专利名称：基于痘病毒成分结合体的拟免疫诱导体，其制备方法和其作为药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于痘病毒成分结合物的多功能拟免疫(paramunity)诱导体，其制备方法，以及其作为药物的用途。
温血动物，尤其是哺乳动物及鸟类，其免疫系统由一个抗原特异性部分和一个抗原非特异性部分构成。这两个部分互相交叉由此而形成一个统一的有机系统。抗原特异性机制负责建立免疫性，而抗原非特异性负责建立拟免疫性。因此，由于历史的和功能的这两方面的原因，防御系统的抗原非特异性部分被认为是拟特异性(paraspecific)免疫系统。直到目前为止，免疫学研究主要关注的是免疫系统的抗原特异性部分，如免疫性如何形成等等。这方面的利用引导着主动和被动免疫接种作用的发展。相反地，免疫系统的拟特异性活性的用于防病和治疗方面的开发尚处于早期阶段。拟特异性免疫系统使得当有机体面对大多数不利的外来物质，传染性病原体，毒素以及有机体自身的畸形细胞等的时候建立起即刻的防御成为可能。在免疫系统的拟特异性和特异性活性之间存在着密切的功能上相互影响的模式，通常包括从首先起反应的免疫系统的拟特异性机制到特异性机制的信息流。用这种方式，在受到某些有害病原体的感染时，有机体的拟特异性防御系统就能够作为一座桥梁直到特异性免疫有时间得到发展。
自从1798年爱德华詹纳介绍了使用从动物(牛或马)中获得的基于痘苗病毒的疫苗对天花的保护性免疫接种以来，已报道的经验性的结果显示，对天花的保护性免疫接种导致那些接种过的人的恢复令人吃惊地迅速，或是当接种时正患病的人不会发生其它的尤其是慢性或复发性感染或疾病的并发症。特别地，它适用于各种发生的疱疹感染，乳头瘤，慢性湿疹以及病理状态的耳，鼻和喉。除此之外，免疫接种过的这些人还显示出普遍的对周围急性传染的抗性的短期水平的提高，类似的现象在对动物痘病的保护性免疫接种之后也注意到了。从这些发现推论出，痘病毒或这些病毒的某些结构成分能在非特异性的水平上正面影响有机体抵抗感染及肿瘤的能力。因为这些非特异性的治疗过程在接种之后立即开始，因此比接种引发的特异性免疫作用要提前5-7天，在1978年A.Mayr将预防免疫接种的这些非特异性影响命名为“拟特异性”。因此，开发这类致拟特异性效应的特殊药物就被称作“拟免疫诱导体”。见A.迈耶，′拟免疫性、拟免疫学方法和预防接种的拟特异性作用′，慕尼黑医学杂志1978，120卷，239-242页；A.迈耶，H.瑞蒂格，H.斯蒂克和M.亚力山大，1979′拟免疫性、拟免疫学方法，拟免疫诱导体，医学进展97，pp.1159-1165，1205-1210。
DE-A-27 14 665和US专利4,191,745号揭示了基于痘病毒的治疗带状疱疹及其它疱疹感染的制剂。在兽药方面，拟免疫诱导体是从纯化的、减毒的和灭活的禽痘病毒和副痘病毒中生产出来的。这些拟免疫诱导体在欧洲国家登记为“DuphapindR”和“DuphamunR”(Pind-AVI)，及“BaypamunR”(PIND-ORF)以用于所有种类的农用及家养动物。拟免疫诱导体PIND-AVI制备于减毒过的禽痘病毒株HP-1，拟免疫诱导体PIND-ORF制备于减毒过的副痘病毒株D-1701。减毒的病毒通过已知的方式，如γ-射线或化学方法如用β-丙酸内酯处理来灭活。
在人类药物中用作免疫刺激剂和提供“辅助免疫治疗”的具有致拟免疫性质的药物是BCG(卡介苗)，左旋咪唑和短小棒状杆菌菌苗(同痤疮丙酸杆菌)。然而，这些制剂在其致拟免疫性方面都不及基于痘病毒的拟免疫诱导体，这可见表1中所列的结果，这些结果是在这些制剂与PIND-AVI及PIND-ORF在VSV幼鼠试验中的比较实验中得出的；见A.迈耶，A.M.巴特纳，S.保拉斯，V.厄尔弗，B.迈耶，R.布鲁纳和K.奥斯特考恩，1986′在不同体内和体外试验中BCG、左旋咪唑、短小棒杆菌和痘苗病毒制剂的免疫刺激(拟免疫)作用的比较实验′，J.Vet.Med.B 33，pp.321-339。
本发明的目的在于提供能用于人畜的治疗应用的基于痘病毒成分的、而且已在药效及其拟免疫接种相关活性方面进行了改善的多用拟免疫诱导体，本发明的另一目的在于提供一种改进的方法用于制备所说的多用拟免疫诱导体，该方法使用新的在细胞培养物中繁殖病毒和/或灭活病毒的技术。最后，本发明的再一个目的在于提供作为药用的基于所说的多用拟免疫诱导体的药物组合物。
本发明因此涉及基于源于具有致拟免疫性的不同痘病毒株的两种或更多种痘病毒成分的结合的多用拟免疫诱导体。本发明还涉及基于各种不同种属的灭活的、减毒过的具有致拟免疫性质的痘病毒的结合的多用拟免疫诱导体。本发明还涉及一种制备多用拟免疫诱导体的方法，在该诱导体中，源于具有致拟免疫性质的不同痘病毒株的两种或更多种痘病毒成分结合在一起。最后，本发明涉及制备本发明的多用拟免疫诱导体的方法，以及用作药物的包括所说的多用拟免疫诱导体的药物组合物。
