专利名称：一种抗Her2免疫细胞因子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种抗Her2免疫细胞因子及其应用。
背景技术：
癌症是死亡率最高的疾病之一。我国每年新增癌症病人约200万人，其中乳腺癌发病率在我国城区以平均每年递增4%的幅度上升。美国每年有>18万妇女患乳腺癌，我国的年发病率尚无确切的统计资料，但根据我国巨大的人口数量，年患病人数应远超过美国。Her2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于I型生长因子受体家族成员。Her2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等多种上皮细胞来源的恶性肿瘤中过表达，而在正常组织中表达水平很低。因此，Her2是肿瘤免疫治疗的理想靶分子。自1998年美国FDA批准抗Her2抗体(Here印tin)用于Her2过表达乳腺癌患者的临床治疗以来，乳腺癌的分子靶向治疗已取得了较大的成绩，2007年Herceptin的销售额达到约40亿美元。从抗体治疗的结果看，单用Herc印tin作为临床一线用药的有效率为15-30%，与化疗药物联合应用有效率可增至50%。但是，并非所有Her2高表达的患者可从抗体治疗中受益，其中一半以上的患者对Herceptin治疗不敏感,且在用药一年后，较大比例的Herceptin治疗有效的患者出现耐药，导致治疗失败。Herc印tin治疗无效及耐药的机制尚不清楚，但研究表明，发展具有不同作用机制的新型靶向Her2的药物，将填补现有产品治疗谱的空白，为更多的患者提供新的用药选择。例如，2007年美国FDA批准上市的Lapatinib是一种新型靶向Her2酪氨酸激酶结构域的小分子药物，其作用机制与Herceptin不同。Lapatinib单独应用的有效率为28%，但是作为二线药物用于Herc印tin治疗失败后的患者，有效率仍有8%，这一结果具有重要的实际意义，为H erceptin耐药或治疗失败的患者带来了新的生存希望。专家预测，2010年Lapatinib的年销售额达到10亿美元。又如正在进行III期临床试验的治疗性抗体Pertuzumab是新开发的Her2特异性抗体,其作用位点与Herceptin不同,可结合于Her2 二聚化功能域，阻止Her2同源二聚体形成及与其他Her家族成员形成异源二聚体，从而阻断配体激活的Her2信号传导。临床前研究表明,Pertuzumab对Her2低表达的肿瘤亦有抑制作用。Pertuzumab的上市将为一大批Her2低表达、无药可用的患者提供治疗选择的机会。不同作用机制的靶向药物抗肿瘤谱具有互补性。在当前大力倡导循证医学及个体化治疗的实践中，发展新型靶向Her2抗肿瘤药物十分必要，将为临床医师和广大患者提供更为合理的用药选择。白介素2 (IL-2)是免疫反应中的重要介导分子，也是已知最强有力的抗肿瘤细胞因子之一，具有广泛的生物学活性。然而，IL-2的全身用药常在远离肿瘤部位的循环中产生高浓度，而在肿瘤局部的微环境中却达不到治疗的最佳浓度。由于IL-2的全身用药可导致致命的副作用，这使IL-2的治疗剂量大受限制。如何提高细胞因子在肿瘤局部的有效浓度，增强其抗肿瘤活性，同时避免全身性毒性反应一直是研究者们努力的方向。免疫细胞因子是利用基因工程方法构建的肿瘤特异性抗体与细胞因子的融合蛋白。其作用机制与其它抗肿瘤靶向性生物技术药物不同。它可利用抗体特异性的靶向功能，将具有抗肿瘤活性的细胞因子携至肿瘤组织局部，以提高肿瘤局部的细胞因子浓度，在靶部位招募、刺激免疫细胞，产生对肿瘤细胞的特异性杀伤，特别对于转移性病灶及微小残留病灶的治疗具有很大的优越性。目前国外已有2种免疫细胞因子正在进行1、II期临床试验。I期临床试验的结果表明，免疫细胞因子可诱发机体的免疫激活，治疗剂量仅为7.5mg/平方米/天，比普通抗体治疗的用量减少了几十倍！采用基因工程方法，已成功设计、构建含抗Her2 scFv、人IgGl的Fe段、IL-2的融合蛋白(HF)。HF保留了识别ErbB-2抗原的能力及IL-2的生物学活性。然而HF存在如下缺陷:1、生物学活性低；2、表达水平低，不能用于规模化生产。这些缺陷使HF的临床应用受到了很大的限制，急需对HF进行分子改造以克服规模化生产的瓶颈，使HF能应用于Her2阳性的乳腺癌的临床治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗Her2免疫细胞因子。本发明的目的还在于提供编码上述抗Her2免疫细胞因子的基因。本发明的目的还在于提供一种含抗Her2免疫细胞因子基因的重组载体。本发明的目的还在于提供了一种表达抗Her2免疫细胞因子的细胞系和宿主菌。本发明的目的还在于提供上述抗Her2免疫细胞因子在制备治疗Her2阳性乳腺癌的抗体类药物中的应用。本发明的目的还在于提供上述述抗Her2免疫细胞因子在制备治疗Her2阳性、Herceptin (赫赛汀)耐药的乳腺癌的抗体类药物中的应用。