一种重组毕赤酵母工程菌及其生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种重组毕赤酵母工程菌及其生产方法。【背景技术】
[0002] 半纤维素是仅次于纤维素含量的第二丰富的可利用自然资源。木聚糖是植物性 材料细胞壁中半纤维素的重要组成成分，是存在于木质素和纤维素的下面，并紧密地与 木质素和纤维素结合在一起。木聚糖是一类多聚五碳糖，主要由多个相同或不同种类的 五碳糖通过1，4-0 -D-木糖苷键连接起来，是饲料中的主要抗营养因子之一。木聚糖酶 (xylanase)是一类糖苷水解酶，能够催化木聚糖分子内1，4-|3-D-木糖苷键的内切水解， 其主要水解产物是木二糖和木二糖以上的低聚木糖，还有少量木糖和阿拉伯糖，这一作用 既降低木聚糖的抗营养作用，又将其转化为营养性物质。
[0003]大量研宄表明，木聚糖酶能提高各种类型饲料的利用率，降低胃肠道食糜的粘性， 增进畜禽健康，其在饲料资源开发和提高廉价副产品的利用率方面，具有广阔的前景。此外 木聚糖酶在纸浆工业中，被用作纸浆生物漂白；木聚糖的水解产物（木糖和低聚木糖）可应 用在食品行业、比如作为增稠剂、脂肪替代物或抗冷冻食品添加剂；在制药工业中木聚糖与 其他物质结合使用，可迟缓药物成分的释放；还可应用于酿酒工业和能源转化方面。可见木 聚糖酶具有巨大的应用价值和研宄前景。
[0004]国外对木聚糖酶的研宄工作开展较早，并且早已进入工业化生产阶段，而我国研 宄较晚，目前还没有能够用于规模化生产木聚糖酶的菌株。木聚糖酶主要通过微生物发酵 产生，包括细菌、放线菌、真菌以及某些酵母等，丝状真菌引起人们的特别注意。这主要是因 为，丝状真菌能够将产生的木聚糖酶分泌到培养基中，并且木聚糖酶的产生量较其他真菌 和细菌更高。
[0005]虽然木聚糖酶的应用领域十分广泛，但由于天然菌株中木聚糖酶产量较低、生产 成本昂贵、分离的聚糖酶活性不高、产酶效率不好，酶学性质没有达到工业应用要求，这些 都制约着木聚糖酶的应用和发展。随着现代分子生物学技术的发展，通过基因工程技术，构 建具有潜在应用价值的高效木聚糖酶基因工程菌株，进行密码子优化，提高木聚糖酶的表 达水平，以期在工业生产中推广应用。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种稳定的、可以大量分泌木聚糖酶的重组毕赤 酵母工程菌及其生产方法。
[0007]-种密码子优化的里氏木霉菌木聚糖酶的基因，所述基因的核苷酸序列如序列表 中SEQIDNO:l所示。
[0008]一种重组毕赤酵母工程菌，其包括本发明所述的基因序列。
[0009]本发明所述重组毕赤酵母工程菌在动物营养与饲料工业领域中的应用，所述重组 毕赤酵母工程菌能大量分泌木聚糖酶，反应温度范围为40-60°C，pH值范围为4-8。
[0010] 一种重组毕赤酵母工程菌的生产方法，包括如下步骤：
[0011] (1)根据毕赤酵母偏爱密码子，将里氏木霉木聚糖酶基因进行同义突变，全部突变 为毕赤酵母偏爱密码子，突变后的基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO: 1所示；
[0012] ⑵利用全基因合成技术合成优化后的木聚糖酶基因，与PMD20-T载体相联，构建 克隆载体pMD20T_Xynopti ;
[0013] (3)重组表达载体构建：将回收得到的角蛋白酶基因片段经EcoRI和KpnI双酶 切后，与经同样限制酶酶切的质粒pPICZaA相连，构建表达载体pPICZaA-Xynopti;
[0014] (4)毕赤酵母宿主的转化：重组表达质粒pPICZaA-Xynopti经电转化野生型毕赤 酵母X-33后，并筛选出阳性转化子进行诱导表达；
[0015] (5)阳性转化子诱导培养：从平板上挑取单酵母转接于BMGY培养基中培养16-18h 后转入BMMY培养基中进行诱导表达，培养物经离心后分析得到含重木聚糖酶的上清，利用 SDS-PAGE对其进行检测；
[0016] (6)采用重组毕赤酵母工程菌小规模发酵生产木聚糖酶。
[0017] 本发明所述的重组毕赤酵母工程菌的生产方法，其中步骤（6)中采用重组毕赤酵 母工程菌小规模发酵生产木聚糖酶的方法在30L液体发酵系统中进行，过程分为三阶段进 行：
[0018] 第一阶段：接种步骤（5)中的阳性转化子单菌落至装有25mLYH)培养基的250mL 摇瓶中，250r/min，29°C振荡培养18h，作为一级种子发酵液；
[0019] 第二阶段：取所述一级种子发酵液20ml接种于装有400mLYH)培养基的2L摇瓶 中，250r/min，29°C振荡培养18h，作为二级种子发酵液；
[0020] 第三阶段：
