一种使用病毒诱导的基因沉默系统培育雄性不育植株的方法
【专利摘要】本发明提供了VIGS载体系统在培育双子叶雄性不育植株中的应用。本发明建立了一个基于VIGS技术的高效实用的植物不育株系创建技术体系，不育率超过了96%，可达到98%，且具有不稳定遗传的特点，不会在后代中遗传，不会发生因不可控生物技术扩散而引起的基因污染或生物安全。同时，本发明操作简单，时间短，田间工作量少，大大节约成本，提高育种效率。
【专利说明】一种使用病毒诱导的基因沉默系统培育雄性不育植株的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及以生物技术手段培育雄性不育植株的载体系统和方法，尤其涉及双子叶植物。
【背景技术】
[0002]培养拥有不育性稳定，彻底，各方面性状良好的雄性不育株系是实现植物杂交育种目标的关键。目前，生产上培育雄性不育株系的主要途径有胞质不育系统、核不育系统和化学杀雄系统等。
[0003]细胞质雄性不育是当前油菜杂种优势利用中应用最广泛而又最有效的途径之一，但是该系统不育系的不育性不够彻底、易受环境温度的影响。在初花期低温条件下易出现微量花粉，微粉的产生将迫使母本自交结实，使Fl代种子恢复度降低，在生产上应用存在一定风险。例如，对于油菜来说，胞质不育系统微粉问题是目前国内外育种界尚未彻底攻克的技术难题，也是油菜三系制种普遍存在的一大隐患。细胞核不育系不育性彻底稳定，不受环境条件影响，恢复系多，易获得强优势组合。该系统的不足之处在于其不育系中存在50%可育株，在亲本繁殖和杂交种生产中要人工去除不育系中50%的可育株，导致生产成本增加，而且一旦去除不及时，杂交种中会出现一定比例的不育株系。经过改进，人们育成了隐性和显性核不育三系，解决了核不育亲本繁殖和杂交种制种过程中需要拔除50%可育株的难题，但是该系统存在保 持系较少、亲本选育较难的问题。化学杀雄是指在植物雄性器官分化前或发育过程中，喷施内吸性药剂，经过一系列生理生化过程，以阻止花粉的形成或抑制花粉的正常发育，而导致的雄性不育。利用化学杀雄剂培育品种是一种新型的油菜育种方法，在国内外应用较为广泛，但是该系统杂交种由于易受外界条件影响、田间操作繁琐，而且由于农药残留等问题，在生产上大面积应用也存在一定局限性。
[0004]近来的分子生物学研究中，利用生物技术手段来培育雄性不育植株是一个重要的研究方向。与传统不育系选育相比，生物技术不育系的培育可以不受遗传资源的限制，通过转基因等可以从分子水平上改变植物育性的手段实现。然而，利用转基因生物技术培育的稳定不育系不仅面临着转基因扩散的安全问题，而且同样存在上述细胞核不育系的缺点。
[0005]病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)也是一种可用于调控植物内源基因表达水平的生物技术。VIGS引起的基因沉默是一种转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)现象,是植物体内普遍存在的遗传免疫机制。VIGS技术通过在病毒载体中插入目的基因片段，并侵染寄主植物，利用植物体内天然存在的遗传免疫机制，将内源目的基因mRNA降解，使植物出现目的基因功能丧失或表达水平下降的表型。与植物转基因技术相比，VIGS无需培育转基因植株，而且具有操作简便、获得表型快速等优点，目前已广泛应用于与植物抗病、逆境胁迫、细胞信号转导以及生长发育等相关基因功能的研究。但是，利用VIGS技术沉默植物内源基因一直存在一个沉默效率的问题，一股获得有表型材料的比例低于30%，限制了这一技术应用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于利用生物技术建立不受育种资源限制、可利用现有可育优质种质资源，快速培育不育性彻底稳定及性状优良的雄性不育系，而且具有田间操作简单、制种成本低的授粉控制系统。
[0007]本发明的目的是通过以下措施实现的:
[0008]VIGS载体系统在培育双子叶雄性不育植株中的应用。
