导入特异shRNA得到的CypA基因被沉默的重组哺乳动物细胞的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种导入特异shRNA得到的CypA基因被沉默的重组哺乳动物细胞。本发明提供了一种重组哺乳动物细胞，是将特异shRNA导入离体的哺乳动物细胞得到的重组细胞；所述特异shRNA如序列表的序列2所示。所述特异shRNA具体可以以表达所述特异shRNA的重组逆转录病毒的形式导入所述离体的哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞为BHK-21细胞、MDCK细胞或293T细胞。本发明提供了shRNA可以特异性抑制CypA蛋白的编码基因的表达。本发明提供的重组哺乳动物细胞可以作为WSN毒株的生物反应器，大量制备WSN毒株。
【专利说明】导入特异shRNA得到的CypA基因被沉默的重组晡乳动物细
胞【技术领域】[0001]本发明涉及一种导入特异shRNA得到的CypA基因被沉默的重组哺乳动物细胞。【背景技术】
[0002]CypA是一种高度保守,广泛存在的蛋白，属于Cyclophilin家族(Cyp家族)。Cyp家族的蛋白都具有顺反异构酶活性，能够帮助蛋白的折叠和聚集，参与细胞的信号传导。在哺乳动物中已经发现10余种Cyp家族成员，包括CypA、CypB> CypC、CypD> CypE> Cyp40、RanBP2等。CypA是一种分布最广泛的蛋白，参与细胞运输、信号转导、转录调节、细胞周期调控等。
[0003]慢病毒载体介导的基因表达或RNAi干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种导入特异shRNA得到的CypA基因被沉默的重组哺乳动物细胞。
[0005]本发明提供了一种重组哺乳动物细胞，是将特异shRNA导入离体的哺乳动物细胞得到的重组细胞；所述特异shRNA如序列表的序列2所示。
[0006]所述特异shRNA具体可以以表达所述特异shRNA的重组逆转录病毒的形式导入所述离体的哺乳动物细胞。
[0007]所述“表达所述特异shRNA的重组逆转录病毒”的制备方法具体如下:将重组质粒、质粒pCL-Eco和质粒pCL-VSVG共同导入293T细胞，进行培养后得到细胞培养上清，其中含有所述“表达所述特异shRNA的重组逆转录病毒”；所述重组质粒为在载体pSUPER.neo+GFP的多克隆位点(如BglII和HindIII酶切位点之间)插入序列表的序列I所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
[0008]所述培养的条件为:37°C培养24-48小时(优选为36小时)。
[0009]所述哺乳动物细胞为BHK-21细胞、MDCK细胞或293T细胞。
[0010]本发明还保护人胚肾细胞293T/CypA (_)。人胚肾细胞293T/CypA (-)已于2013年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.8306。
[0011]本发明还保护一种重组质粒，为在载体pSUPER.neo+GFP的多克隆位点(如BglII和HindIII酶切位点之间)插入序列表的序列I所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
[0012]本发明还保护一个质粒组，由所述重组质粒、质粒pCL-Eco和质粒pCL-VSVG组成。
[0013]本发明还保护序列表的序列2所示的shRNA。
[0014]本发明还保护编码所述shRNA的DNA分子，具体可如序列表的序列I所示。[0015]本发明提供了 shRNA可以特异性抑制CypA蛋白的编码基因的表达。本发明提供的重组哺乳动物细胞可以作为WSN毒株的生物反应器，大量制备WSN毒株。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为实施例2的步骤一的western blot结果。
[0017]图2为实施例2的步骤二的western blot结果。
[0018]图3为实施例2的步骤三的western blot结果。
[0019]图4为实施例3的步骤一的4的结果。
[0020]图5为实施例3的步骤一的5的结果。
【具体实施方式】
