专利名称：水通道蛋白1启动子荧光素酶报告基因的重组与药物筛选应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及人水通道蛋白I(AQPl)启动子荧光素酶报告基因重组、构建AQPl启动子涎腺细胞模型及药物筛选的应用。
背景技术：
舍格伦综合征是一种侵犯涎腺、泪腺等外分泌腺为主的自身免疫性疾病。主要临床表现为唾液分泌减少，导致唇干、皲裂、猖獗龋、口腔黏膜溃疡、真菌和病毒感染并伴有灼痛，异物感等。随着人们生活方式的变化，其发病率越来越高，在成人发病率达0.5%-3.0%，好发于中老年女性，男女比例为1: 9。到目前，尚无有效的治疗药物，因此开发有效的舍格伦综合征治疗药物具有重要的现实意义。近年来国内外研究显示水通道蛋白(aquaporins, AQPs)与舍格伦综合征的发病密切相关，特别是水通道蛋白I(AQPl)是唾液分泌过程中的关键基因，它广泛表达于颌下腺、舌下腺和腮腺中；高表达的AQPl与唾液的分泌量密切相关，成为治疗舍格伦综合征重要的分子靶点。AQPl表达受启动子区域的调控，在此发明中，我们利用基因重组技术，采用PCR的方法，从人类基因组中扩 增出了 1868bp的AQPl启动子序列，并将其克隆到荧光素酶报告基因载体上。将荧光素酶报告基因的重组质粒转染到腺样囊性癌(ACC-M)中，研究中药成分对AQPl启动子表达的影响，筛选出人参和西洋参成分能够显著激活AQPl启动子的活性。本发明以水通道蛋白I为靶点，构建涎腺细胞AQPl启动子模型是筛选哪些中药成分能治疗舍格伦综合征的关键步骤，并筛选出人参和西洋参成分能显著激活AQPl启动子的活性，为开发舍格伦综合征治疗药物提供实验依据。
发明内容
本发明是基于舍格伦综合征的典型临床表现和治疗难点，通过构建AQPl启动子荧光素酶报告基因，构建涎腺细胞AQPl启动子模型，，应用于药物筛选，对于开发治疗舍格伦综合征的药物具有重要的应用价值。利用基因工程技术，通过NCBI数据库查找AQPl启动子序列，应用primerpremier5.0设计AQPl启动子的引物，以人类基因组为模板进行PCR。扩增得到的片段与PMD18-T载体连接，经酶切鉴定并测序后，将片断亚克隆到pGL2载体上，构建pGL2-AQPlp重组质粒，通过酶切鉴定和测序进行验证，实现了 AQPl启动子-Luc表达载体的重组。随后将重组质粒转染至ACC-M细胞中，用于中药的筛选，研究发现一定浓度的人参和西洋参成分可使AQPl启动子活性增高。这段启动子的氨基酸序列为:tacaggcact taggggaatg aatcttcccc acctgcagcc ccagcaaaca cacaccaggc 60tggtccctgg caattcaccc caagagccag gccacagctg ggcagagggg tggccagtaa 120
cagctggtgt cattctctgc aggatagccc ctggacaaga ggcataagac ccactcatcc 180ttgccctgcc ccaggcacac ttagaaaagt cctctcaccg ggcctcagtt tcccacctat 240aaatgggaag atgccaacac gcccgagtgg gactgtggtg gggcaggcag gaggtgggag 300gagagcccag atcatcccag gccttcccta ggggacgcag ggggaccctc ccttctgggc 360ctggttcttc cagcacgttc catgcagcag gcaagagggc caggcccagg ggttcctgac 420agcttgctgg ccctggagtc cagattcttg tttgttggct ggcgctaggc ctctggattg 480gagatgcccg gggcacaggc ggcccacggg gatctgcagc agggcctcgg cccctccctc 540tgcaggggct cgtctggtcc ctcccgctct ctgcctctcc tcatttatct ctccctttct 600gcttcttggc tctgggtcca gtcctatctc ccctgtttca gtttgtcttt tcctagccct 660ttgcgctctc tctgtctctc tcagccctgc ttgtctcact gtctctggct gggggatctg 720tctctttcac ttccactttt gctctatttc cctgctactg tctttccttt ctccttgtct 780gtctcttctc ctcccctcag ccagcatctg tctgtctctg cctttctctc ctgctccctc 840
cctccctcct ctccagcacc ttccaatgcc aggtggggct gccattcctt ccaccttccc 900agtgacccgc cagtgtgact gccttgagag gaaagtccta aactgtccct atcttcacca 960gcctgccctc aaatcattgg ttcaaatcgc tgtcgagaag tttgggagct cccagggcgg 1020gggctttcta acagctctgc ctagctcggg cctgccctca accgcagcat gcagggcagc 1080cacagacaac ctctctgcaa cttctgatgc ctccgtgccc ccatccacag agccctggct 1140ctgggggact