200iil，共9组，每组10个复孔。连续培 养9d，每3d换液。每天各取10孔，每孔分别加入MTT溶液（5g/L) 20iil，37°C继续孵育4h， 终止培养，吸去上清液。每孔加入150PiDMSO,吹打混匀。选择490nm波长，在酶联免疫检 测仪上测定各孔光吸收值，求均值。以时间为横轴，光吸收值为纵轴，绘制细胞生长曲线。
[0089] 1. 2. 2细胞来源及间充质干细胞表面标志鉴定
[0090] 取生长状态良好的克隆化培养的细胞制作细胞爬片。采用免疫荧光方法鉴定波形 丝蛋白、角蛋白和间充质干细胞标志STR0-1的表达。
[0091] 2.牙周膜干细胞的成骨诱导
[0092] 2.1碱性磷酸酶活性检测分别将利用矿化液（含10mm〇l/l 甘油磷酸钠、 50iig/ml维生素C、1X10_8mol/L地塞米松和10 %小牛血清的L-DMB1培养液）诱导和未诱 导的克隆化培养的细胞以5X104/ml的细胞浓度，加入96孔板，每孔100iil，各接种24孔， 每3天换液一次。于接种后3d和7d，按照碱性磷酸酶组化试剂盒说明操作，选择510nm波 长，酶联免疫检测仪分别测定12孔诱导组和未诱导组细胞的光吸收值，检测细胞的碱性磷 酸酶活性。
[0093] 2. 2骨钙素、1型胶原免疫细胞化学染色取生长状态良好的克隆化培养的细胞制 备细胞爬片，以2X104/ml的密度接种于置有盖玻片的6孔板中，用10%小牛血清的DMEM 培养24h，待细胞伸展至60%汇合后，换矿化诱导液（含lOmmol/1 3 -甘油磷酸钠、50yg/ 1111维生素(：、1\10^11〇1/1地塞米松、10%小牛血清的1-01^]\1培养液）连续培养。培养21(1 时取部分细胞爬片，行骨钙素、1型胶原免疫细胞化学染色。
[0094] 2. 3矿化结节染色取生长状态良好的克隆化培养的细胞接种后，用矿化液连续培 养至28d，经4%多聚甲醛固定30min，行茜素红染色，观察矿化结节形成情况。
[0095] 3.牙周膜干细胞的成脂诱导
[0096] 取生长状态良好的克隆化培养的细胞制备细胞爬片，以2X104/ml的密度接种于 置有盖玻片的6孔板中，用10%小牛血清的DMEM培养液培养24h，待细胞伸展至60%汇合 后，换成脂诱导液（含lXl(T6mol/L地塞米松，10mg/L胰岛素，0. 5mmol/L异丁基黄噪呤， 0.2_〇1/1吲哚美辛，10%小牛血清1-01^11的培养液），观察细胞形态变化，油红0染色。
[0097] 4?实验结果
[0098] 本实验采用组织块法和酶解组织块法进行兔牙周膜细胞的原代培养，并采用有 限稀释法进行兔牙周膜细胞克隆筛选，获得单细胞克隆来源的细胞（图1)，克隆形成率为 0. 52%;细胞生长曲线结果显示，克隆化培养的牙周膜细胞和未克隆化培养的牙周膜细胞 生长曲线（图2)，均呈倒"S"形，在培养的第2天细胞生长速度加快，第7天各自的生长速 度减慢，总体来说克隆化培养的牙周膜细胞生长慢于未克隆化培养的牙周膜细胞；细胞免 疫荧光鉴定波形丝蛋白表达阳性，角蛋白表达阴性，间充质干细胞表面标志STR0-1表达阳 性（图3);并向成骨、脂肪细胞诱导分化，初步研究了牙周膜细胞的分化潜能，成骨诱导后， ALP活性增高（图4)，ALP染色阳性，体外可形成矿化结节，茜素红染色阳性，免疫细胞化学 染色结果显示0C和COLI均呈阳性表达（图5);成脂诱导后，油红0染色阳性（图6)。本 实验结果表明牙周膜细胞具有间充质干细胞表型和多向分化潜能，可作为牙周组织工程的 种子细胞。
[0099] 实施例2慢病毒载体介导hOPG基因转染牙周膜干细胞
[0100] 1.PCR扩增人骨保护基因
[0101] 登陆Genbank查询人骨保护素基因（GenbankNo.NM_002546)的mRNA序列。根据 文献报道设计人骨保护素基因cDNA的特异引物序列，由美国Invitrogen公司进行全基因 合成hOPG基因的编码序列区域。
[0102] 2.C端融合IRES-EGFP的中间载体的构建
[0103] (1)根据所需融合表达的基因序列设计并合成4条引物，引物序列如下所示：
[0104]SF-F1：
[0105] 5' -AAATAGATCTGCCACCATGAACAACTTGCT-3'（SEQNO1);
[0106]SF-R1：
[0107] 5' -ATACGTCGACAGCTGGGTCTTATAAGCAGC-3'（SEQNO2);
[0108]SF-F：
[0109] 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCGCCACCATGAACAACTTGCTGTGCTGCG-3' （ SEQNO3)；