[0009]优选地，上述VIGS载体系统来源于烟草脆裂病毒(TRV病毒)，包括辅助病毒载体PTRVl (含TRV病毒的RNAl片段)和表达病毒载体pTRV2 (含TRV病毒的RNA2片段)。
[0010]上述pTRVl载体包括以下结构:依次为左边界(LB)、2X35S启动子、2X35S启动子驱动表达的烟草脆裂病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)、富半胱氨酸16K蛋白、运动蛋白(MP)、自主剪切核酶(Rz)、转录终止子(NOSt)、右边界(RB);上述pTRV2载体包括以下结构:依次为左边界(LB)、2X35S启动子、2X35S启动子驱动表达的烟草脆裂病毒外壳蛋白(CP)、多克隆位点(MCS)、自主剪切核酶(Rz)、转录终止子(NOSt)、右边界(RB)。如图9所示。在利用VIGS方法沉默植物基因时，利用pTRV2载体CP和Rz之间的多克隆位点(MSC)将靶基因片段构建在的PTRV2载体中。pTRVl和pTRV2载体均有T-DNA的左右边界，用于在侵染植物过程中将载体中的目的片段导入植物细胞，以启动烟草脆裂病毒的复制。PTRVl含TRV病毒的RNAl cDNA克隆，为病毒复制组装所必须；pTRV2含TRV病毒RNA2cDNA克隆和多克隆位点(MCS)。
[0011]上述VIGS载体系统带有植物育性调控基因，主要为隐性雄性不育基因，优选为 COIl 基因(Coronatine-1nsensitivel), MSPl 基因(MultipleSporocyte), TDR 基因(tapetum degeneration retardation)和 UDTl 基因(undeveloped Tapetuml)等，在基因沉默后可影响小孢子母细胞发育、绒毡层发育、花粉囊和花粉外壁发育而导致雄性不育性状的基因。
[0012]上述双子叶植物优选为十字花科植物。
[0013]油菜COIl基因的序列为SEQ ID N0.1，其中核苷酸(1181)至(1694)的序列片段可以用于沉默整个油菜COIl基因。烟草COIl基因的序列为SEQ ID N0.2，其中核苷酸(444)至(952)可以用于沉默整个烟草COII基因。SEQ ID N0.3为pTRVl载体中的烟草脆裂病毒RNAl序列片段，SEQ ID N0.4为pTRV2载体序列。
[0014]使用上述VIGS载体系统培育双子叶雄性不育植株的方法，包括以下步骤:
[0015](1)克隆植物育性调控基因，构建携带植物育性调控基因的重组PTRV2病毒载体；
[0016](2)将携带植物育性调控基因的重组PTRV2病毒载体、pTRVl载体导入农杆菌，将含携带植物育性调控基因的重组PTRV2病毒载体和pTRVl载体的农杆菌配制成0D600为
0.6~1.0的菌液；
[0017](3)切除植株的部分根须后，将根部浸入步骤(2)的菌液中；
[0018](4)取出侵染后的植株，经培育，最终表现为不育性状。
[0019]优选地，上述使用VIGS载体系统培育双子叶雄性不育植株的方法，包括以下步骤:
[0020](1)克隆COIl基因，构建携带COIl基因的重组PTRV2-C0I1病毒载体；[0021](2)将pTRV2-C0Il和pTRVl载体导入农杆菌GV3101，将分别含有pTRV2_C0Il和pTRVl载体的农杆菌GV3101按1:1的比例配制成0D600为0.6~1.0的菌液；
[0022](3)切除植株的部分根须后，将根部浸入步骤(2)的菌液中；
[0023](4)取出侵染后的植株，经过栽种、春化，开花后，最终表现为不育性状。
[0024]有益效果
[0025]1.本发明创造性的将VIGS技术应用于雄性不育植株的培育，建立了一个高效实用的植物不育株系创建技术体系。在利用该技术体系培育不育材料的实践中，不育率超过了 96%，可达到98%。
[0026]2.本发明创造的雄性不育系具有不稳定遗传的特点，不会在后代中遗传，因此，在田间生产中不会发生因不可控生物技术扩散而引起的基因污染或生物安全。