一个意外的发现是，在本发明的多用拟免疫诱导体中的痘病毒成分的结合，并未使其中单个成分的各自的致拟免疫活性降低，更不用说丧失了。反而可以看到，本发明的多用拟免疫诱导体中的源于多种痘病毒株的痘病毒成分的结合，不仅带来一种效果的加合，而且各自的致拟免疫作用的药效也增加了。实验结果显示，结合了痘病毒成分的多用拟免疫诱导体的作用大大强于它们各自的作用。这种现象事先并未预计到，与传统的单个痘病毒成分制剂相比，这些拟免疫诱导体的效力及其拟免疫相关活性增强了。另一个意外的发现是本发明的多用拟免疫诱导体实际上没有免疫原性，但有非常强的致拟免疫性，其结果是它们可以安全地重复或连续给药。
本发明还基于这样一个意外的发现，即在痘病毒中负责拟免疫接种作用和负责免疫接种作用的结构蛋白的抗原决定簇之间存在着竞争。负责抗原特异性免疫接种作用的抗原决定簇部分的活性下降得越多，拟特异性活性上升得越多，这一点可被以下两点观察证实a)在细胞培养物中超过数百代的传代减毒后，引起了痘病毒的致免疫性的降低，而其拟特异性不但升高了而且在某些痘病毒株中仅在减毒后表现出拟特异性。b)对适宜制备拟免疫诱导体的痘病毒的灭活，优选通过射线照射，加热或pH作用，或最优选的通过在特殊条件下用β-丙酸内酯化学处理之后，使痘病毒失去其致免疫性，而其致拟免疫性却上升了。
本发明的痘病毒成分的结合物在人及兽用药物两方面都适宜用作多用拟免疫诱导体。
术语“痘病毒成分”，在本发明中使用时，包括大量的源于具有致拟免疫性的痘病毒的病毒结构，例如活的(如能复制的)或灭活的新分离出的痘病毒，活的或灭活的源于新分离出的痘病毒的重组痘病毒，活的或灭活的减毒痘病毒，活的或灭活的源于减毒痘病毒的重组痘病毒，以上所列痘病毒的离体包膜及其裂解产物和异常形式的所说包膜，从已被上述痘病毒感染的培养物中通过生物化学和免疫化学方法得到的单个病毒多肽，以及通过原核或真核表达得到的、至少部分是源于以上所列的痘病毒的一种或多种病毒多肽的重组表达多肽。
术语“结合”，在本发明中使用时，既包括源于不同痘病毒株的两种或更多种单个痘病毒成分的混合，也包括很多这样的单个痘病毒成分结合于一条多肽或多肽复合体中。源于痘病毒的成分，例如重组痘病毒，单个病毒多肽或重组病毒多肽(所述重组病毒多肽通过突变或基因操作源于两种或更多种痘病毒株的两种或更多种多肽序列)，将被视为似乎它们是两种或更多种离散的痘病毒成分，尽管事实上所说的多肽序列是构成一条单个氨基酸链的一部分。对于通过任何方式物理地或化学地相互连接在一起的单个痘病毒成分也是同样地处理。
术语“多用”，在本发明中使用时，指的是本发明中的拟免疫诱导体在预防和治疗方面的很多而且是不同的可能用途。如以下所示1)传染性疾病和混合感染，慢性感染，持续复发性感染，以及对化学治疗有抗性的细菌和病毒感染，2)生物体免疫系统的削弱或紊乱，3)新生儿感染的威胁，4)在某些形式的癌症中的辅助治疗和/或癌扩散的防止，5)在内分泌、循环、代谢和神经系统间的平衡的调节。拟免疫诱导体在以下情况时特别适用于预防作用-新生儿免疫力的迅速激活-在预料的紧张场合(迁居，精神紧张，高强度时期等)之前-在入院治疗之前-当有感染的紧急危险时-防止免疫接种的并发症-降低肿瘤和/或癌扩散的危险-支持生物调节-提高强度水平-提高预期寿命-内分泌、循环、代谢和神经系统间的平衡的调节拟免疫诱导体在以下情况时特别适用于治疗作用-免疫能力减弱-病毒性疾病，有治疗抗性的细菌性疾病，传染性疾病-慢性及复发性感染-肿瘤-康复-化学治疗与抗生素治疗-不同病因的肝脏疾病-慢性皮肤疾病-免疫性病因的派生性疾病表1显示在VSV幼鼠试验中多种痘病毒成分和拟免疫诱导体的致拟免疫性效应。所示数字代表效力指数。所应用的程序概述于DE-A-27 14 665。
表2显示在VSV幼鼠试验中多种痘病毒成分的致拟免疫性效力在不同程度的减毒后的增加，使用了灭活的病毒悬液。
表3显示在不同种属中减毒作用对于外周血单核白细胞的干扰素合成的诱导方面的影响。
表4显示与单个成分相比，基于重组痘病毒的多用拟免疫诱导体的致拟免疫性的增强。
图1显示从使用减毒的禽痘病毒HP1，副痘病毒ORF D1701以及HP1与D1701的结合制剂的两种VSV试验中得到的效力指数的比较。
图2显示在铬-51释放试验中，与两种单个成分对NK细胞(天然杀伤细胞)的作用相比，本发明的痘病毒成分ORF蛋白4D9与PIND-AVI的结合物的增强效应。所指的值是两种不同分析的平均值。所用的试验程序描述于上述Mayr 1986年的报道。
