培养过夜， 应用载体克隆位点两端的T7和pol I序列作为引物，对菌液进行PCR鉴定。(4)全基因组序列的测定及进化树分析每个片段取三个经PCR鉴定为阳性的克隆菌进行测序，得HA、NA、NP、PBU PB2、 PA,NS,M基因的序列分别依次如SEQ No. I 8所示。应用DNAstar中的MegAlign软件进行核酸同源性比较和进化树的绘制，证实NP基因与A/Ann Arbor/6/1960 (H2N2)核苷酸同源性为99. 8%，其余7个基因均与A/Puerto Rico/8/1934(HlNl)高度同源HA全基因序列99. 8%同源、NA全基因序列99. 6%同源、PBl全基因序列99. 7%同源、PB2全基因序列 99. 6%同源、PA全基因序列99. 7%同源、NS全基因序列99. 7%同源、M全基因序列99. 8% 同源。实施例3 HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)的生物学特性测I. HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)在鸡胚上连续传代及 EID50的测定(I)鸡胚上连续传代将Fl 代 HlNl 亚型猪流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)以 IXPBS 进行 1(Γ3稀释，接种9 11日龄的SPF鸡胚，O. 2ml/胚，于孵化器中35°C条件下孵育72h，收取鸡胚尿囊液进行血凝检测。按此方法，病毒在鸡胚上连传12代，血凝价稳定，可达29，每代收取的尿囊液均保存于_80°C备用。⑵EID5tl的测定将F13 代 HlNl 亚型猪流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1)以 IXPBS 进行 10倍倍比稀释，将10_5 10,各稀释度分别接种9 11日龄的SPF鸡胚，每个稀释度4 枚，O. Iml/胚，于孵化器中35°C条件下孵育48h后，收取鸡胚尿囊液进行血凝检测。按照 Reed-Muench 方法计算 HlNl 亚型猪流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)的 EID5tl 为 1(T8.45EID50Ail。2. HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)在MDCK细胞中增殖试验及TCID5tl的测定(I)在MDCK细胞中增殖试验500 μ I F13 代 HlNl 亚型猪流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)用 Hank，s 缓冲液稀释至5ml，接种于长满MDCK细胞的75cm2细胞培养瓶中，置于CO2培养箱中，37°C条件下吸附作用I. 5h后，弃去培养瓶中的病毒液，用Hank’s缓冲液洗I次，加入IOml不含血清的DMEM培养基(其中TPCK-trypsin的终浓度为5 μ g/ml)，另设未接病毒的MDCK对照。 接毒24h后每间隔6h收细胞培养上清O. 2ml，5000g，离心2min，_20°C冰箱中保存。待接毒后72h将冻存的上清样品融化，以血凝试验检测各时间段细胞培养上清的血凝价。结果在接毒48h后可见MDCK细胞皱缩聚集成团块状，并出现大量崩解(图2、图3)，接毒MDCK细胞60h时血凝价最高可达到27。(2)组织半数感染量测定(TCID5tl)血凝价为29 的 F13 代 HlNl 亚型猪流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)用 Hank’ s缓冲液进行10倍倍比稀释，将KT1 10,各稀释度分别接种于长满MDCK细胞的 96孔细胞培养板中，每个稀释度接种8孔，100 μ I/孔，接毒后观察细胞病变，接毒后72h测定细胞培养液的血凝活性，根据Reed-Muench方法计算病毒的TCID5tl为105_78TCID5(l/ml。实施例4 HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)的动物试验(I)HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)对小鼠的致病性试验F13 代 HlNl 亚型猪流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1)以 IXPBS 稀释至 106EID50/ml,24只6 8周龄的雌性BALB/c小鼠，随机分组，用于监测病毒对小鼠体重变化的影响和病毒在小鼠脏器中的分布情况，其中16只经鼻腔途径分别接种100μ I已稀释好的病毒，8只接种生理盐水作为对照。每日观察小鼠的精神状态，称量小鼠的体重；同时每隔Id剖杀两只攻毒组的小鼠及一只对照组的小鼠，观察病变，采集小鼠的心、肝、脾、肺、 肾、脑、肠、血。对所采病料进行RT-PCR检测。结果接种病毒一天后，攻毒组小鼠即开始食欲不振，精神萎靡，毛松乱，聚堆，呼吸急促甚至困难，有时可听到咳嗽声，体重减轻；而对照组小鼠精神正常，体重一直持续增长。