专利名称：一种水通道蛋白AqpZ的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白的表达和纯化方法，更具体地说，涉及一种采用麦芽糖结合蛋白/多聚组氨酸二元标签表达系统在大肠杆菌中表达和纯化得到水通道蛋白AqpZ的方法。
背景技术：
水分子的跨膜运输是生命的基本活动之一。水分子快速的跨膜运输是生物体得以迅速地适应细胞外环境渗透压变化的一个重要的因素。水通道蛋白Aquaporins是重要固有蛋白的重要成员之一。它是水分子进出细胞专一性的跨膜通道，因此在维持细胞内环境稳态发挥着重要的作用。水通道蛋白遍布整个生物界，从原核细菌到真核动植物都有水通道被鉴定出来。大肠杆菌水通道蛋白Aquaporin Z (AqpZ)是第一个被发现的原核生物水通道蛋白。由于AqpZ的发现，一系列新的水通道蛋白家族成员也被陆续解析出来。所以水通道蛋白AqpZ已经成为研究微生物水分子运输、生物物理，生理及结构的模式蛋白。AqpZ的分子晶体结构已经被逐步的解析清楚。AqpZ是由具有6个跨膜区域，5个相互连接的环和2个保守的NPA box (asparagines-proline-alanine)装配而成的。AcipZ的高度疏水性，经过强烈的压缩之后形成了高度稳定且具有SDS抗性(SDS-Resistance)。在中性条件下，即使1%的SDS也不能使它解聚。在功能上，AqpZ对水有极高的渗透性，且该过程所需活化能很低，而且AqpZ是个“纯”的水通道蛋白，不能够运输甘油和尿素等一些小分子。研究表明重整到脂质体后，AqpZ表现出高度渗透系数(Pf=10*10_14 cmWubunit—1)和低的渗透活化能(Ea=3.8 kcal/mol)。以此速率,大约0.14 μ g水通道蛋白AcipZ就能回收2.4升的废水(每个人每天最低需水量)。由于AqpZ结构和功能上的优势，已被选作制备生物仿生复合膜的候选蛋白之一。但是缺乏有效手段获得足够量的AqpZ蛋白样品已成为该技术的主要瓶颈之一。主要由于AqpZ蛋白强烈的疏水性，它在细胞内的大量表达会造成细胞毒性，影响宿主细胞的正常代谢，因此其表达水平受到大大的限制，AqpZ在大肠杆菌体系的表达量仅仅只有2.5 mg/L。有研究表明采用融合表达策略可以大大提高AqpZ的表达水平，但是大部分蛋白都是以包涵体形式存在，仍然不能大量获得具有生物功能的AqpZ。主要的原因是亲水性标签还不能够完全中和AqpZ强烈的疏水性。因此，很难满足结构学研究和制备基于水通道蛋白的水回收装置的要求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种水通道蛋白AqpZ的制备方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:一种水通道蛋白AqpZ的制备方法，它包括以下步骤: (O大肠杆菌水通道蛋白AqpZ-HIS的扩增:根据NCBI上的大肠杆菌水通道蛋白基因序列设计2对引物，通过设计引物在AqpZ基因的3’端人为的添加8个HIS亲和标签，第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示；根据pMAL-p2和pMAL_c5e这两个载体的多克隆位点特点，在第一引物的上下游分别加上及 HI和I限制性内切酶位点以适用于pMAL-p2，在第二引物的上下游分别加上及 HI和历III限制性内切酶位点以适用于pMAL_c5e，利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA
(2)重组表达载体的构建:将步骤I得到的带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA定向克隆到用同样的内切酶双酶切过的表达载体pMAL-p2和pMAL_C5e上，得到含有水通道蛋白AqpZ的二元标签重组表达载体pMAL-p2-AqpZ-HIS及pMAL-c5e-AqpZ-HIS ;将这两个二元标签重组表达载体化到大肠杆菌DH5CI感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素的LB平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，进行双酶切和测序鉴定;