ggggactctg ggacatccct aacatggcat gcagtggcgg tgcgggagga 1200cttgactgcc cctctggagc cctgggcccg gggactccag gccagtgcct ctctgggtcg 1260ggatggggat gtcaggccag caggatcatg gtacctgcct ccagggaggg caacgtccac 1320ccactgagtc cagcccgccc accccaccca ctccggagca cctggctctg ccctcaggaa 1380ctccctgagc tttgcacaca gggccgagac acctggattt ctctggttcc ctgagtgggg 1440ccagcttgga agaatttccc aaagcctatt agagcaacgg ctgcctcctg cctgcctcct 1500tgggctgggc agggctgagg gcggagggag agagagagag agggaggggg agaggaggaa 1560ggaaaaagtt ggcaggccga cagcacagcc gtgtctgcat ccatccagag gaggtctgtg 1620tggtgtgggg cgggccagga gcgaagagag gccttcctcc ctttgtgctc cccccgcccc 1680ccggccctat aaataggccc agcccaggct gtggctcagc tctcagaggg aattgagcac 1740ccggcagcgg tctcaggcca agccccctgc cagcatggcc agcgagttca agaagaagct 1800cttctggagg gcagtggtgg ccgagttcct ggccacgacc ctctttgtct tcatcagcat 1860cggttctg 1868AQPl启动子重组质粒构建及药物筛选的过程包括以下步骤:第一步:目的片段的获取应用primer premier5.0引物设计软件设计AQPl启动子的引物，以人类基因组为模板进行PCR，扩增得到目的片段。第二步:克隆载体的构建将扩增得到的目的片断与PMD18-T载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质粒后，酶切鉴定并测序。第三步:表达载体pGL2_AQPlp的构建将克隆质粒和pGL-2载体进行双酶切后连接，经转化、培养和提取，构建pGL2-AQPlp重组质粒，酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定。第四步:药物筛选的应用首先以2 X IO5/孔的密度将ACC-M细胞铺于48孔板中，使细胞达到70 %的汇合率，370C CO2培养箱过夜；将脂质体10 μ L和重组质粒(每孔IOOng)、pREP7_Rluc内参质粒(每孔25ng)分别溶于500 μ L optimem中，震荡混匀，合并为一管，混匀，室温静置30min。20 μ L每孔加入48孔板中，37°C CO2培养箱过夜；48孔板分为阴性、人参(浓度分别为0.3mg/ml,
0.06mg/ml,0.012mg/ml)、西洋参(浓度分别为 0.3mg/ml,0.06mg/ml,0.012mg/ml)、黄苗(浓度分别为0.3mg/ml, 0.06mg/ml, 0.012mg/ml)共十组,每组3个平行孔,37°C CO2培养箱过夜；弃上清，每孔65 μ L PLB (荧光素酶报告基因裂解溶液)，摇床15min，室温，分别转入EP管中；13000rpm，lOmin，取20μ L上清置于新EP管中，检测荧光值并计算平均值和标准差。AQPl启动子报告基因的成功构建和药物筛选的应用，证明了一定浓度的人参和西洋参成分对AQPl启动子的表达有促进作用，可指导临床应用此两种药物治疗舍格伦综合征，同时为舍格伦综合征的治疗策略开拓一条新的途径。
:图1为pGL2_AQPlp重组质粒的构建过程示意图；图2A为PCR扩增出的AQPl基因的启动子片段凝胶电泳图；图2B为回收片段DNA琼脂糖凝胶电泳图；图3 为 pMD18_T vector 不意`
图4A为pGEMT-1GF-lp重组质粒单酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图；图4B为pGEMT-1GF-lp重组质粒双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图；图5 为 pMD18T—AQPlp 测序结果；图6 为 pGL_2basic vector 不意图；图7为双酶切及单酶切重组质粒pGL2_AQPlp的琼脂糖凝胶电泳图；图8为雌二醇荧光素酶检测结果数据图表；图9为雌二醇促进AQPl蛋白表达的Westernblot分析；图10为药物筛选双荧光素酶检测结果数据图表
具体实施方式
