专利名称：一种利用Flag蛋白标签沉淀目的蛋白的染色质免疫共沉淀技术的制作方法
技术领域：
本发明应用到一种研究DNA与蛋白质相互作用的染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation, Ch I P),涉及到构建目的蛋白上带有Flag蛋白标签的表达载体并用其抗体沉淀DNA-蛋白复合物的方法。
背景技术：
染色质免疫共沉淀技术(ChIP)是一种在体内研究转录因子(DNA)与靶基因启动子区域直接相互作用的方法， 可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化，能够得到转录因子结合位点的信息，确定其直接靶基因。此项技术早期多被用于研究核小体上DNA和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰等方面。近年来，染色质免疫共沉淀技术(ChIP)已经得到了许多改进和完善，成为一种被用于研究体内转录调控因子与靶基因启动子上特异DNA序列相互作用的广泛使用的技术。ChIP技术已经成为在染色质水平上研究基因表达调控的最为有效的方法。值得一提的是，此项技术与DNA芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量测序筛选已知目的蛋白与其相互结合的靶基因在全基因组上的分布情况。这将有助于寻找出更多的转录因子，为研究疾病的发病机制探明道路。染色质免疫共沉淀技术(ChIP)的原理是:在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原-抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来，以富集存在组蛋白修饰或者转录调控的DNA片段，再通过多种下游检测技术(定量PCR、基因芯片、高通量测序等)来检测此富集片段的DNA序列。染色质免疫共沉淀技术(ChIP)的灵敏度最终取决于从未结合的片段背景中分离蛋白质结合的DNA片段的能力，其中抗体的质量和IP步骤是关键。然而，蛋白质和基因组DNA的非特异性结合会产生不同种类的背景，这些背景能被交联捕获且不受IP步骤改进的影响。因为较短DNA片段的非特异性结合位点较少，所以非特异性结合水平会随着DNA片段长度的减少而降低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对在染色质免疫共沉淀中出现的抗体质量差而导致的特异性低的问题而提出的一种全新的方法。本方法是首先需要构建一个目的蛋白基因带有Flag蛋白标签序列的真核表达载体，检测构建成功的表达载体是否在细胞内表达；其次将构建好的表达载体转染进特定的细胞内；最后将细胞用甲醛交联，超声破碎，用Flag蛋白标签抗体(而非目的蛋白抗体)去沉淀目的蛋白与下游靶基因的复合物，后续其他步骤同传统的染色质免疫共沉淀技术。具体地说，本方法包括如下步骤:1.构建载体:在NCBI上查找出目的蛋白的基因序列，PCR扩增出目的片段，将扩增出的目的片段克隆进一端带有Flag序列的真核表达载体。2.检测构建的载体是否表达:提取质粒，将其瞬时转染进特定细胞内48小时，提总蛋白做Western Blot检测是否表达。3.将构建好的表达载体转染进特定细胞内:如果步骤2证明构建的表达载体可以表达，再进行此步骤。根据不同的细胞类型和表达量的不同，选用瞬时转染或稳定转染，将构建的表达载体转染进特定细胞内，待其在细胞内表达量达到预计程度后再进行步骤4。4.甲醛交联细胞:本步骤同传统的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)，主要是用甲醛将细胞内的蛋白质-DNA、蛋白质-蛋白质固定下来。5.超声破碎:本步骤同传统的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)，主要是用超声破碎仪将蛋白质-DNA复合物中基因组DNA打碎到一定的长度范围内，一般情况下是200bp-lkb。