(3)工程菌株的构建及诱导表达:将步骤2鉴定 正确的的质粒转化到大肠杆菌表达宿主Rosetta (DE3)中，并接种到含有100 μ g/mL氨苄霉素和34 μ g/mL氯霉素的LB培养基中，在200-250转/分钟转速、30°C下培养过夜，得到种子液；然后，把种子液接种到SOC培养基摇瓶中，种子液与SOC培养基的体积比为1:50，在200-250转/分钟转速、30°C下培养至0D600为1.5时加入IPTG至IPTG的摩尔浓度为0.6 mM,并继续诱导培养8小时，然后5000转/分钟离心10分钟收集菌体，即得到超表达水通道蛋白融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌体；
(4)超声波破碎步骤3得到的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌体，12000转/分钟离心10分钟后收集上清；
(5)纯化步骤4收集的上清，得到水通道蛋白AqpZ。本发明的的有益效果是:
(1)通过PCR方法在大肠杆菌水通道蛋白AqpZ基因序列的3’-端人为的添加8个组氣酸标签，获得具有8 X组氣酸标签的基因序列；
(2)将基因序列克隆于含MBP融合表达标签载体pMAL-p2及pMAL_c5e上，获得二元标签融合表达载体，使融合蛋白能够在大肠杆菌中高效表达，并避免了由于AqpZ强烈的疏水性对宿主细胞造成的毒性；
(3)融合蛋白MBP-AqpZ-HIS为嵌膜表达保证了水通道蛋白空间折叠的正确性，为获得功能性AqpZ奠定了基础；
(4)通过特异性酶切可以将标签MBP去除，后通过Co2+-NTA亲和层析可以获得高纯度AqpZ-HIS ；
(5)首次利用二元标签表达系统用于膜蛋白水通道蛋白AqpZ的表达与分离纯化，对结构学研究和制备基于水通道蛋白的水回收装置具有重要意义。
图1 为 pMAL-p2_AcipZ-HIS 质粒图谱；
图 2 为 pMAL-c5e-AcipZ-HIS 质粒图谱；
图3为融合蛋白在4种不同宿主诱导和不诱导培养6小时后的生物量及对应的融合蛋白表达水平柱状图；图4为SDS-PAGE分析融合蛋白在4种宿主中的表达情况电泳图，图中为无诱导样品；
图 5 为 Rosetta (DE3) /pMAL-p2-AqpZ-HIS 在 30°C下的生长曲线；
图6为SDS-PAGE分析在不同生长阶段(1，2，3，4，7小时)进行诱导对融合蛋白表达水平电泳图，图中“”为无诱导样品，"marker ”为蛋白分子量标准；
图7为不同浓度IPTG浓度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mM)诱导下融合蛋白的表达水平柱状 图8为SDS-PAGE分析不同浓度IPTG浓度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mM)诱导下融合蛋白的表达水平电泳图，图中“”为无诱导样品，“marker ”为蛋白分子量标准；
图9为不同诱导后培养时间下融合蛋白的表达水平曲线；
图10为SDS-PAGE分析不同诱导后培养时间下融合蛋白的表达水平电泳图，图中为无诱导样品，“marker”为蛋白分子量标准；
图11为融合蛋白MBP-AqpZ-HIS嵌膜表达的鉴定电泳图，图中，“Tot”:破胞后上清；“M”:超高速离心下的沉淀即膜组分；“S”:超高速离心下的上清即可溶组分，“marker”为蛋白分子量标准；
图12为融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的纯化，图中，1:上样起始样品；2，3:穿透样品；4_9:洗脱样品，“marker”为蛋白分子量标准；
图13为融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的特异性酶切，图中，I:factor Xa酶切样品；2:肠激酶酶切样品；3:酶切前样 品，“marker”为蛋白分子量标准；
图14为基于两步亲和层析法AqpZ-HIS的分离纯化，图中，1:上样起始样品；2，3:穿透样品；3，4，5:洗脱样品，“marker”为蛋白分子量标准；
图15为细胞裂解上清液的特异性酶切，图中，1:肠激酶酶切后样品；2:肠激酶酶切前样品，“marker”为蛋白分子量标准；
图16为基于一步亲和层析法AqpZ-HIS的分离纯化，“marker”为蛋白分子量标准。
具体实施例方式本发明水通道蛋白AqpZ的制备方法包括以下步骤:
1、大肠杆菌水通道蛋白AqpZ-HIS的扩增:根据NCBI上的大肠杆菌水通道蛋白基因序列设计2对引物。通过设计引物在AqpZ基因的3’端人为的添加8个HIS亲和标签。第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。根据pMAL-p2和pMAL-c5e这两个载体的多克隆位点特点，在第一引物的上下游分别加上及 HI和I限制性内切酶位点以适用于pMAL-p2，在第二引物的上下游分别加上及 HI和历III限制性内切酶位点以适用于pMAL-c5e,利用聚合酶链式反应,得到带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA。pMAL-p2和pMAL-c5e这两个载体为NEB公司的产品。2、重组表达载体的构建:将步骤I得到的带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA定向克隆到用同样的内切酶双酶切过的表达载体pMAL-p2和pMAL_C5e上，得到含有水通道蛋白AqpZ的二元标签重组表达载体pMAL-p2-AqpZ-HIS及pMAL-c5e-AqpZ-HIS ;将这两个二元标签重组表达载体化到大肠杆菌DH5a感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素的LB平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，进行双酶切和测序鉴定;
3、工程菌株的构建及诱导表达:将步骤2鉴定正确的的质粒转化到大肠杆菌表达宿主Rosetta (DE3)中，并接种到含有100 μ g/mL氨苄霉素和34 μ g/mL氯霉素的LB培养基中，在200-250转/分钟转速、30°C下培养过夜，得到种子液。然后，把种子液接种到SOC培养基摇瓶中，种子液与SOC培养基的体积比为1:50，在200-250转/分钟转速、3(ie下培养至0D600为1.5时加入IPTG至IPTG的摩尔浓度为0.6 mM,并继续诱导培养8小时，然后5000转/分钟离心10分钟收集菌体，即得到超表达水通道蛋白融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌体。其中，Rosetta (DE3)为MERCK公司的产品。LB培养基包括:10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为水。SOC培养基包括:20g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，0.5g/L氯化钠，2.5 mM氯化钾IOmM氯化镁，20mM葡萄糖。4、超声波破碎步骤3得到的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌体，12000转/分钟离心10分钟后收集上清。5、纯化步骤4收集的上清，得到水通道蛋白AqpZ。该步骤可以通过以下两种方案来实现:
纯化方法之一:向上清中加入Triton XlOO至Triton XlOO的体积百分比浓度为4%，室温振荡I小时，12000转/分钟离心30分钟后收集上清；上清上样于用平衡缓冲液平衡好的Co2+-NTA亲和层析柱后，再用平衡缓冲液平衡，冲洗，最后用洗脱液洗脱结合到Co2+-NTA亲和层析柱上的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS。采用脱盐柱GlO将纯化后的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的缓冲液置换到factor Xa工作缓冲液或肠激酶工作缓冲液中，加入肠激酶或factor Xa在20°C酶 切10小时。将酶切彻底的反应液用平衡缓冲液十倍稀释后，再次上样于用平衡缓冲液平衡好的Co2+-NTA亲和层析柱，再平衡，冲洗最后用洗脱液洗脱结合到Co2+-NTA亲和层析柱上的AqpZ-HIS，得到高纯度的水通道蛋白AqpZ-HIS。上述的平衡缓冲液pH为8.0,包括20mM Tris-HCl.0.5M NaCl、20mM咪唑和1%Triton X100，上述的洗脱液 pH 为 8.0，包括 20mM Tris-HCl.0.5M NaCl、250mM 咪唑和 1%Triton XlOO ;肠激酶工作缓冲液 pH 为 8.0，包括 50 mM Tris-HCl,2 mM CaCl2,50 mM NaCl和 1% Triton X100 ；factor Xa工作缓冲液为ρΗ8.0，包括50 mM Tris-HCl,2 mM CaCl2,200mM NaCl和1% Triton X100 ;它们的溶剂均为水，百分比除特别说明外，均为体积百分比。纯化方法之二:向上清中加入Triton X100至Triton X100的体积百分比浓度为4%，室温振荡I小时，12000转/分钟离心30分钟后收集上清；加入肠激酶在20°C酶切20小时。将酶切彻底的反应液用平衡缓冲液十倍稀释后，上样于用平衡缓冲液平衡好的Co2+-NTA亲和层析柱，再用平衡缓冲液平衡，冲洗，最后用洗脱液洗脱结合到Co2+-NTA亲和层析柱上的AqpZ-HIS，得到高纯度的水通道蛋白AqpZ-HIS。为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。步骤1、大肠杆菌基因组提取方法:
I)取1.5ml在LB培养基中培养过夜的大肠杆菌菌液加入1.5ml离心管中，12000转/分钟离心I分钟收集菌体，弃上清。2)加入 190 μ L TE 重悬沉淀，并加入 10 μ L 10% SDS, 30 μ L 10 mg/mL 溶菌酶，IyL 20 mg/L蛋白酶K混匀于37°C温浴I小时。3 )加入 30 μ L 5 M NaCl，混匀。4)加入300 μ L CTAB/NaCl混合溶液，混匀，于65°C温浴20分钟。5) 300 μ L酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提，12000转/分钟离心10分钟。将
上清移至干净离心管。6)加入300 UL氯仿/异戊醇(24:1)抽提，取上清至干净离心管。7)加入300 μ L 异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟,沉淀DNA。8) 12000 rpm离心10分钟，小心去除上清，加入700 μ L 70%乙醇，12000转/分钟离心10分钟，弃乙醇。9)风干除去残留乙醇，用20 μ L，用无菌水溶解大肠杆菌基因组DNA。步骤2、构建 pMAL-c5e_AcipZ-HIS 工程菌 O大肠杆菌水通道蛋白AqpZ基因的获得:
a)根据购于NEB公司的pMAL-p2和pMAL_C5e的多克隆位点序列特点和NCBI数据库上面提供的大肠杆菌K12的水通道蛋白AqpZ的序列，按照引物设计原则，设计2对引物，用于扩增水通道蛋白AqpZ全长序列，其中在一条引物上下游分别加上ife HI和I限制性内切酶位点用于pMAL-p2，在另一条引物上下游分别加上历III和及 HI限制性内切酶位点用于pMAL-c5e，并在下游引物上添加8个组氨酸标签基因。第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。b)利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA:该反应程序如下:预变性94°C，5分钟；变性95°C，30秒；复性58°C，30秒；延伸72°C，I分钟，共30个循环，最后一次反应延伸时间为10分钟。取聚合酶链式反应产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，采用购于Qiagen公司的胶回收试剂盒回收琼脂糖凝胶中的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA ；
2)重组表达载体 pMAL-p2-AcipZ-HIS 和 pMAL-c5e_AcipZ-HIS 的构建:
a)将水通道蛋白AqpZ基因用I和BamHI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，回收水通道蛋白AqpZ基因片段，pMAL_p2空质粒同样用这两个酶进行酶切后回收双酶切过的质粒片段；同样地，将水通道蛋白AqpZ基因用III和及 HI双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，回收水通道蛋白AqpZ基因片段，pMAL_c5e空质粒同样用这两个酶进行酶切后回收双酶切过的质粒片段；
b)将回收的水通道蛋白AqpZ基因片段和酶切过的质粒片段按浓度比4:1的比例加入200 μ I小离心管中，用Τ4连接酶在16°C下连接过夜；
c)以上连接产物10μ I转化200 μ I CaClJi制备的DH5a感受态细胞，然后，加入37°C预热的LB培养基Iml后置于37°C摇床，在180转/分钟转速下振荡I小时。d)上述菌液在4000转/分钟转速下离心I分钟后，弃去Iml上清，剩余溶液用移液器轻轻吹打混匀后涂布在含有氨苄霉素的LB平板，并置于37°C培养箱培养12小时以上；
e)随机挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，银后B.HI和I或Hind III和及 HI进行双酶切鉴定，得到含有水通道蛋白AqpZ的重组表达载体pMAL-p2-AqpZ-HIS 和 pMAL-c5e-AqpZ_HIS ;其质粒图谱分别见图1 和图 2。步骤3、重组水通道蛋白Z表达条件的优化
