Dtt处理结合chip与emsa体内外分析拟南芥hsf1三聚体形成的方法
【专利摘要】本发明公开了一种二硫苏糖醇处理结合染色质免疫沉淀技术与电泳迁移率变动分析体内外分析拟南芥热激转录因子HSF1三聚体形成的方法。在以往的研究中，关于蛋白质分子间二硫键的研究方法主要采用物理化学的方法结合生物信息学进行分析，本方法采用分子生物学的方法，采用二硫键的还原剂二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT)进行处理HSF1后，再从生物学功能的角度结合染色质免疫沉淀技术(CHIP)与电泳迁移率变动分析(EMSA)体内外研究HSF1的活性状态，从而揭示三聚体形成与二硫键的关系，此方法可以把结构和功能有效的结合，是研究HSF1三聚体形成的有效方法。
【专利说明】DTT处理结合CHIP与EMSA体内外分析拟南芥HSF1三聚体形成的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物【技术领域】，具体而言，涉及DTT处理结合CHIP与EMSA体内外分析拟南芥HSFl三聚体形成的方法。
【背景技术】
[0002]植物热激因子(heat shock transcript1n factor, HSF)是真核生物热激反应的主要转录调控因子，它属于一类在真核细胞领域保守的蛋白家族。目前对植物HSF的研究主要是以模式植物拟南芥为对象，在拟南芥中存在21个HSFs的同源体，组成HSF家族。虽然目前对绝大多数同源体的功能还不了解，但研究显示其中HSFl是与耐逆境有关的主要调控因子[7_9] JtHSFl境信号转导机理研究显示，与大多数HSF相似，在非逆境条件下，HSFl以非活性的单体形式存在，逆境诱导HSFl单体形成三聚体(活性)、与靶DNA启动子区HSE (5’ -nGAAnnTTCnnGAAn-3’)特异性结合，从而调控逆境防御基因的表达。然而，不清楚AtHsfAl三聚体是如何形成而调控逆境防御基因表达，研究热激因子三聚体形成的化学本质与机理是未来研究的发展趋势。对哺乳动物HSFl的基因进行定点突变研究发现:HSF1由单体转化为多聚体活化形式需要两个较保守的半胱氨酸残基，这两个半胱氨酸在氧化条件下可形成二硫键，暗示不同逆境信号诱导热激因子形成三聚体可能是通过半胱氨酸氧化作用。然而不清楚拟南芥HSFl感应逆境形成三聚体是否也是通过半胱氨酸氧化作用。研究显示HSFl的寡聚域(HR-A/B)中含有I个半胱氨酸(Cys)，HSFl三聚体与二硫键的关系是目前研究的热点。在以往的研究中，关于蛋白质分子间的研究方法包括生物化学、生物物理学、遗传学和计算机等领域的方法。所涉及的尖端技术包括表面质粒共振技术、荧光共振能量转移、荧光极化、等温滴定量热法、圆二色分析、蛋白质片段补充试验、各种双杂交系统，以及蛋白质组方法和生物信息学方法。对于二硫键的研究方法主要采用物理化学的方法结合生物信息学进行分析，早期确证二硫键配对方式，是通过HPLC肽谱比较还原性与非还原性酶解后的肽段混合物，找出并收集差异峰，通过氨基酸组成分析或N端测序来确定肽段序列，并推测二硫键的配对方式。该方法过程繁琐，精确度低，成功率低，很难确定复杂蛋白质样品的二硫键配对方式。后来随着质谱的出现，应用MALD1-T0F分析还原性与非还原性酶解后的肽段混合物的质量肽谱图，确定二硫键相连肽段的分子量，从而推测二硫键配对方式。该法找到的肽段覆盖率较低，约为40%左右，只能找到少数的二硫键。另外，该法处于一级质谱水平，可信度大打折扣。目前应用更先进的液质联用质谱技术与多酶解相结合，通过串联质谱技术，对找到的二硫键链接的肽段进行二级质谱分析，提高了覆盖率到90%左右，从而显著提高了找到二硫键的机会，但这种研究方法仅从分子结构的角度去验证，由于生物分子结构的复杂性，导致实验的难度增大。本方法采用分子生物学的方法，采用二硫键的还原剂二硫苏糖醇(DL-Dith1threitol，DTT)进行处理HSFl后，从热激因子HSFl体内外的生物学功能来推测其三聚体是否形成，如何形成。体内研究HSFl的生物学功能采用染色质免疫沉淀技术，其染色质免疫沉淀技术的基本原理是在生理状态下把细胞内的蛋白质和DNA共价交联在一起，超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合体，用Protein-A/G-Agarose/Sepharose特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，用不含Dnase的Rnase和ProteinaseK解除交联，纯化DNA，通过对目的片断的检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。