[0021]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0022]载体pSUPER.neo+GFP (别名:pSuper.gfp/neo):货号为 VEC-PBS-OOO6。质粒pCL-Eco:购自丁香通质粒库，作用为“构成核心蛋白骨架”。质粒pCL-VSVG:购自丁香通质粒库，作用为“疱疹性口炎 病毒中G蛋白能够识别外层细胞受体”。
[0023]BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞):中国兽医药品监察所。MDCK细胞(犬肾细胞):中国兽医药品监察所。293T细胞(人胚肾细胞):武汉博士德生物工程有限公司，货号为CX0008。lysis buffer:北京普利智诚生物技术有限公司，货号为Cell Lysis Bu ffer (10X)9803S。Ant1-CypA:上海武昊经贸有限公司，货号为A90979Hu71。Ant1-^-actin:艾美捷科技有限公司，货号为A01010。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗:上海中科英沐生物科技有限公司，货号为 PB001。Ant1-CypE:Santa Cruz Biotechno logy 公司，Cyclophilin E 抗体(9E18)，货号 sc-100700。WSN 毒株:Sh Cao, X-L L iu, M-R Yu, J Li, X-J Jia, Y-H Bi, LSun, George F.Gao, ff-J Liu*.2012.A Nuclear Export Signal in the Matrix Protein ofInfluenza A Virus Is Requi red for the Efficient Virus Replication.Journal ofVirology, 86(9):4883-91。
[0024]实施例1、重组逆转录病毒的制备
[0025]一、重组质粒的构建
[0026]1、分别合成单链DNA分子甲和单链DNA分子乙。
[0027]单链DNA分子甲:
[0028]5， -GATCCCCGGGTTCCTGCTTTCACAGATTCAAGAGATCTGTGAAAGCAGGAACCCTTTTTGGAAA-3，。
[0029]单链DNA分子乙:
[0030]5， -AGCTTTTCCAAAAAGGGTTCCTGCTTTCACAGATCTCTTGAATCTGTGAAAGCAGGAACCCGG殳-3，。
[0031 ] 2、将单链DNA分子甲和单链DNA分子乙复性，得到DNA分子丙(单链DNA分子甲和单链DNA分子乙的下划线标注区形成双链)。[0032]3、用限制性内切酶BglII和HindIII双酶切载体pSUPER.neo+GFP,回收约5429bp的载体骨架。
[0033]4、将双链DNA分子丙与步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下:在载体pSUPER.neo+GFP的BglII和HindIII酶切位点之间插入了序列表的序列I所示的双链DNA分子。序列I中，自5’末端第4至23位核苷酸与第31-50位核苷酸反向互补。序列表的序列I所示的双链DNA分子编码序列表的序列2所示的单链RNA分子卿目的shRNA)。
[0034]序列1、CCCGGGTTCCTGCTTTCACAGATTCAAGAGATCTGTGAAAGCAGGAACCCTTTTTGGAAA。
[0035]序列2、GGGUUCCUGCUUUCACAGAUUCAAGAGAUCUGUGAAAGCAGGAACCC。
[0036]二、重组逆转录病毒的获得
[0037]借助Lipofectamine TM2000 (购自 Invitrogen 公司，货号为 11668-027)将步骤一构建的重组质粒、质粒pCL-Eco和质粒pCL-VSVG共同导入293T细胞，37°C培养36小时(实际应用中，24-48小时均可)，收集细胞培养上清(细胞培养上清中含有表达目的shRNA的重组逆转录病毒，将其命名为shRNA病毒液)。
[0038]实施例2、重组哺乳动物细胞的获得
[0039]一、BHK-21/ CypA (_)细胞的获得
[0040]1、用DMEM培养基悬浮BHK-21细胞，得到IO5个细胞/ml的细胞悬液。