6.用Flag蛋白标签抗体(而非目的蛋白抗体)去沉淀目的蛋白与下游靶基因的复合物:本步骤是此项方法的核心步骤。传统的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)是用目的蛋白抗体去沉淀目的蛋白与下游靶基因的复合物，它所存在的最大问题是抗体沉淀的效率低和抗体使用量大，而且抗体非常昂贵，然而，此项方法却是用Flag蛋白标签抗体代替目的蛋白抗体去沉淀目的蛋白-下游靶基因复合物。由于Flag蛋白标签抗体特异性非常好，而且抗体价格昂贵，所以本方法解决了传统的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)所面临的抗体效率低和抗体使用量大且昂贵的问题，大大节省了费用。7.后续操作步骤都同传统的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)。本方法具有如下 的优点和效果:1.本方法首先是构建了一个过表达体系去做染色质免疫共沉淀，因为提高了目的蛋白在细胞内的表达量，所以可以用来研究细胞内低表达的目的蛋白所调控的下游靶基因位点。2.本方法用Flag蛋白标签抗体代替目的蛋白抗体去做沉淀，一方面提高了抗体沉淀的特异性，另一方面减少了昂贵的抗体的使用量，大大节省了费用。3.本方法是将一个带有目的蛋白的过表达体系导入细胞内，使其在细胞内稳定表达，所以较少受到细胞状态和自身表达量低的影响。
图1为构建的表达载体，具体为N2ICD-3XFlag-pcDNA3.0质粒，左边是Ikb的DNA Ladder,分子量依次是 Ikb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、8kb、IOkb,目的蛋白序列 N2ICD 为
2.3kb0图2为构建好的表达载体在细胞内的表达，具体为N2ICD-3XFlag-pcDNA3.0质粒在BxPC3细胞内的表达，目的蛋白N2I⑶大小为IlOkD,左边的为用Flag抗体作为一抗，右边的为用Notch-2抗体作为一抗。图3为超声破碎的基因组片段，具体为将基因组打碎在200-lkb范围内，左边的为 IOObp 的 DNA Ladder,分子量依次是 100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、lkb、1.5kb。
具体实施方式
实施实例I我们选用Notch-2基因的胞内段N2ICD作为目的蛋白，研究其下游的靶基因，其长度为2.3kb。因此，需要构建一段N2I⑶带有Flag蛋白标签序列(具体设计的序列为3 XFlag序列，可参考Sigma公司)的真核表达载体，命名为N2ICD_3XFlag-pcDNA3.0。我们选用胰腺癌细胞BxPC3细胞来做染色质免疫共沉淀实验。构建载体的具体步骤可参考《分子克隆》第三版，科学出版社出版。1.从cDNA文库中扩增出Notch-2基因的胞内段N2I⑶序列，将其克隆进带有3 XFlag序列的pcDNA3.0质粒里，PCR扩增检测是否成功将N2I⑶克隆成功，如图1所示，构建成功的质粒扩增出目的片段2.3kb。2.检测N2ICD-3XFlag_pcDNA3.0质粒是否表达。用无菌玻璃试管37度过夜培养IOml的转化进N2ICD-3XFlag-pcDNA3.0质粒的菌液，第二天提质粒，质粒浓度最好能够达到500ng/ul,以利于下一步的转染。参照Roche公司的转染试剂说明书将N2ICD-3XFlag-pcDNA3.0质粒瞬时转染进胰腺癌细胞BxPC3中，48小时后提取总蛋白做Western Blot观察表达情况,结果见图2。以下步骤应用到染色质免疫共沉淀技术(ChIP):3.确定构建的载体在BxPC3细胞内表达后，再次参照Roche公司的转染试剂说明书将N2ICD-3 X Flag-pcDNA3.0质粒瞬时转染进胰腺癌细胞BxPC3中，48小时待其表达稳定后开始处理细胞。4.