[0110] SF-R2 ：
[0111] 5' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCACTTGTACAGCTCATCCATGCCG-3'（SEQNO 4)；
[0112] (2)将hOPG基因的编码序列区域克隆连接到T载体上；
[0113] (3)使用引物SF-FUSF-R1扩增含有Bgll和BamHI酶切位点的hOPG基因编码序 列片段，PCR反应体系如表1所示，反应条件如表2所示：
[0114]表1PCR反应体系
[0115]
[0116]
【主权项】
1. 一种制备含有人类骨保护素基因重组慢病毒载体的方法，其特征在于，所述方法包 括如下步骤： (1) 合成人类骨保护素基因的编码序列区域； (2) 将人类骨保护素基因的编码序列区域克隆连接到T载体上； (3) 使用第一引物从连接骨保护素的T载体扩增两端含有酶切位点的人类骨保护素基 因的编码序列片段； (4) 将步骤（3)得到的基因片段连接到pIRES-EGFP载体上，获得OPG-IRES-EGFP载体； (5) 将步骤（4)制备的OPG-IRES-EGFP重组载体转化大肠杆菌，筛选阳性克隆； (6) 使用第二引物从阳性克隆扩增出OPG-IRES-EGFP序列，亚克隆到载体pcDNA6. 2w 上； (7) 将步骤（6)制备的重组载体上的所述OPG-IRES-EGFP序列经BP重组反应到入门载 体上，再经LR重组反应到pLenti6. 3/V5载体上，得到pLenti6. 3-hOPG-IRES-EGFP重组载 体。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)中所述第一引物序列为SEQ NO. 1和SEQ NO. 2所示的核苷酸序列。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)中所述酶切位点是BglI和 BamHI位点。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（6)中所述第二引物序列为：SEQ NO. 3和SEQ NO. 4所示的核苷酸序列。
5. -种含骨保护素基因的重组慢病毒载体，其特征在于，是根据权利要求1至4中任一 项所述的方法制备的。
6. 权利要求5所述的重组慢病毒载体在制备含有人类骨保护素基因的重组慢病毒中 的用途。
7. 权利要求5所述的重组慢病毒载体在制备过表达人类骨保护素基因的牙周膜干细 胞中的用途。
8. 权利要求5所述的重组慢病毒载体在制备含有骨保护素基因修饰的组织工程化骨 中的用途。
9. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述组织工程化骨是通过将所述含有人 类骨保护素基因的牙周膜干细胞同β-磷酸三钙支架材料体外复合，获得所述含有骨保护 素基因修饰的组织工程化骨。
10. 根据权利要求9所述的用途，其特征在于，制备所述组织工程化骨的方法包括以下 步骤： (1) 磷酸三钙支架材料的制备； (2) 将pLenti6. 3-hOPG-IRES-EGFP转染后的牙周膜干细胞与磷酸三钙支架材料的体 外复合。
【专利摘要】本发明公开了含有人类骨保护素基因的重组慢病毒载体及其制备方法和应用，制备方法如下：将人类骨保护素基因编码序列区域克隆连接到T载体上；扩增两端含有酶切位点的人类骨保护素基因的编码序列片段连接到pIRES-EGFP载体上，获得OPG-IRES-EGFP载体；扩增出OPG-IRES-EGFP序列，亚克隆到载体pcDNA6.2w上；将pcDNA6.2w上的OPG-IRES-EGFP序列经BP重组到入门载体上，再经LR重组到pLenti6.3/V5载体上，得到Lenti6.3-hOPG-IRES-EGFP。该载体能够实现转染基因在体内持续、稳定的表达，并能用于极难转染的干细胞和原代细胞。
【IPC分类】C12N7-01, C12N15-867, A61L27-38, A61L27-54, C12N15-66, A61L27-12, C12N5-10
【公开号】CN104651386
【申请号】CN201410331750
【发明人】苏方, 刘洪臣
【申请人】中国人民解放军总医院, 中国人民解放军第306医院
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2014年7月11日...