[0041]2、取12孔细胞培养板，每孔加入0.5ml步骤I得到的细胞悬液和0.5ml实施例1得到的shRNA病毒液，加入聚凝胺(加入聚凝胺的目的是增强转染)并使其浓度为8μ g/ml，先32°C、2500rpm离心2小时，然后37°C培养36小时(实际应用中，24-48小时均可)，收集细胞。
[0042]3、取步骤2得到的细胞,加入lysis buffer并4°C裂解30min,然后4°C、500g(实际应用中400-500g均可)离心5min,收集上清液。
[0043]4、取BHK-21 细胞，加入 lysis buffer 并 4°C裂解30min,然后 4°C、500g离心 5min,
收集上清液。
[0044]5、分别将步骤3得到的上清液和步骤4得到的上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(12%分离胶/120V, 5%浓缩胶/80V)并进行western blot。western blot采用的一抗为Ant1-CypA或Ant1-CypE,采用的二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗。
[0045]western blot的结果见图1,泳道I为步骤4得到的上清液,泳道2为步骤3得到的上清液。步骤3得到的上清液中，检测不到CypA蛋白，但可以检测到CypE蛋白。步骤4得到的上清液中，可以检测到CypA蛋白和CypE蛋白。结果表明，转染了 shRNA病毒液的BHK-21细胞中，CypA蛋白的编码基因的表达被抑制，细胞中的其它基因(例如与CypA蛋白属于同家族的CypE蛋白的编码基因的表达未受影响)。
[0046]将转染了 shRNA病毒的BHK-21细胞命名为BHK-21/CypA (-)细胞。
[0047]二、MDCK/CypA (_)细胞的获得
[0048]1、用DMEM培养基悬浮MDCK细胞，得到IO5个细胞/ml的细胞悬液。
[0049]2、取12孔细胞培养板，每孔加入0.5ml步骤I得到的细胞悬液和0.5ml实施例1得到的shRNA病毒液，加入聚凝胺(加入聚凝胺的目的是增强转染)并使其浓度为8μ g/ml，先32°C、2500rpm离心2小时，然后37°C培养36小时(实际应用中，24-48小时均可)，收集细胞。
[0050]3、取步骤2得到的细胞，加入lysis buffer并4°C裂解30min，然后4°C、500g(实际应用中400-500g均可)离心5min,收集上清液。
[0051]4、取 MDCK 细胞,加入 lysis buffer 并 4°C裂解 30min,然后 4°C、500g 离心 5min,
收集上清液。
[0052]5、分别将步骤3得到的上清液和步骤4得到的上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(12%分离胶/120V, 5%浓缩胶/80V)并进行western blot。western blot采用的一抗为Ant1-CypA或Ant1-CypE,采用的二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗。
[0053]western blot的结果见图2,泳道I为步骤4得到的上清液,泳道2为步骤3得到的上清液。步骤3得到的上清液中，检测不到CypA蛋白，但可以检测到CypE蛋白。步骤4得到的上清液中，可以检测到CypA蛋白和CypE蛋白。结果表明，转染了 shRNA病毒液的MDCK细胞中，CypA蛋白的编码基因的表达被抑制，细胞中的其它基因(例如与CypA蛋白属于同家族的CypE蛋白的编码基因的表达未受影响)。
[0054]将转染了 shRNA病毒的MDCK细胞命名为MDCK/CypA (_)细胞。
[0055]三、293T/CypA(_)细胞的获得
[0056]1、用DMEM培养基悬浮293T细胞，得到IO5个细胞/ml的细胞悬液。
[0057]2、取12孔细胞培养板，每孔加入0.5ml步骤I得到的细胞悬液和0.5ml实施例1得到的shRNA病毒液，加入聚凝胺(加入聚凝胺的目的是增强转染)并使其浓度为8μ g/ml，先32°C、2500rpm离心2小时，·然后37°C培养36小时(实际应用中，24-48小时均可)，收集细胞。
[0058]3、取步骤2得到的细胞,加入lysis buffer并4°C裂解30min,然后4°C、500g(实际应用中400-500g均可)离心5min,收集上清液。