用甲醛将细胞交联固定，用甘氨酸终止交联，裂解细胞提取细胞核后，再用超声破碎仪打碎基因组，控制参数将基因组打碎在200bp-lkb之间，见图3所示。5.用Protein G蛋白珠子(公司购买)除去体系中的非特异性蛋白，再加Flag蛋白标签抗体进行免疫沉淀(注意:此步骤是本方法的核心部分，是用Flag蛋白标签抗体代替了 Notch-2抗体)，再用Protein G蛋白珠子将Flag蛋白标签抗体及其连接的目的蛋白-DNA复合物拽下,最后清洗Protein G蛋白珠子,分离Protein G蛋白珠子与目的蛋白-DNA复合物，65度解交联，释放DNA。6.附:传统的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)寻找目的蛋白N2I⑶的下游调控位点。如下所示:染色质免疫共沉淀实验(ChIP)1.37度孵箱中培养密度为每盘3 X IO7个的BxPC3细胞，血清饥饿48h。2.蛋白G琼脂糖球珠的封闭处理:取300 μ I溶胀好的蛋白G琼脂糖球珠，短暂离心后弃上清，加入Iml双蒸水，在混匀器上4°C旋转3min洗去残留的盐和乙醇，重复洗3次。加入双蒸水900μ l、10mg/ml BSA100 μ 1，在混匀器上4°C旋转孵育过夜，备用。3.到预设时间点后马上处理细胞。向培养基中加入4%甲醛溶液，使其终浓度为I %，混匀后在室温下静置交联10分钟。再加入1.25M甘氨酸，使其终浓度为0.125M，混匀后在室温下静置5分钟终止交联反应。倒掉反应液，将培养皿至于冰上。4.用适量41: 1\ 83将每盘细胞洗2次，吸干洗液。之后每盘加1.2111141:1\ 85，用细胞刮刮下细胞，移至1.5ml EP管中。4°C 5000rpm离心5min，弃上清，得到细胞沉淀。5.在每管细胞沉淀中加入300 μ 14 V Lysis buffer、终浓度为I X的25Xcocktail和终浓度为ImM的PMSF，吹打重悬混匀，涡旋振荡3_5次，在冰上静置裂解IOmin0之后4°C 8000rpm离心5min,弃上清,得到细胞核沉淀。6.在每管细胞核沉淀中加入300ul4 °C细胞核裂解液、终浓度为I X的25X cocktail和终浓度为ImM的PMSF，吹打重悬混匀，涡旋振荡3_5次，在冰上静置裂解IOmin07.冰上超声3次，超声强度50，每次5s，每次间隔lmin。之后4°C 12000rpm离心I Omin,取上清。8.每管取少量等体积上清，合并于I管中作为Input样品，总体积50 μ I即可。再加入50 μ I双蒸水，终浓度为0.2Μ的NaCl和2 μ I RNase Α,混匀后37°C孵育30min。之后加入2μ I蛋白酶K，65°C解交联过夜。苯酚/氯仿抽提，I %琼脂糖凝胶电泳鉴定超声片段大小，以200-500bp为宜。9.于每管超声上清液中加入等体积封闭好的均质蛋白G琼脂糖球珠悬液(总用量500μ 1)，终浓度为IX的25Xcocktail，在混匀器上4°C旋转孵育2小时进行预清洗，以除去体系中的非特异免疫球蛋白。之后4°C 5000rpm离心2min，收集上清。10.每管加入终浓度为IX的25Xcocktail，再于其中一管中加入5μ g NormalRabbit IgG非特异性抗体作为阴性对照，其他每管中各加入5μ g特异性抗体(包括阳性对照抗体)，在混匀器上4°C旋转孵育过夜。11.将余下的另一半蛋白G琼脂糖球珠悬液混匀后等量加入各管中，再加入终浓度为IX的25Xcocktail，在混匀器上4°C旋转孵育2小时进行免疫沉淀。之后4°C 5000rpm离心2min，弃上清，得到结合有DNA-转录因子-转录因子抗体复合物的蛋白G琼脂糖球珠沉淀。