作为用于本发明的多用拟免疫诱导体的痘病毒成分，痘病毒种类可以使用新分离出的所谓强毒株，或者也可以是减毒后的减毒形式。因为与未减毒株相比，经过减毒过程的其致拟免疫性增加，而且出于安全性的考虑，所以优选的方案是使用减毒后的病毒株。它包括在细胞培养物中连续传代以繁殖有关的病毒株。使用空斑技术依靠常规的内插式克隆筛选，病毒株因为突变和选择作用会使自己很好地适应培养条件，最后能得到在遗传上均一的病毒材料。在传代的过程中，靠感染各自的宿主(如在鸡，金丝雀等中用cutan方法，划破大鼠皮肤等)来验证减毒的程度。各种各样的鉴定方法都属于已知的技术；见A.迈耶和E.慕茨，1964′痘苗病毒通过在鸡胚成纤维细胞培养物中的连续传代的变化′Zb1.Bakt.Hyg.I.Orig.195，24-35页；A.迈耶，F.哈提格和拜尔，1964′以减毒金丝雀痘病毒培养病毒为基础的抗金丝雀痘病毒疫苗的开发′，Zb1.Vet.Med.B12，pp.41-49；A.迈耶和K.马里奇，1966′强毒性禽痘病毒在减毒病毒的细胞培养和中的减毒程度′，Zb1.Vet.Med.B13，pp1-13；A.迈耶，M.赫林，H.曼尼尔，A.单科，A.扎赫和H.巴斯特德，1981′用新的胃肠道细胞培养活疫苗防治传染性深脓疮的措施′，Zb1.Vet.Med.B28，pp535-552。标准的操作是用几种不同的方法来确定有关痘病毒的减毒的程度。
用来减毒的连续传代通常要进行三次使用空斑最终稀释技术的克隆筛选，它保证了所用的病毒材料是遗传上均一的。以后所提到的所有的痘病毒株都是根据这一原则得到的。
禽痘病毒的减毒过程要求经过200-500代传代，优选方案是至少440代。副痘病毒的减毒过程要进行100-200代传代，优选方案是至少170代，开始于胎羊肾细胞培养物接着传代于胎牛肺细胞培养物以及猴肾细胞株中(如MA，Vero)。MVA痘苗病毒的减毒过程要求经过400-600代传代，优选方案是至少575代。金丝雀痘病毒的减毒过程经过200-500代传代，优选方案是至少390代。根据有关痘病毒的种属差异，每完成100代传代要经过三到五年的时间。这样减毒过程将持续10-20年的时间。
用于本发明的拟免疫诱导体的痘病毒成分的优选的减毒痘病毒是禽痘病毒株HP-1，其在CEF培养物中传代444代；副痘病毒株ORF D 1701，其在胎羊肾培养物中传代135代，在胎牛肺细胞培养物(BEL)中37代，在MA细胞(猴肾细胞株)中传代49代；痘苗病毒株MVA(经过修饰的安哥拉痘苗病毒)，其在CEF培养物中传代572代；金丝雀痘病毒株KP-1，其在CEF培养物中传代535代。这些病毒的样本以冻于的形式保藏于欧洲动物细胞培养物中心(ECACC)，PHLS应用微生物学研究中心，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，英国。各自的保藏号分别是V94012709，V94012706，V9401 2707和V94012708；还可见后面的内容中对保藏的微生物的说明。有关保藏的病毒的更多的说明可以参见病毒保藏物的登记表。
另外，利用其它的具有致拟免疫性的减毒的痘病毒株来制备本发明的多用拟免疫诱导体也是可行的。
有各种各样的方法适用于制备本发明的重组痘病毒。一种优选的方法是用两种不同的、具有致拟免疫性的痘病毒株的同时感染来激发重组现象，即一种病毒的一部分与致拟免疫性有关的编码区域导入另一种不同的痘病毒的基因组中。随后，联合了两种不同痘病毒株的致拟免疫活性的重组痘病毒可用空斑最终稀释传代及合适的筛选过程确定。例如，禽痘病毒，痘苗MVA病毒，金丝雀痘病毒或副痘病毒的各种各样的组合都适合于同时感染。
另一种制备重组病毒的方法利用了遗传工程技术与同源重组方法。为此首先必须确定痘病毒的有关致拟免疫性的编码区，这个可用现有的技术方法完成。
例如，致拟免疫性结构蛋白可以通过使用生物化学或免疫化学的方法以及根据其致拟免疫性质分离出来，例如使用下面所述的体外或体内试验可以做到这一点。一旦致拟免疫性结构蛋白被确定，完整蛋白或其蛋白酶水解或化学裂解产物的N-端序列就可测出，获得了氨基酸序列的信息之后，就可利用传统的杂交技术或多聚酶链式反应(PCR)使用恰当设计的寡核苷酸探针在合适的基因库中筛选出相应的DNA区域。另一种可能的确定方法是通过解链条件下的杂交，使用已知的某种痘病毒的与致拟免疫性蛋白特异相关的DNA样品，分离出其它痘病毒的相应的同源DNA区域，它就可能是编码致拟免疫性蛋白的基因。在此过程中，使用与已知序列同源的相应的探针，也可以将传统的筛选方法替换为PCR的方法。
与某种痘病毒的已知的、编码致拟免疫性蛋白的DNA区域同源的其它痘病毒的DNA区域，还可以通过各种有关痘病毒基因组的限制性酶切图谱方法与具有相似的限制酶酶解方式的区域的比较等方法来确定。有关这种限制性酶切图谱的比较的描述可见F.拉非和D.伯格′用限制性内切酶对传染性深脓疮病毒基因组的比较′，Arch.Virol.84，pp.283-289，(1985)。
又一种确定编码致拟免疫性蛋白的DNA区域的方法是使用能识别具有致拟免疫性质的蛋白的单克隆或多克隆抗体从基因库中进行筛选。例如，这种方法曾被用来确定编码具有致拟免疫性的14KD蛋白(融合蛋白)的兔痘病毒基因。