[0027]3.本发明可快速培育雄性不育植株，可以任意选择最优的品种作为不育亲本，不存在像细胞核，细胞质雄性不育体系中所要求的恢保关系，因此亲本选择自由，可任意组配杂交组合，有利于优中选优，筛选出较强的优势组合。同时，本发明操作简单，时间短。在室内对幼苗根部进行浸泡侵染后即可移栽到田里，后面没有人工去雄和化学去雄的田间操作，田间工作量少，大大节约成本，提高育种效率。提高植株杂种优势的利用效率以及实现“杂优+优质”的育种目标。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1实施例2油 菜COIl基因cDNA片段的PCR扩增图(514bp) =Marker:DNA分子量标准；2，3:烟草COIl基因片段的PCR扩增产物；
[0029]图2实施例2pTRV2_C0Il载体构建的菌落PCR鉴定图:Marker:DNA分子量标准；1-6:对不同菌落中PTRV2-C0I1载体鉴定的PCR扩增产物；
[0030]图3实施例2pTRV2-C0I I质粒酶切鉴定图:Marker =DNA分子量标准；I，2:PTRV2-C0I1 质粒的 NcoI 与 EcoICRI 双酶切鉴定；3，4:pTRV2-C0Il 质粒的 EcoICRI 与 SmaI双酶切鉴定；
[0031]图4实施例2转pTRV2-C0Il载体农杆菌的菌落PCR检测图:Marker:DNA分子量标准；1_3:转pTRV2-C0Il载体农杆菌不同菌落的PCR扩增检测；
[0032]图5实施例2C0I1基因沉默油菜中COIl基因的表达水平:对照为使用含空载体农杆菌侵染的油菜；L1_5,为5个用含有COIl基因载体农杆菌侵染的油菜植株；
[0033]图6实施例2VIGS侵染油菜的果荚表型:左侧为对照油菜果荚，正常结实；右侧为VIGS侵染油菜的果荚，无果实；
[0034]图7实施例2VIGS侵染油菜花序的不育表型，其果荚均未正常结实；
[0035]图8实施例3以VIGS沉默烟草COIl基因引起的不育表型；
[0036]图9VIGS系统载体pTRVl和pTRV2结构示意图。
【具体实施方式】
[0037]下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域技术人员可以根据上述本
【发明内容】
对本发明作出一些非本质的改进和调整。[0038]实施例1
[0039]1.构建VIGS沉默油菜COIl基因的载体
[0040]1.1油菜COIl基因cDNA的获得
[0041]培育油菜幼苗，待其长到IOcm左右时用TRIZOL法提取茎杆和子叶的总RNA,通过反转录获得油菜总RNA对应的cDNA，取少量cDNA作为模板，正向引物为:AAATCTAGAGTGTCTCCGAACCATAGGC，反向引物为:TCTCTCACCTCTCCAAGCTG，PCR 扩增获得一条大小为 514bp 的一段油菜 COIl 基因 cDNA 片段(SEQ ID N0.1(1181)至(1694))。
[0042]1.2含油菜COIl基因的pTRV2载体的获得
[0043]用XbaI酶切COIl基因的cDNA片段，用XbaI和EcoICRI双酶切质粒pTRV2，酶切体系分别为:1.5μ L Buffer (Buf f er3), I μ L Xbal,5y L COII基因cDNA片段，添加水补充至15 μ L ; 1.5 μ L Buffer(Buffer MultiCore)，0.5 μ L Xbal，0.5 μ L EcoICRI0.1 μ L BSA,3μ L pTRV2质粒，添加水补充至15 μ L.经过2小时酶切反应后，琼脂糖凝胶电泳，切胶回收得COIl片段和载体片段。以下列方案切胶回收:
[0044]紫外灯下切胶，放入1.5ml离心管，按300 μ L / IOOmg胶块加入溶胶液，将离心管置于准备好的50°C预热水浴锅中约lOmin，至胶块完全融化。将融化好的溶液转入胶回收吸附柱中，8krpm离心Imin,弃液。向吸附柱中加500 μ L洗漆液,静置lmin, 12000rpm离心Imin,弃液,重复步骤4。空甩(吸附柱12000rpm离心lmin),将`吸附柱转入一干净离心管，加26-30 μ L ddH20于中央膜处，室温静置4min，12000rpm离心lmin，即得到回收产物。