剖检攻毒组小鼠肺部病变较明显，其它脏器没有明显病变，RT-PCR检测(采用NS基因的通用引物，NS-F AGAAACAAGGGTGTTTTTTA, NS-R AGCAAAAGCAGGGTGACAAA)，可在心、肺、肾检测到HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/ D5/2011 (HlNl);对照组小鼠剖检未见异常，RT-PCR未检测到病毒(图4、图5)。(2) HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)对猪的致病性试验选用5 6周龄的猪流感阴性仔猪12头，随机分组，攻毒组一 4只，攻毒剂量为 IO8 ciEID5tl/头，采用气管内接种和鼻腔内接种两种途径攻毒，气管内接种IOml病毒，鼻内接种2ml病毒；攻毒组二 4只，攻毒剂量为IOiqEID5q/头，气管内接种IOml病毒，鼻内接种2ml 病毒；对照组4只，气管内接种IOml空白尿囊液,鼻内接种2ml空白尿囊液；观察临床症状，分别在1、3、5、7天剖杀攻毒组一、攻毒组二和对照组猪各一头，结果，攻毒后I天攻毒组一和攻毒组二的猪扎堆、被毛凌乱、精神沉郁、食欲不振、呼吸急促、体温升高可达40. 5°C， 剖检可见感染猪的肺部均有程度不一的病理变化，病变区域为深紫色，呈斑块状或点状；攻毒后3天，攻毒组一和攻毒组二的猪均精神沉郁，食欲不振，鼻腔眼睛出现分泌物，呼吸困难，现咳嗽和气喘，运动时咳嗽和气喘加重。攻毒组二猪可见腹式呼吸，根据Halbu PG等 (1995)报道的肺病变打分标准采用直尺测量每个肺表面积和病变部位的总表面积，以病变部位的总表面积占肺表面积的百分比进行打分，所有猪肺部病变都在5分以上，同时可见肺门淋巴结肿大(图6、图7)。攻毒后5天，攻毒组的临床症状逐渐缓解，至第七天基本消失，个别猪在第5天和第7天剖检可见肺部轻微病变。采集的攻毒组猪所有鼻拭子和肺脏组织中均分离到HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)。实施例5 HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)疫苗的免疫原性和效力检查F13 代 HlNl 亚型猪流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1) (EID5tl 为 KT8 45EID5ci/ ml，HA为29)的病毒尿囊液经无菌检验合格后进行病毒浓缩，浓缩后的病毒加入O. 1%甲醛，37°C灭活20小时，期间阵摇数次，经无菌检验合格后加入4%吐温-80充分混匀作为水相；另外取注射用白油93份，司盘-805份，混合后，加硬脂酸铝2份，随加随搅拌至透明为止，121°C高压灭菌20分钟，作为油相；以水相与油相体积比为I : 2进行乳化制备HlNl 亚型猪流感病毒A/SWine/Shanxi/D5/2011 (HlNl)株的油乳剂灭活疫苗。选用4周龄的猪流感阴性仔猪34头，随机分组，第一组8头，注射疫苗，4头用于监测疫苗的安全性，4头用于监测HI抗体水平。第二组8头注射疫苗，作为免疫攻毒组；第三组8头注射PBS，作为非免疫攻毒对照；第四组4头，注射PBS，作为非免疫非攻毒的完全对照。首免后4周进行二免，疫苗接种均采用颈部肌肉接种，接种剂量均为2ml/头。在二免后两周，对第二组和第三组猪进行HlNl亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl) 攻毒，攻毒剂量为IO8 tlEID5t/头。实验分组具体见表2。表2动物实验分组情况
权利要求
1.一株 HlNl 亚型猪流感病毒 A/Swine/Shanxi/D5/2011 (HlNl) (Swine influenza virus)，其保藏号为 CGMCC No. 5323。
2.含有治疗有效量的权利要求I所述病毒的疫苗。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述病毒为灭活病毒。
4.根据权利要求2或3所述的疫苗，其特征在于，还含有药学可接受的佐剂。
5.根据权利要求2或3所述的疫苗，其特征在于，其为油乳剂疫苗、铝胶疫苗或蜂胶疫苗。
6.权利要求I所述的病毒在制备治疗猪流感药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Shanxi/D5/2011(H1N1)，其保藏号为CGMCC No.5323。本发明还提供含有所述病毒的疫苗。本发明的H1N1亚型猪流感病毒无外源病原污染，在鸡胚和细胞上均具有较高的增殖能力，攻毒BALB/c小鼠和猪流感阴性仔猪后可观察到明显的临床症状，剖检病变典型，而且该H1N1亚型猪流感病毒免疫原性良好，由其制备的油乳剂灭活疫苗免疫猪后对同源病毒攻击的保护效率达100％，为一株良好的猪流感疫苗候选毒株。
文档编号C12R1/93GK102586196SQ201210011848
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月16日 优先权日2012年1月16日
发明者吕超超, 孟珊珊, 杜金玲, 王丹娜, 王吉玮, 石磊, 赵亚荣 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 福州大北农生物技术有限公司