12.于4°C环境下，在混匀器上将蛋白G琼脂糖球珠沉淀分别用Iml低盐缓冲液、高盐缓冲液和LiCl缓冲液各洗I次，最后用TE(pH8.0)缓冲液洗两次，每次5min，4°C 5000rpm 离心 2min,弃上清。13.配好洗脱液。在每管蛋白G琼脂糖球珠沉淀中加入300 μ I洗脱液重悬，在加热混勻器上65°C、1200rpm振荡30min进行洗脱。之后常温5000rpm离心2min,收集上清。在每管上清中加入终浓度为0.2M的NaCl和2 μ I蛋白酶K，65°C解交联过夜，苯酚/氯仿抽提，得到纯化的目的DNA。14.PCR扩增鉴定(用HES-1启动子特异性序列作为引物)。取模板、dNTP、10 X LATaq buffer各2μ 1，上下游引物各I μ 1，双蒸水12ul以及Pfu高保真DNA聚合酶0.2 μ 1，加入薄壁小EP管中，充分混匀，以热启动的方式进行PCR扩增。程序设置为94°C 5min预变性、94°C 30s变性、退火30s、72°C延伸30s，扩增30轮。
权利要求
1.此项方法是一种利用Flag蛋白标签沉淀目的蛋白与靶基因的染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)技术,其主要目的是研究转录因子,此方法的独特之处在于:构建一个目的蛋白基因序列连接有Flag蛋白标签序列的表达载体，将至转染进特定细胞内，利用Flag蛋白标签抗体沉淀目的蛋白与靶基因的DNA-蛋白复合物的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)。
2.根据权利要求1所述的技术方法，其特征在于用Flag蛋白标签抗体替代目的蛋白抗体进行染色质免疫共沉淀(ChIP)，它的特点是:a.提高了传统ChIP的特异性；b.减少了抗体的使用。
3.根据权利要求2所述的技术方法，其特征在于包括以下步骤: (1)构建目的蛋白基因序列连接有3XFlag蛋白标签序列的真核表达载体(质粒)； (2)将构建好的表达载体(质粒)转染进特定的细胞系中进行表达； (3)用Flag蛋白标签抗体沉淀目的蛋白与其靶基因的DNA-蛋白复合物，其后续操作同传统的染色质免疫共沉淀技术(ChIP)。
4.根据权利要求3所述的技术方法，其特征在于步骤(I)构建目的蛋白基因序列连接有3 X Flag蛋白标签序列的真核表达载体(质粒)为: 构建一个真核表达载体，其要求:目的蛋白的N端或C端连接有一小段不超过IOObp的3XFlag蛋白标签序列，构建成功的载体表达后目的蛋白的N端或C端带有一段很短的Flag蛋白标签,此Flag蛋白标签可以与Flag蛋白标签抗体结合,将目的蛋白沉淀下来。
5.根据权利要求3所述的技术方法，其特征在于步骤(2)将构建好的表达载体(质粒)转染进特定的细胞系中进行表达为: 选定一种要研究的细胞 系，将构建好的真核表达载体瞬时转染或稳定转染进细胞内进行表达。
6.根据权利要求3所述的技术方法，其特征在于步骤(3)用Flag蛋白标签抗体沉淀目的蛋白与其靶基因的DNA-蛋白复合物为: 用甲醛将细胞交联，其后再进行超声打碎基因组，再用Flag蛋白标签抗体沉淀目的基因与其靶基因的DNA-蛋白复合物，用特定珠子将复合物拽下，最后解交联回收得到的微量核酸。
7.根据权利要求2所述的技术方法，本方法的特点在于: a.提高了传统ChIP的特异性:由于Flag蛋白标签抗体与蛋白标签结合的特异性非常好，所以本方法较传统ChIP的特异性高，能够减少非特异的背景，提高可信度； b.减少了抗体的使用:传统方法需要大量的目的蛋白抗体来提高特异性，此方法能够减少抗体的使用，节省了一定的费用。
全文摘要
一种利用Flag蛋白标签沉淀目的蛋白的染色质免疫共沉淀技术是在目的蛋白的序列上加上了一小段Flag蛋白标签序列，构建这样一种真核表达载体后，将其转染进细胞内表达，在做染色质免疫共沉淀的过程中，突破传统的方法，用Flag蛋白标签抗体代替目的蛋白抗体进行免疫沉淀。与传统的方法相比，此方法提高了抗体沉淀目的蛋白的特异性，减少了抗体的使用，大大降低了实验的费用。
文档编号C12N15/10GK103146685SQ20131007337
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月8日 优先权日2013年3月8日
发明者张玉祥, 赖瑞 申请人:首都医科大学