[0059]4、取 293T 细胞,加入 lysis buffer 并 4°C裂解 30min,然后 4°C、500g 离心 5min,
收集上清液。
[0060]5、分别将步骤3得到的上清液和步骤4得到的上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(12%分离胶/120V, 5%浓缩胶/80V)并进行western blot。western blot采用的一抗为Ant1-CypA> Ant1-CypE或Ant1-β -actin,采用的二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗。
[0061]western blot的结果见图3,泳道I为步骤4得到的上清液,泳道2为步骤3得到的上清液。步骤3得到的上清液中,检测不到CypA蛋白，但可以检测到CypE蛋白和β -actin蛋白。步骤4得到的上清液中,可以检测到CypA蛋白、CypE蛋白和β-actin。结果表明，转染了 shRNA病毒液的293T细胞中，CypA蛋白的编码基因的表达被抑制，细胞中的其它基因(例如与CypA蛋白属于同家族的CypE蛋白的编码基因的表达未受影响)。
[0062]将转染了 shRNA病毒的293T细胞命名为293T/CypA (-)细胞，又称人胚肾细胞293T/CypA (_)。人胚肾细胞293T/CypA (-)已于2013年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110:，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.8306。
[0063]实施例3、重组哺乳动物细胞在培养流感病毒中的应用
[0064]本实施例中的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为pH7.2-7.4的PBS缓冲液(溶剂为水，每升含 NaC18g、KC10.2g、Na2HPO4.12H203.58g、KH2PO40.24g)。本实施例中用于培养各种哺乳动物细胞的培养基均为DMEM培养液。
[0065]一、293T/CypA (_)细胞在培养流感病毒中的应用
[0066]将293T细胞和293T/CypA (-)细胞作为待测细胞分别进行如下操作:
[0067]1、将待测细胞接种至24孔板，每孔IO5个细胞，37°C培养过夜，吸弃上清，用PBS缓冲液洗涤3次。
[0068]2、完成步骤I后，加入病毒感染液(含有WSN病毒、0.5 μ g/ml TPCK-胰酶、1000万U青霉素和1000万U链霉素的DMEM培养液；M0I=1)，37°C孵育I小时，吸弃上清，用PBS缓冲液洗涤3次。
[0069]3、完成步骤2后，37°C培养4小时。
[0070]4、完成步骤3后，取细胞，使用4%多聚甲醒固定，然后进行免疫荧光检测(采用的一抗为抗NP蛋白的抗体，采用的二抗为FITC荧光标签标记的羊抗兔的抗体，采用激光共聚焦突光显微镜观察；一抗全称为Ant1-1nfluenza A Virus Nucleoproteinantibody [AA5H], abeam公司，货号ab20343 ;二抗购自百汇中源(北京)生物科技有限公司，货号为 10001002)。
[0071]染色后的NP蛋白为绿色。感染细胞比率=存在NP蛋白的细胞数量/用于观察统计的细胞总数量。用于观察统计的细胞总数量为300个以上。
[0072]结果见图4。在293T/CypA(_)细胞中，WSN病毒的感染细胞比率为100%。在293T细胞中，WSN病毒的感染细胞比率仅为58.3%。结果表明，293T/CypA (_)细胞中，由于CypA蛋白的编码基因的表达被抑制，流感病毒的复制能力大大增加了。
[0073]5、完成步骤2后，37°C培养，间隔时间收取细胞培养上清，进行病毒噬斑检测。
[0074]病毒噬斑检测的方法如下:(I)将MDCK细胞接种至12孔板，37°C培养24小时，使细胞长成单层，密度以铺满底部为宜，然后用PBS缓冲液洗涤细胞2次；(2)每孔加入10 μ I感染液(含0.5 μ g/ml TPCK-胰酶、1000万U青霉素和1000万U链霉素的DMEM培养液)，然后每孔加入Iml所述细胞培养上清，37°C孵育I小时，吸弃上清，用PBS缓冲液洗涤3次；