:1.目的片段的获取通过NCBI数据库查找AQPl启动子，应用primer premier5.0引物设计软件设计AQPl启动子全长的引物。以人类基因组为模板，上游引物为 5’ CTCGAGTACAGGCACTTAGGGGAATGAA(含 XhoI 酶切位点)，下游引物为5’AAGCTTCAGAACCGATGCTGATGAAGAC(含 HindIII 酶切位点)，进行 PCR，成功扩增出 AQPl 启动子目的片段，长度为1868bp图2A，应用AxyPr印PCR清洁试剂盒回收AQPl启动子的DNA片段图2B。2.AQPlp_pMD18T重组质粒的构建将AQPl启动子片段与PMD18-T载体连接图3，连接体系为Ligase5ul，pMD18_TVector0.5ul，纯化的DNA5ul，混合均匀，16°C连接过夜。将连接产物全部加入IOOul新鲜制备的感受态细胞中混匀，冰浴30min，放入已加温至42 V的水浴中，热激90s (期间不要摇动试管)，迅速放入冰浴中2min，加入600ulS0C培养基，放入37°C摇床振荡lh，铺到含氨苄(Amp)的抗性平板上，37°C平放待液体吸干后，倒置平皿继续培养12-16h，待出现乳白色菌落后挑克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，以EcoRI&Hindlll和KpnI进行双酶切图4A，单酶切鉴定图4B，并测序图5。3.AQPlp-pGL2重组质粒的构建将pGL-2与AQPlp-pMD18T重组质粒应用HindIII和XhoI共同进行双酶切，酶切体系为10*Buffer5ul,质粒2mg(根据大量提取质粒浓度计算体积)，HindIII2ul,用水补足到50ul，混匀后37°C酶切3h，取3ul鉴定，BSA5ul, XhoI2ul，混匀后37°C酶切过夜，电泳回收。取上述回收AQPl启动子片段与pGl-2载体连接图6，连接体系为LigaselOul，pGL-2Vector2ul,AQPlpromoter7ul,混合均勻，16°C连接过夜。将连接产物转入感受态大肠杆菌DH5 α中，在含Amp+琼脂平板上挑选克隆，以碱裂解法小提重组质粒后，，应用ΚρηΙ、XhoI和XhoI&Hindlll对AQPlp-pGL2重组体进行酶切鉴定图7。实施例二:药物筛选1.细胞系的培养腺样囊性癌细胞用DMEM培养，添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素。细胞在37°C，5%培养箱中培养。2.证明药物筛选模型有效性国内外学者已经证实雌二醇(E2)对AQPl的基因表达有重要作用，本发明通过AQPl启动子荧光素酶报告基因重组质粒细胞模型，证实E2可激活AQPl启动子，且呈剂量依赖关系图8，同时我们也证 实了雌二醇可促进AQPl蛋白的表达图9，由此可证明该细胞模型可简单、灵敏的用于药物筛选。3.药物筛选的应用首先以2 X IO5/孔的密度将ACC-M细胞铺于48孔板中，使细胞达到70 %的汇合率，370C CO2培养箱过夜；将脂质体10 μ L和重组质粒(每孔IOOng)、pREP7_Rluc内参质粒(每孔25ng)分别溶于500 μ L optimem中，震荡混匀，合并为一管，混匀，室温静置30min。20 μ L每孔加入48孔板中，37°C CO2培养箱过夜；48孔板分为阴性、人参(浓度分别为0.3mg/ml,
0.06mg/ml,0.012mg/ml)、西洋参(浓度分别为 0.3mg/ml,0.06mg/ml,0.012mg/ml)、黄苗(浓度分别为0.3mg/ml, 0.06mg/ml, 0.012mg/ml)共十组,每组3个平行孔,37°C CO2培养箱过夜；弃上清，每孔65 μ L PLB (荧光素酶报告基因裂解溶液)，摇床15min，室温，分别转入EP管中；利用Turner Designs TD20/20光度计中的双荧光素酶实验系统模式测定荧光素酶活性，所得的结果为各个实验样品的萤火虫荧光素酶的活性与Renilla荧光素酶活性的比值。实验结果均为3次独立的实验结果的平均值，制作图表图10。证明了一定浓度的人参，西洋参成分激活AQPl启动子的活性，可指导临床应用该药物治疗舍格伦综合征，同时为舍格伦综合征的治疗策略开拓一条新的途径。
权利要求
1.水通道蛋白I启动子荧光素酶报告基因的重组，其特征为:将该基因启动子-1717至+151序列重组到报告基因载体上。重组的过程为:通过NCBI数据库查找AQPl启动子序列，应用primer premier5.0引物设计软件设计AQPl启动子的引物,采用PCR的方法从人基因组中扩增出了 1868bp的AQPl启动子序列，并将其克隆到空载体pGL2_Basic的多克隆位点中，其下游为荧光素酶(Luc)的表达序列，构建出AQPl启动子-Luc表达载体。
2.如权利I所述报告基因重组应用于涎腺细胞模型筛选药物，其特征为:将构建的人AQPl启动子荧光素酶报告基因转染至ACC-M细胞中，采用报告基因系统检测AQPl-promoter-luc的转录活性。发现一定浓度的人参和西洋参成分可使AQPl启动子活性升高，且浓度越高活性越强。 ·
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及人类水通道蛋白1(AQP1)启动子荧光素酶报告基因重组及药物筛选的应用。高表达的AQP1在唾液分泌过程中起着重要的作用，且与舍格伦综合征的发病密切相关。在此发明中，我们利用基因工程技术，从人基因组中扩增出了1868bp的AQP1启动子序列，并克隆到PGL2-luc载体上，构建出AQP1启动子-Luc表达载体。AQP1表达受启动子区域的调控，构建涎腺细胞AQP1启动子模型是筛选哪些中药成分能治疗舍格伦综合征的关键步骤。通过此药物筛选细胞模型，证明了一定浓度的人参，西洋参成分可促进AQP1启动子的转录，且浓度越高活性越强，可指导临床应用该药物治疗舍格伦综合征。
文档编号C12N15/63GK103233031SQ20131015434
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月16日 优先权日2013年4月16日
发明者李江, 赵超悦, 焦晓菲, 姜春娃, 贺玺, 魏溦, 张艳 申请人:吉林大学