以载体pMAL-p2-AqpZ-HIS为例，来介绍重组水通道蛋白AqpZ表达条件的优化。在摇瓶培养环境通过单因素实验设计，改变培养过程中的一个因素，其他因素不变，优化表达AqpZ基因工程菌表达条件。重组水通道蛋白AqpZ表达条件优化的因素包括表达宿主的优化，诱导时机的优化，诱导剂IPTG浓度的优化和诱导后培养时间的优化。a)表达宿主的优化:将测序正确的克隆的质粒转化到表达宿主BL21(DE3)，C41 (DE3), C43 (DE3)和Rosetta (DE3)中。挑取重组大肠杆菌单克隆到5ml含有相应抗生素的LB培养基，300C 220转/分钟培养过夜，然后以1:50的比例接种到新鲜的SOC培养基(50ml/250 ml)，30°C分别培养至0D600约为1.0后，加入IPTG至IPTG浓度为1.0 mM, 30°C诱导6小时。5000转/分钟离心10分钟收集菌体，用17 ml预冷的破胞缓冲液清洗菌体两次后，重悬菌体后进行超声波破碎(工作5s，停7s，功率300W 30个循环)10000转/分钟离心10分钟上清即为可溶性蛋白。SDS-PAGE分析检测融合蛋白MBP-AqpZ-HIS表达情况。结果见图3，4。从图中可以看出，融合蛋白MBP-AqpZ-HIS在这四种大肠杆菌BL21 (DE3)，C41 (DE3), C43 (DE3)及 Rosetta (DE3)分别为 175、153、163 和 186mg/L。Rosetta (DE3)为最佳表达宿主。通过比较诱导和没有诱导最终的菌浓度发现此载体的表达产物并没有对宿主细胞产生毒害作用。b)诱导时机的优化:为了确定最佳的诱导时机，我们在测量了重组菌Rosetta(DE3) /pMAL-p2-AqpZ-HIS在30°C下的生长曲线结果如图5，确定出该重组菌的不同的生长阶段:延滞期、对数生长期前期、对数生长期中期、对数生长期后期及稳定期，并分别加入IPTG至IPTG浓度为ImM，30°C下诱导培养6个小时后测定融合蛋白MBP-AqpZ-HIS蛋白表达量。结果如图6，诱导时机对融合蛋白的表达水平有着明显的影响，其中在对数生长期中期诱导时融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的表达水平最高。过早或太迟诱导都将导致表达水平急剧下降，尤其是延滞期及稳定期诱导目标蛋白基本不表达。c)诱导剂量的优化:当菌体生长到对数生长期时(0D 1.5)，加入IPTG至IPTG浓度分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mM，30°C下诱导培养6个小时后测定融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的表达量。结果如图7，8，当诱导剂IPTG加入浓度为0.6 mM时，融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的表达量达到最大值240 mg/L。d)诱导后培养时间的优化:在30°C培养条件下，当菌体生长到对数生长期中期时用0.6 mM IPTG进行诱导，测定融合蛋白MBP-AqpZ-HIS表达水平随诱导后培养时间的变化趋势。如图9，10所示，当诱导后继续培养8个小时目标融合蛋白表达量达到最大值，即最佳的诱导后培养时间为8小时。e)最佳表达条件:根据以上结果确定最佳的表达条件是以Rosetta (DE3)为表达宿主，在对数生长期中期开始用0.6 mM IPTG诱导8个小时。步骤4 MBP-AqpZ-HIS嵌膜表达的鉴定
将表达有MBP-AqpZ-HIS的大肠杆菌破胞上清液等量分成若干份，160000g离心I小时。上清即为可溶组分，沉淀即为膜组分。SDS-PAGE分析检测融合蛋白MBP-AqpZ-HI S分布情况。如图11所示 ，结果表明MBP-AqpZ-HIS全部出现在细胞膜组分中，这揭示了MBP-AqpZ-HIS是以嵌膜形式表达的。步骤5 AqpZ-HIS的分离纯化 I) AqpZ-HIS的分离纯化方法之一
a)将上述步骤3中所得到表达重组水通道蛋白Z的发酵液于5000rpm,4°C离心10分钟，弃上清收集菌体。所得菌体用预冷的细胞裂解液清洗两次后，用平衡缓冲液重悬菌体；
b)重悬后菌液用超声波进行破碎，超声条件:300瓦，工作7秒，间隔5秒，重复30次，冰浴。在4°C，13000转/分钟条件下离心，收集上清；
c)将上述上清液加入终浓度为4%Triton X100，在4°C下温和温和振荡I小时。12000转/分钟离心30分钟收集上清；