此方法可以克服体外研究DNA-蛋白质相互作用的局限，具体表现在以下几个方面:首先，每次分离转录调控蛋白结合的靶DNA片段，不仅能得到一些亲和力高的DNA片段，还能富集亲和力弱的靶DNA片段。其次体内蛋白质与DNA的结合可以充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况，找出在生理条件下某个DNA结合蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况。体外研究HSFl的生物学功能采用电泳迁移率变动分析(EMSA)又称为凝胶阻滞分析，它是一种在体外证实目的蛋白与靶DNA直接结合的方法。在EMSA中，目的蛋白与生物素标记的靶DNA混合后，用电泳分离，如果目的蛋白结合于靶DNA，电泳带移动将会缓慢。二硫苏糖醇处理后，从生物学功能的角度结合染色质免疫沉淀技术(CHIP)与电泳迁移率变动分析(EMSA)体内外研究HSFl的活性状态，从而揭示三聚体形成与二硫键的关系。这种方法可以把拟南芥热激转录因子HSFl结构和功能有效的结合，是研究HSFl三聚体形成的有效方法。
【发明内容】
[0003]为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种DTT ( 二硫苏糖醇)处理结合CHIP (染色质免疫沉淀技术)与EMSA (电泳迁移率变动分析)体内外分析HSFl (拟南芥热激转录因子)三聚体形成的方法。可以把拟南芥热激转录因子HSFl结构和功能有效的结合，是研究HSFl三聚体形成的有效方法。
[0004]为达到上述目的，本发明的技术方案为:
[0005]一种DTT处理结合CHIP与EMSA体内外分析拟南芥热激转录因子HSFl三聚体形成的方法，包括如下步骤:
[0006]步骤一、逆境处理拟南芥小苗和热激因子HSFl ；
[0007]步骤二、DTT处理逆境胁迫后拟南芥小苗和纯化的蛋白；
[0008]步骤三、将上述各种体内逆境处理和未处理的小苗用甲醛交联和染色质免疫沉淀技术，获得染色质免疫沉淀DNA ；
[0009]步骤四、利用电泳迁移率变动分析EMSA研究不同逆境在体外对HSFl的激活。
[0010]进一步的，所述步骤一中，逆境处理拟南芥小苗和热激因子HSFl的具体步骤为:
[0011]逆境处理拟南芥小苗和热激因子HSFl:
[0012](1.1)逆境处理拟南芥小苗:
[0013]取生长4周的小苗放入培养buffer中进行以下逆境处理:
[0014](I)热激处理:39°C水浴中震荡培养30min ；
[0015](2)酸胁迫:经琥珀酸调整后pH值为3.5，在真空下处理20min ；
[0016](3)碱胁迫:经Tris调整后pH值为8.0,在真空下处理20min ；
[0017](4) H2O2胁迫(氧化胁迫):加入H2O2使其终浓度为0.4mM,在真空下处理45min ；
[0018](5)盐胁迫:加入NaCl使其终浓度为1.2M,在真空下处理45min ；
[0019](6)渗透胁迫:加入山梨醇使其终浓度为1.7M,在真空下处理45min ；
[0020](7)对照:不经过任何逆境处理；
[0021](1.2)逆境处理热激因子HSFl:
[0022](1.2.DHSFl的非变性表达纯化；
[0023](1.2.2) HSFl的体外逆境处理；
[0024](I)热胁迫:取140 μ I纯化后的HSFl重组蛋白，39°C处理30min ；
[0025](2)酸胁迫:琥珀酸 0.05M, pH 为 6.5，处理 20min ；
[0026](3)碱胁迫=Tris 浓度为 0.33M，pH 为 8.8，处理 20min ；
[0027](4) H2O2胁迫(氧化胁迫):过氧化氢浓度为0.4mM,处理45min ；
[0028](5)盐胁迫=NaCl浓度为1M，处理Ih ；
[0029](6)渗透胁迫:山梨糖醇浓度为1M，处理Ih ；
[0030](7)对照:不经过任何逆境处理；
[0031]进一步的，所述步骤二中，DTT处理逆境胁迫后拟南芥小苗和纯化的蛋白的具体步骤包括:
[0032](I) DTT处理逆境胁迫后拟南芥小苗；
[0033]将上述各种逆境处理和未处理的小苗，在室温下浸入交联缓冲液中，加入50mMDTT在真空下处理Ih ；
[0034](2) DTT处理逆境胁迫后纯化的蛋白；
[0035]取140ul蛋白质分别用热、酸、碱、H2O2逆境处理后，用DTT处理；将DTT加入至终浓度为5mM，25°C条件下放置30min。
[0036]进一步的，所述步骤三中，染色质免疫沉淀的具体步骤为:
[0037](I)、封闭和洗涤蛋白A琼脂糖胶；
[0038]在1.5ml Eppendorf管中加入60 μ 150%悬浮的蛋白A琼脂糖胶,每次以Iml裂解缓冲液 l(50mM HEPES-K0H, ρΗ7.5,140mM NaCl, ImM EDTA, 1% TritonX-100,0.1%脱氧胆酸钠，ImM PMSF)洗涤两次，lOOOrpm，4°C，离心lmin，收集蛋白A琼脂糖胶，再加ImlI % BSA于上述蛋白A琼脂糖胶中，4°C共培养6h封闭其非特异性位点；
[0039]用Iml裂解缓冲液I洗封闭后的蛋白A琼脂糖胶，lOOOrpm, 4°C，离心lmin，收集沉淀；重复洗涤一次，离心收集沉淀；
[0040](2)、抗血清与拟南芥细胞上清液共培养；
[0041]加60 μ I抗AHSF的抗血清于上述拟南芥细胞上清液中，4°C共培养4h ;对照实验中加等体积的PBS缓冲液；
[0042](3)、蛋白A琼脂糖胶和抗体共温育后的拟南芥细胞共培养；
[0043]蛋白A琼脂糖胶沉淀转入与抗体共温育后的拟南芥细胞破碎液中，4°C冰浴培养30min一 Ih ; lOOOrpm, 4°C,离心 lmin,收集沉淀；
[0044](4)、洗涤蛋白A琼脂糖胶；
[0045](5)、洗脱免疫沉淀DNA和蛋白质复合物；
[0046](6)、Klenow DNA聚合酶处理免疫沉淀DNA和蛋白质复合物；
[0047]
【权利要求】
1.一种DTT处理结合CHIP与EMSA体内外分析拟南芥热激转录因子HSFl三聚体形成的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一、逆境处理拟南芥小苗和热激因子HSFl ； 步骤二、DTT处理逆境胁迫后拟南芥小苗和纯化的蛋白； 步骤三、将上述各种体内逆境处理和未处理的小苗用甲醛交联和染色质免疫沉淀技术，获得染色质免疫沉淀DNA ； 步骤四、利用电泳迁移率变动分析EMSA研究不同逆境在体外对HSFl的激活。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤一中，逆境处理拟南芥小苗和热激因子HSFl的具体步骤为: 逆境处理拟南芥小苗和热激因子HSFl: (1.D逆境处理拟南芥小苗: 取生长4周的小苗放入培养buffer中进行以下逆境处理: (1)热激处理:39°C水浴中震荡培养30min； (2)酸胁迫:经琥珀酸调整后pH值为3.5，在真空下处理20min ； (3)碱胁迫:经Tris调整后pH值为8.0,在真空下处理20min ；(4)H2O2胁迫(氧化胁迫):加入H2O2使其终浓度为0.4mM,在真空下处理45min ； (5)盐胁迫:加入NaCl使其终浓度为1.2M,在真空下处理45min ； (6)渗透胁迫:加入山梨醇使其终浓度为1.7M,在真空下处理45min ； (7)对照:不经过任何逆境处理； (1.2)逆境处理热激因子HSFl: (1.2.DHSFl的非变性表达纯化； (1.2.2) HSFl的体外逆境处理； (1)热胁迫:取140μ I纯化后的HSFl重组蛋白，39°C处理30min ； (2)酸胁迫:琥珀酸0.05M, pH为6.5，处理20min ； (3)碱胁迫=Tris浓度为0.33M，pH为8.8，处理20min ； (4)H2O2胁迫(氧化胁迫):过氧化氢浓度为0.4mM,处理45min ； (5)盐胁迫=NaCl浓度为1M，处理Ih； (6)渗透胁迫:山梨糖醇浓度为1M，处理Ih； (7)对照:不经过任何逆境处理。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，DTT处理逆境胁迫后拟南芥小苗和纯化的蛋白的具体步骤包括: (1)DTT处理逆境胁迫后拟南芥小苗； 将上述各种逆境处理和未处理的小苗，在室温下浸入交联缓冲液中，加入50mMDTT在真空下处理Ih ； (2)DTT处理逆境胁迫后纯化的蛋白； 取140ul蛋白质分别用热、酸、碱、H2O2逆境处理后，用DTT处理；将DTT加入至终浓度为5mM，25°C条件下放置30min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，染色质免疫沉淀的具体步骤为: (1)、封闭和洗涤蛋白A琼脂糖胶； 在1.5ml Eppendorf管中加入60 μ 150%悬浮的蛋白A琼脂糖胶,每次以Iml裂解缓冲液 I (50mM HEPES-K0H, ρΗ7.5，140mM NaCl, ImM EDTA, 1% TritonX-100,0.1 %脱氧胆酸钠，ImM