新型的杀虫蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程和分子育种技术领域。具体而言，本发明涉及经人工设 计和改造的杀虫蛋白多肽或其片段，所述多肽或其片段具有针对昆虫害虫的杀虫活性。本 发明还提供了编码所述杀虫蛋白多肽或其片段的核酸、杀虫组合物、DNA构建体以及包括所 述核酸的转化的微生物和植物。这些组合物在用于控制害虫特别是植物害虫的方法中有 用。本发明还涉及借助所述核酸或DNA构建体来改良植物抗逆性的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最为重要的粮食作物之一，也是我国的重要经济作物，全球有近一 半的人以稻米为主食[Khush, 2005],主要分布在亚洲，水稻在欧洲、美洲、非洲和大洋洲也 均有种植。然而，水稻也是受虫害危害最为严重的粮食作物之一，据不完全统计，全球每年 因鳞翅目等水稻害虫的危害造成稻米的损失已超过千万吨[Herdt，1991 ;朱桢等，1999]。 农药的使用在防治虫害上虽能起到作用，但也给人类带来了严重的残毒污染。农药在环境 中残留，可能污染大气和水资源，破坏土壤性状；而且，在杀死害虫的同时，不少益虫也被消 灭，这严重破坏了生态平衡；另外，农药的长期使用还可能引起害虫产生抗药性；因此选育 抗虫水稻品种、提高水稻自身抗性被认为是一种更为环保有效的防治方法。但由于水稻品 种本身抗虫资源贫乏，常规育种选育新品种的周期也较长，因此一直没有较好的克服抗虫 水稻新品种选育这个难题。近年来随着细胞生物学和分子生物学的飞速发展，科学家们成 功地利用生物基因工程技术将外源抗虫基因通过转化整合到水稻基因组，使水稻自身产生 抗虫蛋白而达到抗虫的效果，并能够稳定遗传[Tuetal, 1998和2000;唐微和杨宙等， 2007]。该技术打破了物种界限，实现了基因的直接选择和有效聚合，大大提高了育种效率。
[0003] 苏云金芽孢杆菌是目前世界上应用面积最广、研究最 为深入的杀虫微生物。在苏云金芽孢杆菌产胞期间，能够形成并分泌一些由杀虫晶体蛋白 (insecticidal crystal proteins, ICPs或Cry)组成的伴孢晶体，对鳞翅目（c/yJ)、鳞 翅目和双翅目（c/T//)、鞘翅目fczr///)以及双翅目等昆虫，以及动植物线虫等节 肢动物都有特异性的毒杀活性（Schn印f et al，1998;李长友等，2007)。但是长期单一 的种植转Bt基因植物，也可能导致害虫产生抗性。近几十年来人们已经陆续发现不同的害 虫对ICPs及转ICPs基因植物表现出不同水平的抗性[McGaugher et al，1985 ;Van，1990; Gould，1992; Lee, 1995; Tabashnik et al, 1997;倪万潮和郭三堆，1998 ;High et al, 2004; Griffitts JS and Aroian RV，2005]。
[0004] 近年来，人们发现Bt在营养生长期可以分泌一类新型杀虫蛋白即苏云金芽孢杆 菌营养期杀虫蛋白（Vegetative Insecticidal Protein,简称VIP)，它不形成晶体，在氨基 酸序列的进化上与ICPs没有任何同源性，杀虫机理与ICPs也不相同，也不存在结构相似性 [Estruch et al, 1996;Yu et al, 1997; Estruch et al, 1998; Lee et al,2003; Estela et al，2004;Rang et al，2005],对鳞翅目和鞘翅目等多种农业害虫具有一定的杀虫活 性[Estruch et al, 1996; Warren et al, 1998]，对某些害虫的杀虫活性达到纳克级水平
[刘荣梅等，2004];另外，对小地老虎等对ICPs不敏感的害虫也具有毒性[Estruchet al，1996;Yuetal，1997]。这对于治理对ICPs不敏感或产生抗性的农业害虫提供了一种 新的选择。
[0005]VIP是苏云金芽孢杆菌在营养生长对数中期开始分泌的一类胞外毒素蛋白 [Schn印fetal，1998]，在自然界中广泛存在于Bt菌中，截止到2008年，共分离发现8类 37种[Crickmore，2008]。已有的研究表明，这些VIPs蛋白在遗传上相对保守，在一般条件 下，它们至少有75%存在于上清培养液中，且相比较于ICPs具有热不稳定性，在95°C条件 下处理20min便会失去活性[Estruchetal, 1996]。