d)取上清用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡Co2+-NTA亲和层析柱，加入上述上清并使其在柱内平衡，用平衡缓冲液冲洗Co2+-NTA亲和层析柱后用洗脱液洗脱，然后用SDS-PAGE分析纯化情况；结果如图12所示，Co2+-NTA亲和层析柱可以有效的纯化融合蛋白MBP-AqpZ-HIS。e)采用脱盐柱GlO将纯化后的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的缓冲液置换到factor Xa或肠激酶的工作缓冲液中，加入肠激酶或factor Xa在20°C酶切10小时，然后用SDS-PAGE分析酶切情况；如图13所示，factor Xa的酶切效率比肠激酶高，并且能够将融合蛋白酶切完全，这为下一步的纯化奠定了基础。f)将酶切彻底的反应液用平衡缓冲液十倍稀释后，再次上样于用平衡缓冲液平衡好的Co2+-NTA亲和层析柱，用平衡缓冲液冲洗Co2+-NTA亲和层析柱后用洗脱液洗脱，然后用SDS-PAGE分析纯化情况；如图14所示，洗脱下来的AqpZ-HIS在SDS-PAGE呈现出“一大一小，大主小次”的带型。通过以分子量标准比较，其大的主带大约为SOkDa位置与AqpZ-HIS四聚体的位置相对应，其 小的次带约为23kDa位置与AqpZ-HIS单体的位置相对应。通过以上结果可以看出方法I分离纯化AqpZ-HIS是成功的。5) AqpZ-HIS的分离纯化方法之二
a)将上述步骤3中所得到表达重组水通道蛋白Z的发酵液于5000rpm,40C离心10分钟，弃上清收集菌体。所得菌体用预冷的细胞裂解液清洗两次后，用肠激酶的工作缓冲液重悬菌体；
b)重悬后菌液用超声波进行破碎，超声条件:300瓦，工作7秒，间隔5秒，重复30次，冰浴。在4°C，13000转/分钟条件下离心；
c)将上述上清液加入终浓度为4%Triton X100，在4°C下温和振荡I小时。12000转/分钟离心30分钟收集上清；
d)加入肠激酶在20°C酶切20小时，然后用SDS-PAGE分析酶切情况；结果如图15所示，由于破胞上清液成分复杂干扰了酶切反应使得需要经过大约48小时才能将融合蛋白酶切完全。e)将酶切彻底的反应液用平衡缓冲液十倍稀释后，再次上样于用平衡缓冲液平衡好的Co2+-NTA亲和层析柱，用平衡缓冲液冲洗Co2+-NTA亲和层析柱后用洗脱液洗脱，然后用SDS-PAGE分析纯化情况；结果如图16所示，与方法一相同洗脱下来的AqpZ-HIS在SDS-PAGE呈现出“一大一小，大主小次”的带型。这说明方法2也是成功的。<110>浙江大学
〈120〉一种水通道蛋白AqpZ的制备方法
〈160〉4
<170>PatentIn version 3.3
〈210〉I
〈211〉40
〈212〉DNA〈213〉人工设计
〈400〉I
cgggatccga cgacgacgac aagatgttcc gcaaattagc40
〈210〉2
〈211〉59
〈212〉DNA〈213〉人工设计
〈400〉2
gccggtcgac ttattagtgg tggtggtggt ggtggtggtg atcacgcttt tccagcagg59
〈210〉3
〈211〉37
〈212〉DNA〈213〉人工设计
〈400〉3
cgcggatcca tgttccgcaa attagcagct `gaatgtt37
〈210〉4
〈211〉58
〈212〉DNA〈213〉人工设计
权利要求
1.一种水通道蛋白AqpZ的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤: (O大肠杆菌水通道蛋白AqpZ-HIS的扩增:根据NCBI上的大肠杆菌水通道蛋白基因序列设计2对引物，通过设计引物在AqpZ基因的3’端人为的添加8个HIS亲和标签，第一引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，第一引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，第二引物的上游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，第二引物的下游引物的寡核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示；根据pMAL-p2和pMAL-c5e这两个载体的多克隆位点特点，在第一引物的上下游分别加上及 HI和I限制性内切酶位点以适用于pMAL-p2，在第二引物的上下游分别加上及 