专利名称：一种基于vigs系统在油桐中研究杨树功能基因的方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法。
背景技术：
杨树(Populus spp.)是世界范围内种植最为广泛的一种速生树木。在理想条件下，杨树大约4年即可成材，是重要的建筑用材和造纸原料，同时还可作为可再生能源的原料。毛果杨的基因组测序已经于2006年完成(Tuskan et al.，2006),杨树基因组包含45000个蛋白编码基因，并且其中大约12%的基因不能够在模式植物拟南芥中找到同源基因。因此，找到快速而有效的方法阐明这些基因的功能意义重大。近年来，研究植物基因功能的方法主要是通过根癌农杆菌介导的遗传转化产生稳定表达的转基因植株，然而这种方法由于周期较长，只适应于小部分基因，并且在后期鉴定转基因阳性是需要鉴定大量植株才能得到阳性株系(Takata.，2012)，获得的转基因植株往往含有一个至多个拷贝的外源基因(Spielmann et al.，1986)。现已证明，多拷贝数的外源基因在转录翻译过程中存在基因沉默的现象，导致其表达不稳定(Lechtenberg etal.，2003)。与稳定表达的方法研究基因功能相比，农杆菌介导的在活细胞内瞬时转化的方法具有明显的优势，但是是一种不稳定，容易引起植物自身的免疫防卫反应而导致现象不明显或无现象(Anand et al.，2008),而且表型持续时间短,不利于长期观察。研究发现，R NA病毒介导的基因沉默(VIGS)可以特异性地沉默目的基因，是一种快速高效地研究基因缺失的一种强大工具，并且已经在多种植物中，尤其是草本植物中获得了成功(Annette and Matthias, 2010)。而由烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的VIGS由于其寄主范围广、构建方便、效果明显等特点，成为目前应用范围最广的病毒载体。在木本植物里，Ye等人发现麻风树是烟草脆裂病毒的宿主之一，运用TRV病毒介导的VIGS可以有效地沉默麻风树中的基因，使植株的表型发生一定变化(Ye etal.，2009)ο油桐作为一种重要的油料树种，从其种子榨取的桐油是墨水、染料、树脂等的原料(Sonntag, 1979)。最近的报道称桐油还可以用来制造生物柴油(Chen et al.，2010)。油桐(Vernicia fordii)和麻风树(Jatropha curcas L)同属大戟科,也可以诱导出TRV病毒介导的VIGS，因此如果能够有一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法，将大大推动杨树的基因研究，但是目前并没有相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种简单、高效、低成本研究杨树功能基因的新方法。
本发明的技术方案是一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法,包括如下步骤:a、构建载体:扩增杨树待研究基因片段，与TRV2载体相连接，转化农杆菌GV3101 ；b、转化:将转后的阳性农杆菌菌液与TRVl菌液按菌体质量比1:1混合；C、转入油桐:通过注射的方法将混合菌液接种在2 3周大的油桐幼苗嫩叶上，看到叶肉组织中有菌液的扩散即可；d、检测:大约2 3周后，观察注射叶片之上新长出的油桐叶片的表型变化，并检测叶片中TRV病毒的衣壳蛋白基因和转移蛋白基因，检测油桐中被沉默基因的表达情况，最后检测被沉默基因的产物含量，反映基因沉默的程度，最后确定待研究杨树基因的功能。采用本发明方法，仅需要将目的基因的非全长片段连接到TRV2载体上，就可以进行油桐的侵染，不需要周期长的稳定表达步骤和无菌操作，而且能够在短时间内产生表型。本方法简单高效，成本低廉，适合大规模筛选杨树基因的功能。通过这种筛选方式，可以对大量杨树基因的功能进行粗判，为进一步研究这些基因提供依据和方向。
图1:TRV2载体图谱；图2:用带有杨树PD S和CLAl基因序列的病毒(TRV-PtPDS和TRV-PtCLAl)侵染油桐幼叶约20天后，新叶的表现型；图3:退绿的油桐新叶中油桐PDS和CLAl基因的表达量检测的琼脂糖凝胶电泳结果，在不同循环数下(20-35循环)，处理过的植株两种基因的表达量较对照都明显减少；图4:退绿油桐叶片的叶绿素含量测定，与对照相比，两种基因沉默的叶片叶绿素的含量明显减少。