在编码致拟免疫性病毒蛋白确定和克隆之后，就可以在合适的载体中用同源重组的方法特异性地制备本发明的重组痘病毒。例如，对于外源基因，一个合适的插入位点就位于胸腺嘧啶激酶基因之中，因为这个基因对于痘病毒并非必需基因。这种方法包括将一个转移载体转染到已感染待重组的痘病毒的细胞之中，该转移载体上带有源于另一种具有致拟免疫性的痘病毒的、可通过同源重组导入待重组痘病毒中的外源基因片段。为了使同源重组的频率尽可能地令人满意，优选的转移载体带有一个选择标记基因，以及源于待重组的痘病毒的同源旁侧序列。然后进行结合了两种不同痘病毒株的致拟免疫活性的重组痘病毒的鉴定，再一次地使用空斑最终稀释传代及合适的筛选方法，如使用单克隆或多克隆抗体进行单个空斑的免疫化学法检测。插入的DNA也可以用杂交技术检出，如通过“斑点印迹”杂交方法。插入基因的表达既可以通过使用单克隆或多克隆抗体对相关的结构蛋白的检测来直接检测，也可以通过各种方式间接检测，如实验动物(VSV攻击试验)和细胞培养物(细胞培养物攻击试验)的免疫-拟免疫反应，以及体外试验的各种参数(干扰素的诱导，某种白细胞介索的形成，CSF，TNF，等等)。最后得到一种可用作本发明的痘病毒成分或用作多用拟免疫诱导体的重组痘病毒。
减毒后的痘病毒特别适合于制备本发明的重组痘病毒，不仅因为它们的安全性而且因为它们很好的致拟免疫效力。
用来生产本发明的多用拟免疫诱导体和药物组合物的减毒后的重组痘病毒既可以是活的形式也可以是灭活的形式，优选的是使用灭活了的重组痘病毒。
适于用作痘病毒成分的活的或灭活的减毒后的重组致拟免疫性痘病毒的例子有，带有禽痘病毒和副痘病毒的编码致拟免疫性蛋白基因的MVA病毒，带有MVA病毒，禽痘病毒和副痘病毒的编码致拟免疫性蛋白基因的减毒后的金丝雀痘病毒，以及最多样的减毒痘病毒株的“vice versa”结合体。
上面提到的用作本发明的多用拟免疫诱导体的痘病毒成分的痘病毒的繁殖可以在初级或二级细胞培养物以及永久性细胞株中进行。用于本发明中的痘病毒的繁殖和培养按照目前已知的技术进行。例如，减毒禽痘病毒可以在初级或二级鸡胚成纤维细胞(CEF培养物)和永久性CEF细胞(鸡胚成纤维细胞；细胞系)的培养物中繁殖。在初级CEF培养物中繁殖是优选的。又如，减毒副痘病毒，可以在小羊肾培养物或牛胚肺(BEL)培养物(初级或二级培养物；例如按如下方法制备，见S.H.马丁，P.C.安德利斯，N.B.达比，1957′家养和实验动物组织的体外培养′Am.J.Vet.Res.18，pp.932-941)，vero和MA细胞(非洲绿色长尾猴肾细胞株；ATCC CCL 81和Microbiolgy Associated 104)中繁殖，优选在vero细胞中繁殖。再如MVA痘苗病毒可以在初级CEF培养物或CEF细胞株(细胞系)中繁殖，繁殖于CEF培养物中是优选的。金丝雀痘病毒能在CEF培养物中及永久性CEF细胞中繁殖，优选方案是繁殖于初级CEF培养物中。
对于减毒禽痘病毒，MVA痘苗病毒和减毒金丝雀痘病毒，其繁殖优选在能接受所说病毒的哺乳动物或鸟类的初级或二级培养物中进行。在初级或二级CEF培养物中的繁殖，较适宜的温度是33℃-39℃，最优选的是在37℃。CEF培养物按照如下传统方法制备，孵育了10-12天的鸡胚胎，在去掉尾部和头部(成纤维细胞培养)之后，躯干和四肢用胰酶消化，在相应的适宜细胞培养的玻璃或塑料容器，如青霉素小瓶中，用静止方式或转动方式培养(滚动培养物)。最优选的方案是对标准技术作一点修改，使用完整的胚胎，包括头部和尾部(混合的细胞悬液，能收获到更多的具有更加稳定的质量和数量的致拟免疫性的病毒)，初级培养物最好能用胰酶作一下预处理(10-15分钟，弃去上清)，然后进行45-60分钟的正式的胰酶消化。优选的导入培养物时的培养基是由基本培养基+10％乳清蛋白水解物+10％BMS(血清替代品)组成；维持培养时的培养基仅仅由MEM组成。细胞培养物用病毒感染是在快到“密集化”(细胞铺满80-100％)时进行，即贴壁后的1-3天，优选方案是贴壁后20小时，培养于33-39℃，最优选是37℃。
优选的感染CEF培养物的病毒是有关减毒痘病毒株的空斑纯化过的病毒材料，优选的感染剂量是107.0TCID50100ml培养基(TCID50＝50％组织培养物被感染时的剂量)。
为了从细胞培养物中得到用于多用拟免疫诱导体的减毒痘病毒的悬液，将感染后的细胞培养物于33℃-39℃，优选37℃培养。病毒材料的收获在1-10天之后，优选的方案是3-4天之后；而且最好是当5-100％的细胞都已被破坏时收获，最优选是当还有5-60％的保持球状、圆形的细胞而40-95％的细胞已裂解时收获。取出足够量的病毒悬液按照国际标准进行例行的细菌学，病毒学和真菌学检查其污染控制情况。接着将细胞储存于4℃，-20℃到-80℃或更低的温度，优选的温度是-80℃。在此温度下将培养物保留至细菌学，病毒学和真菌学检查完成。如果所有的检查都符合安全标准就可将病毒解冻。这一步将破坏那些仍然完整的细胞并释放出结合在细胞上的病毒，因此病毒的滴度将上升。优选的破坏细胞的方法是重复冻融，最优选的方法是用超声波处理。接下来进行另一次无菌程度的检查及其感染滴度的检查。
培养及繁殖减毒副痘病毒的程序与上述有关减毒禽痘病毒，痘苗病毒及金丝雀痘病毒的程序相同。仅有的区别是细胞培养物使用的是初级或二级小羊肾培养物，胎牛肺细胞培养物或各种细胞系如Vero细胞或MA细胞(这两种细胞系都取自于猴胚胎的肾脏)。Vero细胞是制备副痘病毒悬液的首选培养物。