[0021] 以2%的接种量接种到装有17L甘油-BSM培养基中的30L发酵罐中，320r/min， 29°C的条件下培养，全程用28 %氨水进行pH值的调节，保持在5. 3 ;所述甘油-BSM培养基 包括如下质量百分比的成分：甘油;硫酸铵：4% ;K2P04:0. 5% ;CaS04 ? 2H20 :0. 1% ; K2S04:1. 6% ;MgS04 ? 7H20 :1. 5% ;K0H :0? 15% ;PTM1 :0? 43% ;0? 02%生物素：0? 6%;消泡 剂：0. 1% ;增效剂：0. 1% ;上述成分均溶于水中形成所述甘油-BSM培养基；
[0022] 培养24h后，进行补料，补料体积为3. 4L，直至补料结束，补料配方为50 %甘油； 1. 5%PTM1;甘油和PTM1溶于水中形成所述补料；
[0023] 待碳源耗尽，即DO值迅速上升时，饥饿lh后开始诱导，诱导过程中使用的诱导剂 配方为100%甲醇，其中还有质量百分比为1.5%的PTM1和1%的0.02%生物素。
[0024] 本发明所述的重组毕赤酵母工程菌的生产方法，步骤（4)中所述电转化野生型毕 赤酵母X-33具体包括如下步骤：
[0025]A)将10~20yg的线性化重组质粒与80yL上述细胞悬液混合均匀，转至预冷的 2mm直径电转化杯中，冰浴5min;
[0026]B)设置参数25yF、电压为1500V电击转化；
[0027] C)电击结束后，迅速加入lml预冷的lmol/L山梨醇，将菌体混勾后转至1. 5mL的 EP管中，于30°C培养箱放置1~2h;
[0028]D)取200~300yL转化后的菌液涂布于YPD+Zeocin平板上，30°C培养2~3天， 直至单菌落出现。
[0029] 本发明所述的重组毕赤酵母工程菌的生产方法，步骤（4)中筛选阳性转化子的方 法具体包括如下步骤：重组毕赤酵母阳性转化子的筛选采用挑取YPD+Zeocin平板上的单 菌落进行菌落PCR法；快慢斑筛选在MD/MM平板上进行；为进一步确定所选菌落为阳性转 化子，将其在摇瓶中诱导表达，通过SDS-PAGE及酶活分析检测表达产物。
[0030] 本发明所述的重组毕赤酵母工程菌的生产方法，步骤（5)中所述阳性转化子诱导 培养具体包括如下步骤：
[0031] a)挑取阳性转化子接种于含有50mL液体BMGY培养基的250mL三角瓶中，30°C， 220r/min，培养 24h;
[0032] b) 4000rpm离心lOmin，收集菌体，用含有50mL液体BMMY培养基重悬菌体于250mL 三角瓶中，28°C，220r/min，在培养的过程中，每隔24h补加一次甲醇，至终浓度为1% (V/ V)；
[0033] c)在加甲醇诱导的同时，每隔24h取lmL培养基至离心管中，4°C4000rpm离心 lOmin，吸取上清至干净的离心管中，用于分析表达水平及诱导后收集细胞的最佳时间。所 有上清或细胞沉淀贮存于-80 °C。
[0034] 本发明重组毕赤酵母工程菌的生产方法与现有技术不同之处在于：
[0035] 毕赤酵母异源表达系统是80年代初被开发和研制的一种的新型表达系统。该系 统与原核表达、酿酒酵母表达及哺乳动物细胞表达系统比较，有许多优点：①培养成本低。 可以在廉价的培养基中生长，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单；②外源表达水平高。 外源基因表达产物既可以在胞内积聚又可以被分泌到培养基中，而分泌的外源蛋白的分泌 量大，利于工业生产和分离纯化；③含有强有力的启动子。表达载体含有特有的乙醇氧化酶 (A0X)基因启动子。④遗传稳定性好。构建的菌株结构稳定，表达载体能直接将外源基因整 合至酵母染色体，不易退化；⑤分泌表达。本发明中采用了目前最为强大的分泌型表达载体 系统之，pPICZaA，该载体引入了酿酒酵母的a-交配因子（a-factor)，使重组蛋白分泌 能力大大增强，可达l〇g/L。⑥毕赤酵母分泌的蛋白纯度高。毕赤酵母自身只分泌少许蛋白， 使得分离纯化外源蛋白较容易。⑦进行蛋白修饰，起到保护蛋白作用。与酿酒酵母相比，毕 赤酵母对分泌的蛋白进行N-、0_糖基化修饰且程度适中，这有助于增加分泌蛋白的活性。
[0036] 本发明宿主菌毕赤酵母本身不能分泌木聚糖酶，利用基因工程技术，将优化的里 氏木霉木聚糖酶基因转入毕赤酵母基因组中，使其能大量分泌木聚糖酶，用于工业化生产。 基因工程重组毕赤酵母仅在摇瓶中木聚糖酶的分泌就达13014U/mL;且重组木聚糖酶有极 高的纯度（90%以上），故成长过程中可省略分离纯化步骤，较大的降低了生产成本。
[0037] 本发明中重组毕赤酵母生产的木聚糖酶稳定性较好，其适宜的反应温度范围为 40-60°C，pH范围为4-8,在动物消化道内能很好的发生相应功能，较适合用于于动物营养 与饲料工业领域。
[0038] 下面结合附图对本发明的重组毕赤酵母工程菌的生产方法作进一步说明。
【附图说明】
[0039] 图1是本发明中重组毕赤酵母表达产物电泳分析结果；
[0040] 图2是本发明中重组毕赤酵母木聚