[0045]将回收COIl片段和pTRV2载体片段于4°C连接过夜，得含油菜COIl基因的pTRV2载体，命名为pTRV2-C0Il，连接体系为:lμL T4DNA连接酶Buffer (IOx) I μ L T4DNA连接酶，IyL PEG4000,6y L COIl 片段，I μ L载体片段。
[0046]2pTRV2-C0I I载体连接产物热激转化大肠杆菌DH5 α。
[0047]2.1 转化
[0048]在-80°C冰箱取感受态大肠杆菌(DH5 α )，冰水浴约IOmin解冻，将连接产物加入混匀。冰浴30min后，在42°C水浴锅中热激60s，立刻冰浴l_2min，加900-1000 μ L LB溶液,37°C 180rpm摇床复苏约lh。5krpm5min离心，吸弃900 μ L上清液,余下重悬,涂LB平板(含30mg / L的Kan)，37°C倒置过夜培养(约14h)。
[0049]2.2挑取阳性克隆
[0050]在经过过夜培养的平板上挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，进行初筛。经电泳跑胶确认后，将含有正确质粒的菌液(按1:1比例加50%甘油)储存于-20°c备用。按下列方案提取质粒:
[0051]将摇好的菌液分装于偶数只IOml无菌试管7krpm离心4min,弃上清液，向试管中加入200 μ L sol I (4°C )混匀，再加入200 μ L sol II (室温)，上下颠倒混匀(约10下)，溶液变粘稠(像清鼻涕)。再向试管中加入250 μ L sol 111(室温)，上下颠倒混匀(约10下)，出现絮状或块状白色沉淀，溶液变清亮。将上述试管离心llkrpm6min,取上清液转入纯化柱内，离心8krpm30s,弃液。向纯化柱中加入650 μ L洗漆液,离心8krpm30s,弃液。纯化柱空甩(13k rpm2min离心)，将纯化柱转入干净1.5ml离心管，向纯化柱加30 μ L ddH20 (加到纤维膜上)，室温静置4min,离心13krpm2min,即得到质粒。
[0052]最后，将提取质粒分别进行Nco1-EcoICRI双酶切鉴定和EcoICR1-SmaI双酶切鉴定。酶切鉴定体系分别如下:1.5μ L Buffer,0.5μ L Ncol,0.5μ L EcoICRI,0.1 μ LBSA, 3 μ L pTRV2-C0II 质粒，添加水补充至 15μ L ;1.5μ L Buffer,0.5μ L Smal, 0.5μ LEcoICRIj0.1yL BSA, 3 μ L pTRV2质粒，添加水补充至15 μ L.酶切I小时后，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。酶切结果与预期一致的为阳性质粒。最后，交由生物公司测序验证。
[0053]3.农杆菌GV3101感受态制备
[0054](I)农杆菌GV3101划线培养28°C 2天
[0055](2)挑I个单菌落接种于5mlYEB(已加入5μ L Rif)，28 °C过夜培养
[0056](3)取菌液GV31013ml接种于200mlYEB液体培养基，28摇菌至OD ^ 0.6 (约4h)
[0057](4)将摇好的菌液装入离心瓶离心5krpmllmin,弃液加(冰处理2h)双蒸水重悬，5krpm离心I lmin,弃液
[0058](5)向离心瓶中加冰冷0.1mM CaC12重悬静置lOmin, 5000rpm离心Ilmin,弃上清
液
[0059](6)向离心瓶中加2m L冰冷含15%甘油的85mL CaCl2溶液
[0060](7)用1.5ml离心管分装(100 μ L /管，离心管上做好标记)，迅速放入液氮中处理数分钟
[0061](8)将处理好的感受态细胞从液氮中取出置于_80°C保存
[0062]4.转化农杆菌
[0063](I)取_80°C保存的感受态农杆菌GV31013份于冰上解冻