在制备根据本发明的多用拟免疫诱导体时，除了来源于流产合成的病毒颗粒的异常包膜之外，使用非重组的或重组的痘病毒的离体的包膜作为痘病毒成分也是可能的。
制备病毒包膜的优选的方案如此是将病毒包膜从病毒核心(核衣壳)上割裂下来，即按前述方法获得的痘病毒悬液在还原条件下温育于去污剂中，如此割裂后的病毒颗粒用密度梯度离心的方法被分离成病毒核心与病毒包膜。
另一种优选的回收痘病毒的致拟免疫性包膜或异常形式的这种包膜的方法是，感染那些对各种痘病毒有不相容性的细胞培养物，一个这种类型的例子是在鸡胚成纤维细胞中传代减毒ORF病毒。在不相容细胞培养物中各种痘病毒将进行一次不完全的繁殖循环。换句话说，在感染细胞的病毒原质区内没有完整的具有感染性的病毒颗粒装配出来。病毒的已合成的流产的前体(“空包膜”，不完整的形式，异常形式，等等)已经获得与致拟免疫性有关的结构蛋白。它们被分泌到培养基中或者可以通过裂解感染的细胞释放出来，然后使用上述的方法进行分离，纯化和浓缩。
优选方案是使用前述的减毒形式的痘病毒来制备上述的病毒包膜和异常形式的病毒包膜，一种制备病毒包膜的优选方法在下面的实施案6中有具体描述。
将病毒多肽作为本发明的痘病毒成分也是可行的。这种病毒多肽是具有致拟免疫性质的正常的病毒结构蛋白，可用各种方法制备，通常是从已感染了痘病毒的细胞培养物中纯化。这些细胞培养物最好使用以上描述过的，那些对痘病毒相容和不相容的宿主细胞都可以使用。病毒多肽用传统的生物化学或免疫化学方法纯化，如用单克隆抗体进行免疫亲和层析。用这些方法纯化的优选的蛋白例如包括分子量为14KDa(融合蛋白)或30KDa(吸附蛋白)的痘病毒结构蛋白。融合蛋白刺激吞噬作用，干扰素合成及白介素的形成。吸附蛋白，它在所有的正痘病毒中都是相同的，能刺激NK细胞，粒细胞及巨噬细胞并用效应细胞来形成干扰素和某些白介素。
致拟免疫性病毒多肽也可以按如下方法直接回收，裂解痘病毒颗粒，分离，分部分离(如靠分子量)，纯化和浓缩(如使用密度梯度离心，超离心，层析，制备SDS-PAGE电泳或其它传统方法)。实施例8提出了一套纯化从制备SDS聚丙烯酰胺凝胶中得到的病毒多肽的方法。
在重组病毒的制备中已经提到过的，编码致拟免疫性蛋白的基因区域确定之后，克隆和鉴定后的DNA片段也能用来制备重组病毒多肽。制备它们的适当的表达系统包括原核或真核表达的质粒载体，噬菌体载体或病毒载体，例如适宜在E.coli，酵母或哺乳动物细胞中表达的载体。那些适于哺乳动物细胞表达的载体尤其适用。
使用传统的基因工程方法(A.迈耶′病毒学方法′，vol.3，1989年由FischerVerlag在Jena出版)将DNA片段转移到噬菌体或质粒载体或者是基于病毒的载体之中，然后在合适的宿主细胞中进行表达。表达蛋白可用传统方法纯化，构成有关痘病毒成分结合体的初始材料。重组体表达不仅能使编码致拟免疫性病毒多肽的DNA得到表达，而且这样的DNA片段还可以克隆到以融合蛋白形式表达病毒多肽的表达载体中去。许多多肽序列适于作为融合蛋白成分与病毒多肽部分融合，例如来源于细菌β-半乳糖苷酶(lacZ)的序列；编码这些成分的DNA片段通常已经存在于用来表达的载体系统中。然而，适于用作本发明的痘病毒成分的融合蛋白还可以是两种或更多种不同的源于不同的致拟免疫性痘病毒株的病毒多肽的融合体。后一种融合蛋白是通过以适当的顺序和正确的阅读框架将编码所说多肽的两种或多种DNA片段结合起来而得到，并在一条多肽链中联合了不同痘病毒的致拟免疫性多肽区。
可能需要使用进一步的纯化方法来使多用拟免疫诱导体的痘病毒成分符合人用药物的要求。例如，可用已知的进一步的纯化方法，包括超速离心，密度梯度离心等等，对制剂进一步地提纯。
痘病毒株或重组病毒株的灭活有各种处理方式，如热处理，物理或化学方法处理或pH作用处理。优选的灭活方式是通过γ射线照射或用β-丙酸内酯处理，而且有关的处理过程必须在不损坏致拟免疫性质的条件下完成。
灭活减毒痘病毒的最优选的实施方案是在pH范围为8-9之间用β-丙酸内酯处理。β-丙酸内酯的处理最好在以下条件下进行用NaHCO3(8.8％水溶液)将病毒悬液的pH调节到8.6。预先用蒸馏水1∶10稀释的β-丙酸内酯以0.5∶100的比例加入到病毒悬液中。这相当于β-丙酸内酯的0.05％稀释液，悬液在冷藏温度(4℃-8℃)下搅拌1小时，在37℃搅拌4小时，然后在冰箱里储存大致12-18小时(过夜)。灭活的悬液以2600rpm离心10分钟纯化，然后检查其pH，如果需要再做调节。
灭活的证明是用足够体积的经处理材料的试验样品感染CEF培养物。如果感染之后的9天之内没有典型的细胞病变，即可作出灭活已经完全的结论。如果存在任何残余的未灭活病毒的怀疑，将进行三代亚传代。除了用电子显微镜之外，另外还要在合适的培养物或合适的培养基中进行病毒，细菌或真菌的污染检查。
痘病毒成分的溶液或悬液最好在纯化之后冻干，在冻于之前最好在痘病毒成分中加入稳定剂。在涉及的是减毒痘病毒的悬液时，将稳定剂如KollidonR，MolicoR(低脂奶粉)或明胶加到痘病毒悬液中。最优选的实施方案是加入终浓度为2.5％的琥珀酸酸化的明胶(出品于Hausmann of St.Gallen，Switzerland)。在明胶(浓度50％)加入之前，其pH必须调节到8.0。这也适用于其它的稳定剂。