一种抗Her2免疫细胞因子，所述免疫细胞因子包括人⑶16单克隆抗体重链信号肽、Her2抗体重链可变区、Linker 1、Her2抗体轻链可变区、人IgGl的Fe段、Linker 2及IL-2成熟肽。上述免疫细胞因子的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示，所述Linker I的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.2所示，所述Linker 2的氨基酸序列如序列表中SEQID N0.3 所示。编码上述抗Her2免疫细胞因子的基因。含有权利要求2所述抗Her2免疫细胞因子编码基因的载体，如真核表达载体pCIDo含有权利要求2所述抗Her2免疫细胞因子编码基因的细胞系，如CHO/dhfr-细胞。含有权利要求2所述抗Her2免疫细胞因子编码基因的宿主菌，如E.coli JM109。上述抗Her2免疫细胞因子在制备治疗Her2阳性乳腺癌的抗体类药物中的应用。上述抗Her2免疫细胞因子在制备治疗Her2阳性、赫赛汀(Here印tin)耐药的乳腺癌的抗体类药物中的应用。本发明的有益效果:1.本发明的抗Her2免疫细胞因子生物学活性及产量明显提高。2.本发明的抗Her2免疫细胞因子可在体内外有效抑制Her2高表达的肿瘤细胞增殖。
3.本发明的抗Her2免疫细胞 因子可在体内外有效抑制Herceptin耐药的乳腺癌细胞增殖。
图1为抗Her2免疫细胞因子的结构示意图。图2为含抗Her2免疫细胞因子的基因载体质粒图。图3为HFI与HF在工程细胞中的表达量。图4为HFI和HF蛋白与抗原的结合活性。图5为HFI和HF蛋白的生物学活性。图6 HFI在体外对高表达Her2的乳腺癌细胞增殖的影响。图7 HFI在体内对高表达Her2的乳腺癌移植瘤增殖的影响。图8 HFI在体外对Herc印tin耐药乳腺癌细胞BT474、MDA_453和SKBR3增殖的影响。图9 HFI在体内对Herc印tin耐药乳腺癌细胞移植瘤增殖的影响。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤为常规实验方法，请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说 明书。以下实施例采用的实验材料来源:E.coli JM109工程菌株购自天根生物科技有限公司;CH0、BT474、MDA-453、SKBR3、MCF-7 细胞购自 ATCC ；T4 DNA 连接酶为 Gibco BRL公司产品；限制性内切酶为Biolab公司产品；Taq DNA聚合酶、克隆载体pGEM_T Easy为Promega公司产品；Ex Taq DNA聚合酶为TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自QIAGEN公司；Protein A亲合层析介质购自本元正阳公司；胎牛血清(FCS)、DMEM培养基、1640培养基为HyClone公司产品；MTX (氨甲喋呤)及MTT (四噻唑蓝)为Sigma公司产品。实施例1抗Her2免疫细胞因子基因表达载体的构建抗Her2免疫细胞因子包括人⑶16单克隆抗体重链信号肽、Her2抗体重链可变区、Linker UHer2抗体轻链可变区、人IgGl的Fe段、Linker 2及IL-2成熟肽,其结构如图1所示，其是在HF融合蛋白的基础上对Linker 2进行改进而成，命名为HFI，其中Linker I的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.2所示，Linker 2的氨基酸序列如序列表中SEQ IDN0.3所示。以含抗人CD16单克隆抗体重链信号肽、抗Her2 scFv、人IgGl的Fe段、IL_2的融合蛋白基因载体PCID/HF为模板(载体中融合蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5所示)，用引物Pl (其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.6所示)和P2 (其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.7所示)PCR扩增含有编码抗人⑶16单克隆抗体重链信号肽的基因、Her2抗体重链可变区的基因、Linker 1、Her2抗体轻链可变区的基因及人抗体IgGl的Fe基因的片段，条件为:95°C变性2 min ;然后94°C变性I min、58°C退火I min、72°C延伸2 min，进行30个循环；最后72°C延伸10 min。以NheI和XhoI位点插入表达载体pCID中，获得载体 pCID/ScFv-Fc。用引物P3(其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.8所示)和P4 (其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.9所示)PCR扩增含有编码N末端含有优化后的具有优良特性的十肽Linker2及IL-2成熟肽的基因片段。