[0006] 在命名系统上，VIPs可根据其蛋白质序列同源性区分为以下三个大类，即VIP1、 VIP2和VIP3[Crickmoreetal，2008]。VIP1和VIP2共同构成二元毒素对鞘翅目萤叶甲 科昆虫具有杀虫特异性[Warrenetal，1998] ;VIP3对鳞翅目科、属、种中的许多害虫具有 较广谱的杀虫活性，其杀虫机理研究的也比较深入[Estruchetal, 1998]。到2008年，已 有五十七个基因被鉴定分离出来[Crickmore, 2008]。
[0007] VIP1和VIP2作为二元毒素，在杀虫机理上是独自起作用的[Barthetal，2002 和2004]。基因位于基因的上游，其产物能独立行使它们各自的功能[Barth etal，2004]，但只有当两种蛋白同时存在并协同作用时，才能发挥毒素蛋白最大的杀虫 毒力[Warrenetal，1998]。研究表明，VIP1能与昆虫幼虫中肠上皮细胞上的受体特异 性结合，并在细胞膜上形成通道，为VIP2进入祀标昆虫细胞的细胞质提供途径[Barthet al，2004]。含有NAD结合位点的VIP2则具有ADP-核糖基转移酶活性，可以将核糖基转移 到肌动蛋白上，同时伴随烟酰胺的释放，导致肌动蛋白单体的多聚化受阻，影响了细胞骨架 的构成，从而导致昆虫细胞死亡（Hanetal, 1999)。
[0008]VIP3的杀虫机理主要体现在毒素对昆虫中肠细胞的破坏[Whalon& Wingerd，2003]。全长88ku的VIP3A被鳞翅目昆虫吞食后，在其中肠胰蛋白酶作用下水解 活化，活化的VIP3A蛋白能与敏感幼虫中肠的BBMVs上的80ku和100ku的未知受体分子结 合，并在中肠上皮细胞上形成离子通道型穿孔，诱发昆虫细胞凋亡，细胞核溶解，最终导致 昆虫死亡[Leeetal，2003]。并且VIP3A蛋白只要当pH低于7.5时即可溶解，其C'端也 不被切除，同时，这2种受体也不同于已知的任何Cry受体[Leeetal，2003];另外，在没有 任何受体的情况下，VIP3A也能在人工双脂质膜（BLMs)上形成通道[Warrenetal，1998; Leeetal，2003]。细胞病理学试验表明：饲喂小地老虎和草地贪夜蛾等敏感昆虫VIP3A(a) 蛋白72h后，中肠上皮杯状细胞和柱状细胞与基膜完全脱落，昆虫死亡[Yu，etal，1997]。 Vip3A引起的症状与ICPs的相似，但在时间上推迟了（Estruchetal，1996)。由此可见， VIP3A的受体和作用方式与ICPs明显不同，因此研究和利用VIP3A，对于拓宽杀虫谱、提高 杀虫毒力、防止昆虫产生抗性具有重要意义。
[0009]ICP蛋白的分子质量一般为130~160ku，仅溶于pH>10的高碱性溶液，以原毒素 的形式存在，本身不具有毒性，被昆虫幼虫吞食后在其中肠的碱性和还原性环境下能够溶 解并剪切成65~75ku的活性多肽；而VIP3A在弱碱性条件下甚至pH略低于7. 5时也可被 胰蛋白酶剪切成62ku大小的活性多肽（Leeetal，2003)。另外，ICP蛋白是分泌于胞内的 晶体蛋白，VIP蛋白则是胞外分泌蛋白；在分泌过程中，全长为100ku的VIP1A蛋白在形成 80ku的成熟毒素之前其N'端信号肽会被切除，而全长为88ku的VIP3A蛋白在分泌过程中 N'端信号肽则往往因无酶切位点存在一般不被切除[Schn印fetal，1998]。在杀虫谱方 面，VIP蛋白比Cry蛋白宽，对于小地老虎等对ICP蛋白不敏感的农业害虫也具有杀虫活性 [Estruchetal, 1996]〇
[0010] 目前在苏云金芽孢杆菌的自然菌株中尚未分离到能高抗水稻螟虫的K/a?基因。 因此，人工合成、改造和创新抗水稻螟虫的K/a?基因资源对于解决基因使用所面临的 抗虫持久性问题[McGaughey，1985;Van，1990;Gould，1992;Lee，1995;Tabashniket al，1997;倪万潮和郭三堆，1998;Highetal，2004]具有深远意义。
[0011] 发明概述 为解决上述问题，本申请的发明人研制出一个高抗昆虫害虫特别是抗鳞翅目害虫的K/a別基因，尤其是具备迄今业已鉴定分离的所有其它K/a?基因所不具备的高抗水稻鳞翅 目害虫如二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等的能力，命名为,提供了借助农杆菌介 导法转化的质粒载体系统及