完成的制剂被分成份，例如2ml1份，并且冻干。在储存温度为4℃-8℃或更低的时候，冻干的多用拟免疫诱导体将保持稳定达至少10年。在这些条件下，用VSV攻击试验或细胞培养物攻击试验确定冻干粉剂的效力单位在至少10年之后仍未变化(术语“效力单位”将在下面定义)。在最后储存之前，冻于粉剂的纯度还要进行一次细菌学，病毒学和毒理学检查。
为了增加其效力，按上述方法生产的用于本发明的多用拟免疫诱导体的痘病毒成分彼此以各种混合比例结合。对于减毒痘病毒混合比例最好是1∶1。结合也可以是如下的混合比例1、禽痘病毒和副痘病毒5∶1-1∶5，优选是2∶1-1∶2，2、禽痘病毒，副痘病毒病毒和MVA痘苗病毒6∶3∶1-1∶3∶6，优选是6∶3∶1，最好是1∶1∶1，3、禽痘病毒，副痘病毒，MVA痘苗病毒和金丝雀痘病毒诱导体的比例是1∶1∶1∶1。相应的混合比例也可用于本发明的其它痘病毒成分。然而，其它的混合比例同样也适合于本发明中的多用拟免疫诱导体制剂。
用于制备本发明的多用拟免疫诱导体的痘病毒成分的结合可以在其制备过程中的各个时间点进行，优选的是在它们的灭活处理之前，冻干之前或冻干之后。若将痘病毒用作痘病毒成分，则其优选的结合时间是在进行灭活处理之前。
根据本发明的多用拟免疫诱导体或单独的痘病毒成分的效力能用各种方法确定幼鼠的VSV感染模型被用于体内证明；见Mayr等人1986年的工作(文献同上)。同时这个模型还能用于分析效力单位(UE/ml)。表1代表在VSV模型中不同稀释度的PIND-AVI和PIND-ORF的效力。某一制剂或其稀释液的效力指数，可用如下公式计算 a＝试验组的死亡百分比b＝对照组的死亡百分比效力指数为至少20的稀释液中每0.1ml仍含有1UE(每只幼鼠的感染剂量)，或10UE/ml。在PIND-AVI的最终滴度为1∶16的例子中，相应的这一批中含有160UE/ml。
有多种试验方法用作根据本发明的多用拟免疫诱导体或单独的痘病毒成分的效力的体外证明a)在4小时铬-51释放试验中用PIND-AVI处理后24小时的腹膜NK细胞的活力；Mayret al.1986，文献同上，
b)处理后8小时鼠血清中的集落刺激活力；见G.沃尔夫，1986“用得自痘病毒和其它微生物的诱导物预处理后鼠血清中的集落刺激活力”；Czerny 1990，文献同上，以及c)外周血单核白细胞的干扰素的合成；见M.斯滕马索和G.沃尔夫，1990′用不同病毒制剂体外刺激后通过单核白细胞的干扰素的合成′，J.Vet.Med.B 37，pp.321-331。
然而，也可使用替代的检测方法，例如在L929细胞毒性试验中测量预处理过的兔子或小鼠的肿瘤坏死因子(TNF)的活性，带有Aujeszky病毒的成年小鼠中的攻击试验，各种动物血清的集落刺激活力(CSA)的确定以及“FACS analyzer”(微粒摄入，“呼吸爆发”)中人或动物的粒细胞活性的测定。
用以上方法获得的多用拟免疫诱导体可以用作制备作为药用的药物组合物的起始产物。为这一目的，根据最初的体积，在冻于粉剂中加入标准的药用载体，优选的是无菌去热源的蒸馏水。此配剂适于肠胃外给药(肌肉或皮下)以及局部给药。根据本发明的多用拟免疫诱导体是无毒的，去热源的而且当肌肉注射时不会引起不正常的接种后反应。
根据本发明的药物组合物还包括其它的配剂。局部给药的配剂例子包括口含片，软膏，栓剂，鼻滴剂，鼻喷剂，等等。肠胃外应用的例子包括注射针剂。它们都可用已知的工艺生产。
本发明的药物组合物的另外的合适的配剂包括直肠或阴道栓剂。它们的任一种形式都能用来治疗痔疮和阴道炎或其它的阴道损伤。在生产过程中必须注意确保载体成分，例如那些有蛋白水解活性的，不会对无菌及稳定性带来不利的影响。
用作预防的多用拟免疫诱导体优选给药方式是24小时内1-3次。若用作治疗，则根据其特定情况下的严重程度，在3-5天的时期内，或在直到临床症状减轻的时期内，每天进行1-3次处理。剂量则依赖于待治疗的症状和所选择的给药方式。在肠胃外给药中标准剂量通常是2ml，一个剂量中含有至少160UE。当然，为了适应个别的情况也可以改变剂量及应用方式。
下面的实施例是为了更好地阐述本发明。
实施例1用来制备本发明的痘病毒成分的初始材料是禽痘病毒株HP1，其分离于普遍性患病的鸡中，在CEF培养物中传代440代减毒。使用空斑稀释技术进行克隆筛选，并在减毒传代的过程中以定期的时间间隔进行免疫原性及致拟免疫性的试验。第440代CEF培养物用来制备本发明的痘病毒成分，在最后三代传代中再次用空斑技术进行克隆筛选，以确保获得遗传性均一的材料。表2强调了来自于细胞培养物中传代的早期和晚期的病毒材料在致拟免疫效力方面的区别。