[0064](2)向每一份农杆菌的菌液中分别轻轻加入质粒:5 μ L pTRV2-C0Il, I μ L pTRVl,I μ L pTRV2 (空载体)，小心混匀
[0065](3)将上述混匀的菌液冰水浴5min
[0066](4)冰水浴处理后的菌液液氮处理5min (液氮液面高过菌液面)
[0067](5) 37 °C 水浴热激 5min
[0068](6)上述处理后的菌液中加入900 μ L室温放置的YEB于28°C 200rpm摇床复苏Ih
[0069](7)复苏后的菌液6krpm离心5min,弃上清900 μ L
[0070](8)余下菌液重悬涂于 YEB 平板(IyL Kan / Iml YEB, I μ L Rif / Iml YEB)
[0071](9) 28°C倒置培养约2d，至长出直径l_2mm的菌落
[0072]挑取单菌落进行菌落PCR鉴定进行初筛，经电泳跑胶确认后获得含VIGS沉默油菜COIl基因的pTRV2-C0Il载体的农杆菌，命名为:GV_C0I1，并将含有pTRV2空载体的农杆菌命名为:GV-C，将含有pTRVl载体的农杆菌命名为:GV-1。
[0073]实施例2
[0074]1.实验油菜幼苗播种，春化，育苗
[0075]播种油菜中双11号，采用塑料纤维做固定物，MS液体培养基为养料，茎杆长到5cm左右喷施I / 500稀释的矮壮素以抑制油菜幼苗的过分生长.半月后开始春化，春化条件为白天9h，9°C ;黑夜15h，40°C。春化14d后12°C复苏2d白天9h，黑夜15h。复苏完后移入25 °C温室培养。
[0076]2.用含有VIGS载体的农杆菌侵染油菜幼苗，培育沉默COIl基因的油菜株系
[0077]2.1侵染用农杆菌准备
[0078]分别将GV-C、GV-1 和 6￥-0)11在61111 YEB 培养基中，加入 6 μ L Rif、6yL Kan，并调取三个单菌接种，于28°C，220rpm.摇菌培养过夜；然后，在50ml YEB培养基中，加入50 μ LRif>50y L Kan、5 μ L乙酰丁香酮及500 μ L过夜培养菌液，再28°C，220rpm.培养至明显变浓(约12h)。
[0079]2.2高浓度侵染
[0080]将二摇培养的各农杆菌菌液5krpm离心5min，弃上清，各加20ml新鲜YEB液体培养基重悬，然后将A液:10ml GV-C和IOml GV-1出液:10ml GV-C0I1和IOml GV-1，分别混匀。分别将油菜幼苗100株，用剪刀剪去部分根系，完全浸入到A液；将油菜幼苗100株，用剪刀剪去部分根系，完全浸入B液，置于暗箱中过夜(约12h)。
[0081]2.3低浓度侵染
[0082]将高浓度侵染过的油菜幼苗从高浓度菌液中取出，分别加入少量新鲜MS单独在暗箱培养IOh.[0083]3.已进行浸根处理的油菜植株的培育
[0084]将已进行浸根处理的油菜幼苗按单株栽种，用蛭石和腐殖土按体积比1:1做栽培土，按处理液A液B液分别为每组油菜命名为GV-C和GV-C0I1，移入温室培育。用自来水浇灌，其间浇4-5次40ml霍格兰(Hoagland)营养液。
[0085]结果与分析:
[0086]1.油菜COIl基因cDNA片段的获得
[0087]通过反转录获得油菜总RNA对应的cDNA，取少量cDNA作为模板通过PCR扩增获得一条大小约为514bp的油菜COIl基因cDNA片段，如图1。
[0088]2.pTRV2-C0I I载体转化大肠杆菌DH5 α后质粒的PCR鉴定
[0089]将酶切油菜COIl基因片段与酶切PTRV2载体的连接产物转化大肠杆菌DH5 α后，在过夜培养的平板上挑取单菌落进行菌落PCR鉴定。电泳结果如图2，与预期相符，表明得到阳性克隆。
[0090]3.对PCR鉴定的阳性克隆的酶切鉴定
[0091]对上一步鉴定为阳性的克隆，提取其中的pTRV2-C0Il载体质粒，继续进行酶切鉴定，电泳结果如图3，酶切结果与预期相符，进一步表明为阳性克隆。
[0092]4.对得到的阳性克隆测序
[0093]测序结果与预期的基因序列相符，表明得到油菜pTRV2-C0Il载体。