具体实施例方式本发明一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法，包括如下步骤:a、构建载体:扩增杨树待研究基因片段，与TRV2载体相连接，转化农杆菌GV3101 ；b、转化:将转后的阳性农杆菌菌液与TRVl菌液按菌体质量比1:1混合；C、转入油桐:通过注射的方法将混合菌液接种在2 3周大的油桐幼苗嫩叶上，看到叶肉组织中有菌液的扩散即可；d、检测:大约2 3周后，观察注射叶片之上新长出的油桐叶片的表型变化，并检测叶片中TRV病毒的衣壳蛋白基因和转移蛋白基因，检测油桐中被沉默基因的表达情况，最后检测被沉默基因的产物含量，反映基因沉默的程度，最后确定待研究杨树基因的功能。TRV病毒的基因组在天然状态下由两条双链RNA组成，RNAl主要为复制酶和转移蛋白的编码序列，RNA2主要为衣壳蛋白的编码序列。在构建此病毒载体时，人为将RNAl和RNA2分别与植物表达载体连接并命名为TRVl和TRV2。当需要沉默某基因时，只需要将此基因部分序列的PCR产物通过TRV2上的多克隆位点与之连接，然后将TRVl和连接目的基因的TRV2分别转入农杆菌GV3101中一起侵染植物。当两种载体都整合到同一个细胞的基因组中，在35S强启动子的启动下转录出病毒的RNAl和RNA2，这样就将被拆分的病毒基因组重新组合到了一起，使病毒回复活性，而带入的目的基因片段通过RNAi使其内源的基因沉默。下面以毛白杨PtPDS基因和PtCLAl基因为例来说明本发明方法。实施例1杨树总RNA提取和反转录合成cDNA1、杨树总RNA提取以杨树幼叶为材料，将RNA提取中所用的药勺、杵、研钵等均用95%酒精灼烧至冷却后使用。取石英砂一勺于加热器中加热IOmin冷却后使用。1.5mL离心管、塑料制品等均使用经RNase处理(RNase Free )的AXYGEN产品。总RNA 提取按照华舜 Server-SPIN DNA-free Plant RNA Isolation Kit 操作步骤进行:I)在 1.5mL 离心管中加入裂解液(500 μ L RL+100 μ L 10%PVP+10 μ L 2-ΜΕ)；2)在液氮冷冻条件下将杨树幼叶(IOOmg)和石英砂混合快速研成粉末，在液氮完全挥发之前，将粉末全部转移到事先配制好的裂解液中，移液枪快速吹打混匀样品；3)室温放置5min后,全部移入过滤柱中，13400rpm离心5min,将上清全部移入另一个离心管中；4)加入上清液一半体积的W3，混匀后，全部移入吸附柱，12000rpm离心30s，倒掉收集管内液体，将 吸附柱放回收集管中，若总体积超过750μ L，则分多次上柱；5)加入400 μ L RP，室温静置Imin后，离心lmin，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；6)加入400 μ L W3液，室温静置Imin后，离心lmin，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；7)向吸附膜中央加入40 μ L DNase I工作液。室温静置15min后，加入200 μ L RP液。离心lmin。倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中；8)加入600 μ L W3液，离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管中；9)加入250 μ L W3液，静置lmin，离心2min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回
收集管中；10)将吸附柱移入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜正中央加入50 μ L纯水，静置lmin，离心2min。将RNA轻微混匀后，保存于_70°C备用。2、杨树总RNA反转录合成cDNA用TaKaRa One-step RT PCR Kit试剂盒进行反转录,反应体系如表I所示:表I反转录的反应体系
权利要求
1.一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法，其特征在于:包括如下步骤: a、构建载体:扩增杨树待研究基因片段，与TRV2病毒载体相连接，转化农杆菌GV3101 ； b、转化:将转后的阳性农杆菌菌液与TRVl菌液按菌体质量比1:1混合； C、转入油桐:通过注射的方法将混合菌液接种在2 3周大的油桐幼苗嫩叶上，看到叶肉组织中有菌液的扩散即可； d、检测:大约2 3周后，观察注射叶片之上新长出的油桐叶片的表型变化，并检测叶片中TRV病毒的衣壳蛋白基因和转移蛋白基因，检测油桐中被沉默基因的表达情况，最后检测被沉默基因的产物含量，反映基因沉默的程度，最后确定待研究杨树基因的功能。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法。本发明要解决的技术问题是提供一种简单、高效、低成本研究杨树功能基因的新方法。本发明的技术方案是一种基于VIGS系统在油桐中研究杨树功能基因的方法，包括如下步骤a、构建载体；b、转化；c、转入油桐；d、检测。本方法简单高效，成本低廉，适合大规模筛选杨树基因的功能。
文档编号C12Q1/68GK103215367SQ20131015577
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月27日 优先权日2013年4月27日
发明者姜渊忠, 罗克明, 叶胜龙, 段艳娇 申请人:西南大学