CEF培养物的制备在标准技术上作了一点修正，即以完整的形式培养鸡的胚胎(包括头部和尾部)；见A.迈耶，P.A.巴赫曼，B.比布里克和G.威特曼，1974′病毒学方法′，vol.1，由VEB Gustav Fischer Verlag of Jena出版。标准技术的修正还包括使用全合成的培养基，组分包括10％BMS(血清替代培养基)，10％乳清蛋白水解物和MEM(基本培养基)。密度接近90％的单层细胞培养物，被经过440代传代的感染滴度为107.5TCIID50/ml的病毒株HP1感染。曾使用过107TCID50/100ml的感染剂量。MEM(不加抗生素)用作维持性培养基。当细胞层有接近5-100％被病毒感染时，开始收获病毒。摇晃培养瓶，使残留的细胞层都松散开来。用超声波处理含有细胞的病毒培养基使仍保持完整的细胞破碎(用一个40-50watt Branson sonifier处理3分钟)。
从收获的病毒中取样进行无菌及感染性检查。仅当收获的病毒没有被污染(如被细菌，病毒，真菌，支原体等污染)及感染滴度不低于107.25/ml时方才进行下一步处理。在下一步处理之前收获的病毒可以储存于+4℃或-80℃。
在使用β-丙酸内酯灭活之前将病毒材料的pH调节到8.6。所加β-丙酸内酯的浓度为0.05％。接着反应混合物在冰箱中振荡1小时灭活，然后在培养箱中(37℃)保温4小时。病毒悬液在冰箱中静置过夜，灭活过程结束。灭活的病毒悬液于2600rpm离心初步纯化。回收的诱导体命名为PIND-AVI，储存于+4℃或-60℃，当控制检查完成后冻干。
得到的减毒痘病毒悬液的特异性，纯度及无害性试验满足欧洲药典的如下要求1.标准方法的电子显微镜检查，能看到典型的痘病毒颗粒，有些是空的。制剂中没有其它的微生物结构。
2.关于微生物污染的标准检查揭示，制剂中不存在其它的病毒，细菌，真菌和支原体。
3.按照欧洲药典的指南试验毒性，致畸生和热源性，没有正的结果发现。
4.检查未灭活的病毒残留物以标准方式在CEF培养物中滴定完成的痘病毒制剂。在3代亚传代中残留病毒为零。
PIND-AVI痘病毒成分的致拟免疫作用的确定使用VSV感染模型。表1列举了得到的结果。
实施例2一种根据本发明的痘病毒成分在FCE培养物中用减毒的MVA痘苗病毒制备，制备如实施例1。从表2中可以看出，经过500代培养物传代后病毒株的致拟免疫活性增加了。有关纯度，无害性，特异性及效力的试验如实施例1中所概述的那样完成。得到了与实施例1中相同的结果，这些结果总结于表2。
实施例3按照实施例1中概述的方法，从CEF培养物中制备了得之于减毒金丝雀痘病毒株KP1的痘病毒成分。从表2中可以看出，经过至少390代培养物传代后病毒株的致拟免疫活性增加了。有关纯度，无害性，特异性及效力的试验如实施例1中所概述的那样完成。得到了与实施例1中相同的结果，这些结果例举于表2。
实施例4按照实施例1中概述的方法，从MA或vero细胞(永久性猴肾细胞系)中制备了得之于减毒副痘病毒株D1701的本发明的痘病毒成分。从表2中可以看出，经过至少170代培养物传代后病毒株的致拟免疫活性增加了。有关纯度，无害性，特异性及效力的试验如实施例1中所概述的那样完成。得到了与实施例1中相同的结果，表1和2总结了从单个成分(实施例1-4的产物)中得到的结果。
实施例5本发明中的多用拟免疫诱导体的制备，按1∶1的比例在一份制剂中混合任意两种实施例1-4中所描述的减毒的，灭活的痘病毒悬液。制备痘病毒成分PIND-AVI和PIND-ORF的混合物，以及痘病毒成分禽痘病毒HP1和副痘病毒ORF D1701的混合物。正如表1和图1中所见，诱导体的结合增加了其致拟免疫效力。(如果效果是加合性的，单个的稀释液的效力指数及其UE/ml数都不会变化。)这点可从两个参数的升高清楚地看出来，上升的幅度分别为20-40％(分别与1∶8的D1701和HP1的稀释液相比的结合体的效力指数)和200-400％(分别与D1701和HP1的稀释液相比的结合体的UE/ml数)。有关纯度，无害性，特异性及效力的试验如实施例1中所概述的那样完成。除了升高的拟特异性活性之外，得到了与实施例1中相同的结果。
实施例6痘苗病毒，禽痘病毒HP1和副痘病毒ORF D1701如实施例1中那样减毒，在测定外周血液中的单核细胞中干扰素的诱导合成的试验中，比较了它们在致拟免疫作用方面的影响的削弱。结果总结于表3中。
实施例7为了制备本发明的痘病毒成分，将痘苗病毒MVA和副痘病毒ORF D1701悬液用PBS调节到蛋白浓度为2mg/ml，与1％Nonidet P-40(NP-40；Sigma)和50μl的2-巯基乙醇在37℃保温60分钟。在加入3.5ml36％(w/v，in PBS)的蔗糖溶液作为铺垫之后，在超速离心机中用Beckmann SW-60 Ti-Rotor于4℃，40,000rpm(230,000g)离心45分钟，得到病毒核心沉淀。离体的病毒包膜留在上清中。上清对PBS充分透析，然后用于制备本发明的多用拟免疫诱导体。