HI和历III限制性内切酶位点以适用于pMAL_c5e，利用聚合酶链式反应，得到带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA (2)重组表达载体的构建:将步骤I得到的带组氨酸标签的水通道蛋白AqpZ-HIS的DNA定向克隆到用同样的内切酶双酶切过的表达载体pMAL-p2和pMAL_C5e上，得到含有水通道蛋白AqpZ的二元标签重组表达载体pMAL-p2-AqpZ-HIS及pMAL-c5e-AqpZ-HIS ;将这两个二元标签重组表达载体化到大肠杆菌DH5CI感受态中，然后，涂布在含氨苄霉素的LB平板上，培养过夜，随机挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，进行双酶切和测序鉴定; (3)工程菌株的构建及诱导表达:将步骤2鉴定正确的的质粒转化到大肠杆菌表达宿主Rosetta (DE3)中，并接种到含有100 μ g/mL氨苄霉素和34 μ g/mL氯霉素的LB培养基中，在200-250转/分钟转速、30°C下培养过夜，得到种子液；然后，把种子液接种到SOC培养基摇瓶中，种子液与SOC培养基的体积比为1:50，在200-250转/分钟转速、30°C下培养至0D600为1.5时加入IPTG至IPTG的摩尔浓度为0.6 mM,并继续诱导培养8小时，然后5000转/分钟离心10分钟收集菌体，即得到超表达水通道蛋白融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌体； (4)超声波破碎步骤3得到的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌体，12000转/分钟离心10分钟后收集上清； (5)纯化步骤4收集的上清，得到水通道蛋白AqpZ。
2.根据权利要求1所述大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法，其特征在于，所述步骤(5)具体为:向上清中加入Triton XlOO至Triton XlOO的体积百分比浓度为4%，室温振荡I小时，12000转/分钟离心30分钟后收集上清；上清上样于用平衡缓冲液平衡好的Co2+-NTA亲和层析柱后，再用平衡缓冲液平衡，冲洗，最后用洗脱液洗脱结合到Co2+-NTA亲和层析柱上的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS ;采用脱盐柱GlO将纯化后的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的缓冲液置换到factor Xa工作缓冲液或肠激酶工作缓冲液中，加入肠激酶或factor Xa在20°C酶切10小时；将酶切彻底的反应液用平衡缓冲液十倍稀释后，再次上样于用平衡缓冲液平衡好的Co2+-NTA亲和层析柱，再平衡，冲洗最后用洗脱液洗脱结合到Co2+-NTA亲和层析柱上的AqpZ-HIS ，得到高纯度的水通道蛋白AqpZ-HIS。
3.根据权利要求1所述大肠杆菌中嵌膜表达和纯化水通道蛋白AqpZ的方法，其特征在于，所述步骤(5)具体为:向上清中加入Triton X100至Triton X100的体积百分比浓度为4%，室温振荡I小时，12000转/分钟离心30分钟后收集上清；加入肠激酶在20°C酶切20小时；将酶切彻底的反应液用平衡缓冲液十倍稀释后，上样于用平衡缓冲液平衡好的Co2+-NTA亲和层析柱，再用平衡缓冲液平衡，冲洗，最后用洗脱液洗脱结合到Co2+-NTA亲和层析柱上的AqpZ-HIS， 得到高纯度的水通道蛋白AqpZ-HIS。
全文摘要
本发明公开了一种水通道蛋白AqpZ的制备方法，该方法首先扩增大肠杆菌水通道蛋白AqpZ-HIS，然后构建重组表达载体并构建及诱导表达工程菌株，超声波破碎得到的融合蛋白MBP-AqpZ-HIS的菌体，最后纯化得到水通道蛋白AqpZ；本发明实现了在大肠杆菌中高效表达麦芽糖结合蛋白-水通道蛋白AqpZ-多聚组氨酸二元标签融合蛋白，克服了传统超表达AqpZ对宿主细胞造成的毒性及形成不溶性包涵体问题；而且，通过本方法表达的水通道蛋白只需通过两轮的简单的亲和色谱分离就可以得到高纯度的水通道蛋白AqpZ，操作简单可适用于工业化生产。
文档编号C12N15/31GK103173468SQ20131007430
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月8日 优先权日2012年4月11日
发明者徐志南, 潘剑峰, 黄磊, 蔡谨 申请人:浙江大学