[0094]5.pTRV2-C0I I载体载体转化农杆菌后的菌液PCR鉴定
[0095]pTRV2-C0Il载体转化农杆菌GV3101后，进行菌液PCR鉴定，电泳结果如图4，有目的条带，表明得到PTRV2-C0I1载体的农杆菌阳性克隆。
[0096]6.COIl基因沉默油菜中的COIl基因表达水平明显下降
[0097]油菜在幼苗期经过根部浸泡侵染并正常生长6周后，对对照及以VIGS沉默COIl基因油菜植株中COIl基因的表达水平检测，表明沉默COIl基因油菜植株中COIl基因的表达水平低于对照的20%，其表达收到了显著抑制。这说明VIGS方法成功沉默了油菜中的COIl基因。
[0098]7.目的基因沉默的油菜表现不育症状
[0099]油菜在幼苗期经过根部浸泡侵染后，正常生长开花，到了结实期，对照植株可以正常结实，而目的基因COIl沉默的植株果荚未能正常发育，表现为不育，如图6 (对照植株与目的基因沉默植株的单个果荚)，图7。对照植株的根部侵染液为A液，组成为GV-C+GV-1，即空载体PTRV2的农杆菌与辅助载体pTRVl农杆菌的混合液。目的基因COIl沉默的植株根部侵染液为B液，其组成为GV-COI1+GV-1，即含有目的基因COIl的重组载体pTRV2_C0Il的农杆菌与辅助载体PTRVl农杆菌的混合液。实验结果表明病毒诱导的基因沉默体系成功按预期使油菜不育，培育出油菜雄性不育株系，可作为油菜育种中的父本使用。VIGS侵染油菜中不育油菜植株的统计情况见表1。
[0100]表1VIGS侵染油菜中不育油菜植株的统计结果
[0101]
【权利要求】
1.VIGS载体系统在培育双子叶雄性不育植株中的应用。
2.如权利要求1所述的VIGS载体系统在培育双子叶雄性不育植株中的应用，所述双子叶植物为十字花科植物。
3.如权利要求1或2所述的VIGS载体系统在培育双子叶雄性不育植株中的应用，其特征在于:所述VIGS载体系统来源于烟草脆裂病毒,包括辅助病毒载体pTRVl和表达病毒载体PTRV2。
4.如权利要求3所述的VIGS载体系统在培育双子叶雄性不育植株中的应用，其特征在于:所述表达病毒载体pTRV2含有植物育性调控基因。
5.如权利要求4所述的VIGS载体系统在培育双子叶雄性不育植株中的应用，所述植物育性调控基因为COIl基因、MSPl基因、TDR基因或UDTl基因中的一种或多种。
6.如权利要求3-5任一所述的VIGS载体系统在培育双子叶雄性不育植株中的应用，其特征在于:所述PTRVl载体包括以下结构:依次为左边界(LB)、2X35S启动子、2X35S启动子驱动表达的烟草脆裂病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)、富半胱氨酸16K蛋白、运动蛋白(MP)、自主剪切核酶(Rz)、转录终止子(N0St)、右边界(RB);所述pTRV2载体包括以下结构:依次为左边界(LB)、2X35S启动子、2X35S启动子驱动表达的烟草脆裂病毒外壳蛋白(CP)、可插入目的基因的多克隆位点(MCS)、自主剪切核酶(Rz)、转录终止子(N0St)、右边界(RB)。
7.如权利要求6所述的VIGS载体系统在培育双子叶雄性不育植株中的应用，其特征在于所述VIGS载体系统的结构如图9所示。
8.使用权利要求3-7任一所述VIGS载体系统培育双子叶雄性不育植株的方法，包括以下步骤:` Cl)克隆植物育性调控基因，构建携带植物育性调控基因的重组PTRV2病毒载体； (2)将携带植物育性调控基因的重组pTRV2病毒载体导入农杆菌，将含携带植物育性调控基因的重组PTRV2病毒载体的农杆菌配制成0D600为0.6~1.0的菌液； (3)切除植株的部分根须后，将根部浸入步骤(2)的菌液中； (4)取出侵染后的植株，经培育，最终表现为不育性状。
【文档编号】C12N15/83GK103820490SQ201310634133
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】张洪博, 王文静, 李加纳, 杨小川, 马浩然 申请人:西南大学