实施例8为分离单条带的病毒蛋白，制备了12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶。所用的缓冲液和溶液见U.K.莱姆利(1970)，′在装配噬菌体T4的头部中结构蛋白的裂解′，自然227，pp.680-685，和A.迈耶，P.A.巴赫曼，B.比布里克，G.威特曼，1989，′病毒学方法，Teil III生化和生物物理方法′，由Gustav Fi scher Verlag，Jena出版。痘苗病毒MVA悬液和副痘病毒ORF D1701悬液于50μl的样品缓冲液中煮沸。每个胶槽中加入50μl的样品，相当于10μg的病毒量。接下来在50V和20-30mA电泳将近16小时，病毒蛋白被分离开。为鉴定蛋白质，同时电泳的还有两个分子量标准物(MW SDS-70L kit和MW SDS-200kit；Sigma公司生产)，覆盖范围为14,300-205,000 daltons。分开之后，切下有标准蛋白条带和一条被分离的病毒蛋白条带的胶进行银染，定位。剩下的蛋白胶条同时于4℃保存于电极缓冲液中。以银染的胶作为参考，用解剖刀将分子量范围在14KD的蛋白条带都切下来。6块这样的胶的碎片(体积接近0.5ml)被放入一台Extraphor电泳浓缩仪(Pharmacia LKB公司制造)上的小孔中。各个蛋白条带经过室温下100V的30分钟电泳，从胶块上洗脱下来，同时沉淀于“高盐缓冲液”中。取出沉淀的蛋白，合并，于10,000rpm离心30分钟。沉淀溶解于1ml PBS，透析过夜，透析袋的排阻分子量为8KD，然后制剂在无菌条件下于10,000rpm离心30分钟，再按如上所述的工艺制备多用拟免疫诱导体。
实施例9各种痘病毒成分接受VSV试验比较其致拟免疫性质。痘病毒成分PIND-AVI和PIND-ORF，以及用免疫亲和层析法从细胞培养物中纯化出来的ORF蛋白4D9，与重组痘病毒PIND-AVI＋ORF 4D9进行了比较，在后者中用同源重组方法导入了编码0RF 4D9多肽的DNA片段。正如表4中所见，多用拟免疫诱导体的效应大大超过了单个成分的效应。
实施例10与单个成分相比，结合的多用拟免疫诱导体的效应的增加在铬-51释放试验中得到了验证；见Mayr等人1986年的报道(文献同上)。比较涉及到痘病毒成分PIND-AVI和ORF蛋白4D9(后者纯化于感染副痘病毒ORF D1701的细胞的细胞上清)与PIND-AVI和ORF蛋白4D9的结合体。图2显示了得到的结果。
关于微生物保藏的说明(细则13之二) PCT/RO/134表(1992年7月)
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病毒保藏登记表
病毒保藏登记表
病毒保藏登记表
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权利要求
1.基于痘病毒成分的拟免疫诱导体，其特征是拟免疫诱导体包括来源于具有致拟免疫性的不同痘病毒株的两种或更多痘病毒成分的结合体。
2.根据权利要求1的拟免疫诱导体，其特征是痘病毒成分是痘病毒。
3.根据权利要求1的拟免疫诱导体，其特征是痘病毒成分其中的一种或多种是禽痘病毒HP-1，副痘病毒ORF D1701，痘苗病毒MVA，或金丝雀痘病毒KP-1，其ECACC保藏号分别为V94012709，V94012706，V94012707，和V94012708。
4.根据权利要求1的拟免疫诱导体，其特征是痘病毒成分是从痘病毒中获得的病毒包膜或异常形式的病毒包膜。
5.根据权利要求2或3的拟免疫诱导体，其特征是痘病毒已经灭活。
6.根据权利要求5的拟免疫诱导体，其特征是痘病毒的灭活是用β-丙酸内酯在pH8-9的范围内处理。
7.根据权利要求1的拟免疫诱导体，其特征是痘病毒成分是从已经感染痘病毒的培养物中用生物化学或免疫化学方法得到的单个的病毒蛋白。
8.根据权利要求1的拟免疫诱导体，其特征是痘病毒成分是通过原核或真核表达回收的重组病毒多肽，该重组病毒多肽至少部分是来源于一种或多种痘病毒的病毒多肽。
9.根据权利要求2，4，5，6，7或8任一项的拟免疫诱导体，其特征是痘病毒是新分离出来的。
10.根据权利要求2，4，5，6，7或8任一项的拟免疫诱导体，其特征是痘病毒是减毒过的。
11.根据权利要求9或10的拟免疫诱导体，其特征是痘病毒是重组的。
12.制备拟免疫诱导体的方法，其特征是结合来源于具有致拟免疫性的不同痘病毒株的两种或多种痘病毒成分。
13.基于痘病毒成分结合体的拟免疫诱导体在制备药物组合物中的应用。
14.痘病毒株禽痘病毒HP-1，副痘病毒ORF D1701，痘苗病毒MVA，或金丝雀痘病毒KP-1，其ECACC保藏号分别为V94012709，V94012706，V94012707和V94012708。
全文摘要
本发明描述了多用拟免疫诱导体，其基于源于具有致拟免疫性的各种痘病毒的痘病毒成分的结合体，并与公知的拟免疫诱导体相比改善了其效力和拟免疫相关活性。本发明还涉及制备这些拟免疫诱导体的方法以及这些拟免疫诱导体作为药物的应用。
文档编号C12N7/00GK1142187SQ95191784
公开日1997年2月5日 申请日期1995年1月17日 优先权日1994年2月23日
发明者安东·迈耶 申请人:安东·迈耶