扩增条件为:95°C变性2 min ;然后94°C变性I min、56°C退火I min、72°C延伸I min，进行30个循环；最后72°C延伸10 min。以XhoI和MluI位点插入表达载体pCID/ScFv-Fc中，获得真核表达载体pCID/HFI，如图2所示。将pCID/HFI转化JM109感受态菌，筛选阳性克隆、扩增并纯化质粒DNA，具体步骤为:I) 100 μ 感受态菌置于冰水，加入DNA 0.5 μ ，静置30分钟；2) 42 °C 水浴 2 分钟；3)冰浴5分钟；4)加入不含抗生素的LB培养基，37°C下，150 rpm振荡培养50分钟。5)将转化菌接种于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，置37°C孵箱培养过夜。6)挑选阳性克隆4个，分别接种于LB液体培养基，置37°C摇床震荡培养。7)用试剂盒提取阳性克隆质粒DNA。用Nhe I和MluI双酶切鉴定质粒DNA，得到编码抗Her2免疫细胞因子的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4所示,经Invitrogen公司测序验证。
双酶切体系为:H2O 18 μ Buffer (IOX)4 M-1DNA 16 μ Nhe I I μ Mlu I 0.9 μ ο37°C水浴4小时。实施例2工程细胞株的筛选及HFI的表达将CHO/dhfr-细胞培养于含10% FCS, 0.1 mo I/L次黄嘌呤、0.016 mol/L胸腺嘧啶脱氧核苷的頂DM培养基。按照Lipofectamine试剂说明书将重组载体PCI/HFI转染CHO/dhfr-细胞。转染细胞培养48 h后，采用夹心ELISA法检测免疫细胞因子的瞬时表达，方法同前。采用有限稀释法对转染的细胞进行克隆化培养，培养基为含10%透析FCS、10_6 MMTX的DMEM培养基。筛选过程中，在不同时间点，采用夹心ELISA法检测各细胞克隆的抗体表达水平。具体过程如下:用羊抗人IgG (2 μ g/ml)包被96孔板，4°C过夜。用2%牛血清白蛋白封闭Ih后，加入转染的CHO细胞培养上清，37°C温育lh。洗涤5次后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG (I:5000稀释)，37°C温育lh。洗涤5次后用OPD显色，测定0D490。高表达克隆在含MTX选择性培养基中继续传代，并采用夹心ELISA法检测，筛选出最高表达克隆，作为工程细胞株。将HFI工程细胞与HF工程细胞均以5 X IO6接种于底面积为150 cm2的培养瓶中，在相同培养条件下(30°C、5% C02)，培养6天。收获培养上清，通过夹心ELISA法检测上清中目的蛋白的含量，结果表明(如图3A所示)HFI培养上清中目的蛋白的的含量为0.30 mg/ml, HF培养上清中目的蛋白含量为0.19mg/ml.
收获培养上清，取5 μ I HFI与HF培养上清通过免疫印记法检测其目的蛋白含量，结果表明(如图3Β所示)HFI培养上清中目的目的蛋白含量为0.28 mg/ml, HF培养上清中蛋白含量为0.18 mg/ml。结果表明，经优化后的抗Her2免疫细胞因子(HFI)较HF在CHO细胞中具有更高的产量(**，？〈0.01)。取培养上清通过protein A亲和层析纯化，将纯化后的样品和培养上清通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色后分析。结果表明HFI的纯度大于90%。实施例3 HFI与HF抗原结合活性和生物活性检测实验收集I X IO6个SKBR3细胞，经PBS缓冲液洗涤后，加入不同浓度的纯化后的HFI及HF，冰浴震荡孵育30 min,用PBS洗3次，加入FITC标记的羊抗人IgG，冰浴下震荡孵育30min,用PBS洗3次,上流式细胞仪(Becton Dickinson公司)分析，以未与转染细胞培养上清孵育的细胞作为阴性对照。将培养的CTLL-2细胞用1640培养基洗3次，计数后，以3X IO4/孔接种于96孔板，同时加入纯化后的HFI及HF，以倍比稀释的IL-2标准品作为阳性对照。培养18 h后，力口Λ 10 μ I MTT (5 mg/ml)，继续培养 4 h。以 10% SDS-0.01 mol/L HCl 裂解细胞，测 A490 值。结果表明(如图4所示)，HFI的抗原结合活性略高于HF (*，ρ〈0.05) ,HFI的生物学活性显著高于HF (如图5所示;**,ρ〈0.01)。实施例4 HFI在制备杀伤Her2高表达乳腺癌细胞的药物方面的应用1、体外抑制高表达Her2的乳腺癌细胞增殖MCF-7细胞及MCF-7/Her2 (高表达Her2的MCF-7细胞)以3 X IO3/孔接种96孔板，同时加入纯化后的HFI (10 μ g/ml,图6B),以商品化Herceptin (20 μ g/ml,图6A)作为对照药物。