PMSF)洗涤两次，lOOOrpm，4°C，离心lmin，收集蛋白A琼脂糖胶，再加ImlI % BSA于上述蛋白A琼脂糖胶中，4°C共培养6h封闭其非特异性位点； 用Iml裂解缓冲液I洗封闭后的蛋白A琼脂糖胶，lOOOrpm，4°C，离心lmin，收集沉淀；重复洗涤一次，离心收集沉淀； (2)、抗血清与拟南芥细胞上清液共培养； 加60 μ I抗AHSF的抗血清于上述拟南芥细胞上清液中，4°C共培养4h ;对照实验中加等体积的PBS缓冲液； (3)、蛋白A琼脂糖胶和抗体共温育后的拟南芥细胞共培养； 蛋白A琼脂糖胶沉淀转入与抗体共温育后的拟南芥细胞破碎液中，4 °C冰浴培养30min一 Ih ; lOOOrpm, 4°C,离心 lmin,收集沉淀； (4)、洗涤蛋白A琼脂糖胶； (5)、洗脱免疫沉淀DNA和蛋白质复合物； (6)、KlenowDNA聚合酶处理免疫沉淀DNA和蛋白质复合物；免疫沉淀?合物90 μ?1mMdNTPsI μ?10 ? buffer10 μ?Klenow(2 U/μΙ)I μ? 在0.5ml的Eppendorf管中依次加入上述试剂和免疫沉淀复合物，混匀后并短暂离心，在 25°C反应 30min，75°C加热 1min ； (7)、蛋白酶K水解蛋白； 加入等体积(102 μ I) lmg/ml 蛋白酶 K (溶于 50mM Tris, 1mM EDTA, 0.3 %SDS, ρΗ7.5)，60°C水浴过夜； (8)、免疫沉淀DNA的分离纯化； 向上述获得的免疫沉淀DNA洗脱液中加入等体积的苯酚/氯仿(1:1)混合物，涡旋混勻；14000rpm离心3min,将上清转至新的1.5ml离心管中；加等体积苯酹/氯仿(1:1)，混勻后14000rpm离心3min ;取上清,加等体积氯仿抽提，14000rpm离心3min ;上清转至1.5ml离心管中；加1/10体积的醋酸钠，2.5倍体积100%的乙醇及20 μ g糖元，-20°C，静置过夜；14000rpm离心30min ;去上清,M 70%酒精洗沉淀；14000rpm离心30min ;抽干，加入20 μ ITE缓冲液(或无菌水)溶解沉淀，-20°C保存； (9)、PCR分析免疫沉淀DNA； 根据己发表的拟南芥热激基因及非热激基因的全基因序列分别设计启动子区引物18.2P、70P和编码区的引物18.2C ； 用以下体系进行PCR检测；10 X PCR buffer2μ1
PCR扩增的参数为:94°C预变性5min，然后以94°C 20s为变性参数，49_56°C 20s为退火参数，72°C 1s为延伸参数，循环数为25 ;经10% DNA聚丙烯酰氨凝胶分析PCR产物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(9)中，所述启动子区引物18.2P、70P和编码区的引物18.2C的序列分别为:启动子区引物18.2P序列为:
AtHSP 18.2/-229u:5’ -ATT TTT CTT GGC ATT TCA GG-3’
AtHSP 18.2/-243d:5’ -GCA TTT CGG TCT TGT TTC A_3’ (52°C ) 启动子区引物70P序列为:
AtHSP 70/-304u:5’ -AAA TTG TCA AAT AGT AAC TC-3’
AtHSP 70/-325d:5’ -ATG TTA ATT GGG TGA TGA A -3’ 编码区的引物18.2C序列为:
AtHSP 18.2/-5014u:5’ -TGA CGT TGT TTA AAT CTG TTC-3，
AtHSP 18.2/-5033d:5’ -CCG TAC GCA TCC TTC TC-3，。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四利用电泳迁移率变动分析EMSA研究不同逆境在体外对HSFl的激活的具体步骤为: (1)、探针的制备: 采用与保守序列相同的片断做为探针，用Touch down PCR合成双链；
Perfect-HSE: 5，-GGCTTCAAGAAGCTTCTATG-3，，5，-CATAGAAGCTTCTTGAAGCC-3’(3，生物素标记) (2)、EMSA结合反应: 如下设置EMSA结合反应: 阴性对照反应:其中阴性对照I为未经任何逆境处理；阴性对照2为未加DTT:
样品反应:加入逆境处理HSFl:
【文档编号】C12Q1/68GK104198719SQ201410335904
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】郭丽红, 刘艳芳, 苏源, 杨晓虹, 陈子牛 申请人:昆明学院