(3)在水浴锅中加热融化3%低熔点琼脂糖，然后自然冷却至37°C，与37°C预热的无酚红DMEM培养液(含4 μ g/ml TPCK-胰酶、1000万U青霉素和1000万U链霉素)等体积混合；
(4)完成步骤(2)后，每孔加入Iml步骤(3)得到的混合物，4°C放置10分钟，然后于37°C、C02培养箱中倒置培养，3天(实际应用中，2-4天均可)后，观察噬斑情况，计数统计。
[0075]结果见图5。对于293T/CypA (_)细胞来说，从完成病毒转染开始计时培养6小时后得到的细胞培养上清中即可能检测到病毒粒子的存在。对于293T细胞来说，从完成病毒转染开始计时培养8小时后得到的细胞培养上清才能检测到病毒粒子。流感病毒在293T/CypA (-)细胞上的第一个生长周期比其在293T细胞上快约2小时。
[0076]二、BHK-21/CypA (_)细胞在培养流感病毒中的应用
[0077]用BHK-21 细胞代替 293T 细胞，用 BHK-21/CypA (-)细胞代替 293T/CypA (-)细胞，其它同步骤一。
[0078]在BHK-21/CypA (-)细胞中，WSN病毒的感染细胞比率为100%。在BHK-21细胞中，WSN病毒的感染细胞比率仅为83%。结果表明，BHK-21/CypA (-)细胞中，由于CypA蛋白的编码基因的表达被抑制，流感病毒的复制能力大大增加了。[0079]对于BHK-21/CypA (-)细胞来说，从完成病毒转染开始计时培养6小时后得到的细胞培养上清中即可能检测到病毒粒子的存在。对于BHK-21细胞来说，从完成病毒转染开始计时培养8小时后得到的细胞培养上清才能检测到病毒粒子。
[0080]三、MDCK/CypA (_)细胞在培养流感病毒中的应用
[0081]用MDCK细胞代替293T细胞，用MDCK/CypA (_)细胞代替293T/CypA (-)细胞，其它同步骤一。
[0082]在MDCK/CypA (_)细胞中，WSN病毒的感染细胞比率为100%。在MDCK细胞中，WSN病毒的感染细胞比率仅为76%。结果表明，MDCK/CypA (_)细胞中，由于CypA蛋白的编码基因的表达被抑制，流感病毒的复制能力大大增加了。
[0083]对于MDCK/CypA (-)细胞来说，从完成病毒转染开始计时培养6小时后得到的细胞培养上清中即可能检测到病毒粒子的存在。对于MDCK细胞来说，从完成病毒转染开始计时培养8小时后得到的细胞培养上清才能检测到病毒粒子。
【权利要求】
1.一种重组哺乳动物细胞，是将特异ShRNA导入离体的哺乳动物细胞得到的重组细胞；所述特异shRNA如序列表的序列2所示。
2.如权利要求1所述的重组哺乳动物细胞，其特征在于:所述特异shRNA以表达所述特异shRNA的重组逆转录病毒的形式导入所述离体的哺乳动物细胞。
3.如权利要求2所述的重组哺乳动物细胞，其特征在于:所述“表达所述特异shRNA的重组逆转录病毒”的制备方法如下:将重组质粒、质粒pCL-Eco和质粒pCL-VSVG共同导入293T细胞，进行培养后得到细胞培养上清，其中含有所述“表达所述特异shRNA的重组逆转录病毒”;所述重组质粒为在载体pSUPER.neo+GFP的多克隆位点插入序列表的序列I所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
4.如权利要求3所述的重组哺乳动物细胞，其特征在于:所述培养的条件为:37°C培养24-48小时。
5.如权利要求1至4中任一所述的重组哺乳动物细胞，其特征在于:所述哺乳动物细胞为BHK-21细胞、MDCK细胞或293T细胞。
6.人胚肾细胞293T/CypA(_)，它的保藏编号为CGMCC N0.8306。
7.—种重组质粒，为在载体pSUPER.neo+GFP的多克隆位点插入序列表的序列I所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
8.质粒组，由权利要求7所述重组质粒、质粒pCL-Eco和质粒pCL-VSVG组成。
9.序列表的序列2所不的shRNA。
10.编码权利要求9所·述shRNA的DNA分子。
【文档编号】C12N5/073GK103710309SQ201310674488
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】刘文军, 李晶, 陈吉龙, 杨利敏, 赵振东 申请人:中国科学院微生物研究所