培养96 h后加入10 μ I MTT (5 mg/ml)，继续培养4 h。以10%SDS_0.01mol/L HCl裂解细胞，测A490值。结果如图6所示，HFI能在体外特异性抑制高表达Her2的乳腺癌细胞MCF_7/Her2细胞的增殖(#，P〈0.01)，而HFI对低表达Her2的MCF-7细胞的增殖无显著影响。2、体内抑制高表达Her2的乳腺癌细胞增殖4周龄裸鼠，背部皮下植入雌激素缓释药片。次日，将对数生长期BT474细胞按I X IO7/只接种于裸鼠右腋皮下。将实验动物随机为3组，6只/组。移植瘤接种后第5天开始给药。对照组(control):生理盐水,0.1 ml/次/只，每周两次；Herceptin组:商品化Herceptin,按照3 mg/kg/次/只，注射体积为0.1 ml,每周两次；HFI组:HFI纯化样品，按照0.5 mg/kg/次/只，注射体积为0.1 ml，每周两次。从移植瘤接种开始，每两天测量移植瘤体积，计算公式为:移植瘤体积=长径X短径2/2。结果表明，HFI能在裸鼠体内有效抑制移植瘤的生长，其疗效与Herc印tin治疗组相似(如图7所示)。实施例5 HFI在制备抗Herceptin耐药乳腺癌细胞增殖的药物方面的应用1、HFI体外抑制Herc印tin耐药乳腺癌细胞的增殖采用在培养体系中逐步提高Herceptin浓度的筛选方法，对高表达Her2的乳腺癌细胞BT474、MDA-453和SKBR3细胞进行驯化。经过6个月的筛选获得了三株Herc印tin耐药的细胞株(BT474-Herc印R、MDA-453- Here印R 和 SKBR3- Here印R)。将上述三种Here印tin耐药细胞以3 X IO3/孔接种96孔板，同时加入纯化后的HFI(5 μ g/ml),以商品化Herceptin (5 μ g/ml)作为对照。培养96 h后加入10 μ I MTT (5mg/ml)，继续培养 4 h。以 10%SDS-0.01 mol/L HCl 裂解细胞，测 A490 值。结果如图8所示,Herceptin对3种耐药细胞的增殖无显著影响,而HFI在体外对耐药乳腺癌细胞BT474、MDA-453和SKBR3的增殖具有显著的抑制作用(#，p〈0.01)。2、HFI体内抑制Herc印tin耐药乳腺癌细胞的增殖4周龄裸鼠，背部皮下植入雌激素缓释药片。次日，将对数生长期BT474-HerC印tin耐药细胞按I X IO7/只接种于裸鼠右腋皮下。将实验动物随机为3组，6只/组。移植瘤接种后第5天开始给药。对照组:生理盐水,0.1 ml/次/只，每周两次；Herceptin组:商品化Herceptin,按照3 mg/kg/次/只，注射体积为0.1 ml,每周两次；HFI组:HFI纯化样品，按照0.5 mg/kg/次/只，注射体积为0.1 ml，每周两次。从移植瘤接种开始，每两天测量移植瘤体积，计算公式为:移植瘤体积=长径X短径2/2。 结果表明，HFI在体内对乳腺癌耐药细胞株BT474移植瘤的增殖具有较强的抑制作用(如图9所示)。
权利要求
1.一种抗Her2免疫细胞因子，其特征在于，所述免疫细胞因子包括人CD16单克隆抗体重链信号肽、Her2抗体重链可变区、Linker 1、Her2抗体轻链可变区、人IgGl的Fe段、Linker 2及IL-2成熟肽。
2.根据权利要求1所述的一种抗Her2免疫细胞因子，其特征在于，所述免疫细胞因子的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示，所述Linker I的氨基酸序列如序列表中SEQID N0.2所示,所述Linker 2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0.3所示。
3.编码权利要求1所述抗Her2免疫细胞因子的基因。
4.含有权利要求3所述抗Her2免疫细胞因子编码基因的载体。
5.含有权利要求3所述抗Her2免疫细胞因子编码基因的细胞系。
6.含有权利要求3所述抗Her2免疫细胞因子编码基因的宿主菌。
7.权利要求1所述抗Her2免疫细胞因子在制备治疗Her2阳性乳腺癌的抗体类药物中的应用。
8.权利要求1所述抗Her2免疫细胞因子在制备治疗Her2阳性、赫赛汀耐药的乳腺癌的抗体类药物中的 应用。
全文摘要
本发明公开了属于基因工程技术领域的一种抗Her2免疫细胞因子及其应用。该免疫细胞因子的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示。本发明的抗Her2免疫细胞因子生物学活性及产量明显提高，可在体内外有效抑制Her2高表达的肿瘤细胞增殖、有效抑制Herceptin耐药的乳腺癌细胞增殖。
文档编号C12N1/21GK103214580SQ20131007314
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者施明, 郭宁 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所