培养基及其用途的制作方法

专利名称：培养基及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及内皮细胞再生技术领域，具体地涉及培养基及其用途。更具体地，本发明涉及用于体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的一组培养基和试剂盒，及其在体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞中的用途、体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法，以及内皮细胞或其衍生物。
背景技术：
心血管系统是胚胎发育中首先出现并发挥功能的系统。血管的发生和发育不仅对于胚胎形成中器官的发育和分化十分重要，对于成体的创伤修复和生殖功能也是具有重要意义的。血管发育在一系列病理现象中也有重要作用，如视网膜增殖、衰老相关的退行性斑点、类风湿性关节炎以及迄今仍无有效治疗手段的肿瘤发生等。血管内皮细胞裱衬在整个心血管系统的内表面，为单层扁平上皮，是血管壁与血液之间的分界细胞，是形成心血管封闭管道系统的形态基础。其在组织的动态平衡、纤维蛋白溶解和凝集、血液-组织分子交换、血管收缩调控、正常和肿瘤组织的血管化、以及生理和病理条件下的血细胞的活化和迁移中都发挥了重要作用。目前人们多认为血管内皮细胞除作为血液和组织间物质转运的屏障外，最主要的生物学功能是使循环血液保持流动状态，此外血管内皮细胞尚可合成与分泌多种结缔组织成分、参与一些物质的代谢及与白细胞相互作用等。上述这些生理过程的发挥都依赖于对血管内皮细胞精密的调控，而失调则导致病理现象的发生。研究决定内皮细胞分化和表型的分子机制对于阐明血管发生发育的原理、对梗 死或损伤组织的血管新生治疗以及抗肿瘤治疗都有重要的指导意义。人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)作为一种具备自我更新和无限增殖潜能的多能性细胞，其向内皮细胞分化的可能性为心血管疾病和四肢缺血的治疗提供了令人兴奋的前景。近年来，不断有研究证实，人胚胎干细胞hESCs具有分化成不同发育阶段的内皮细胞的能力。通过与小鼠的基质细胞共培养、诱导形成拟胚体(EBs)并添加促血管发育的因子、或与特殊的二维介质的共培养等策略营造内皮发育微环境，已有多个研究小组从hESCs中分化、分离到了内皮细胞。近期的研究结果显示hESCs来源的内皮细胞能形成新的血管，提高梗死心脏的功能，是细胞替代治疗中新的细胞源。虽然取得了这些成果，但是使用EBs (拟胚体)添加内皮相关诱导因子，与基质细胞共培养或者是使用基质胶添加因子来诱导分化产生内皮细胞，一般都会再通过分选的方式获得相对较纯的内皮细胞，之后再扩大培养。但是由于本身使用这些诱导方法产生的内皮细胞的比例及数量就较少，再加之分选之后在体外扩增的倍数有限，也难以用于临床治疗。高效快速的诱导胚胎干细胞向内皮祖细胞及内皮细胞进行分化依然是难以解决的问题。

发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够用于体外诱导胚胎干细胞(ESCs)分化为内皮细胞的培养基、试剂盒及方法。根据本发明的一个方面，本发明提供了一组培养基。根据本发明的实施例，该组培养基包括:第一培养基，该第一培养基为添加了胰岛素铁硒传递蛋白、BSA、非必需氨基酸和rhBMP-4的IMDM/F12培养基；第二培养基，该第二培养基为添加了胰岛素铁硒传递蛋白、BSA、非必需氨基酸、rhVEGF和rhbFGF的MDM/F12培养基；以及第三培养基，该第三培养基为EGM2培养基。发明人惊奇地发现，利用本发明的上述培养基能够高效快速地诱导ESCs向内皮祖细胞及内皮细胞进行分化，从而能够有效地制备获得大量的内皮细胞，进而能够有效地为ECs (即内皮细胞)应用于心血管疾病和四肢缺血的治疗提供了细胞基础。另外，根据本发明上述实施例的一组培养基还可以具有如下附加的技术特征:根据本发明的一个实施例，该MDM/F12培养基包含:75%的添加了 GlutaMAX -1的IMDM培养基；以及25%的添加了 GlutaMAX -1的F12培养基。其中，在本文中所述的“GlutaMAX -1”表示谷丙氨酸二肽。根据本发明的一个实施例，该第一培养基中包含1%的胰岛素铁硒传递蛋白(Insulin-Transferrin-Selenium, ITS)、0.05%BSA (即牛血清白蛋白)、1% 非必需氨基酸(其英文缩写为“NEAA”)和25ng/ml rhBMP-4 (即重组人骨形态发生蛋白4)。由此，利用该不含血清、成分明确且含有诱导分化因子rhBMP-4的第一培养基，在rhBMP-4合适的浓度及作用时间下能够高效诱导ESCs向中内胚层进行分化，这是由ESCs来源获得内皮细胞的基础。根据本发明的一个实施例，该第二培养基中包含1%胰岛素铁硒传递蛋白、0.05%BSA、1%NEAA (非必需氨基酸)、50ng/ml rhVEGF (即重组人血管内皮细胞生长因子)以及50ng/ml rhbFGF (即碱性成纤维细胞生长因子)。由此，利用该不含血清、成分明确且含有对于内皮诱导分化及扩大培养有明显促进作用的rhVEGF和rhbFGF生长因子的第二培养基，能够有效地诱导ESCs来源的中内胚层细胞向内皮祖/内皮细胞分化。根据本发明的一 个实施例，进一步包括:第四培养基，该第四培养基为添加了Knockout血清替代物、L-谷氨酰胺、P -巯基乙醇、非必需氨基酸和rhbFGF的D-MEM/F-12培养基；以及第五培养基，该第五培养基为mTeSR培养基。根据本发明的一个实施例，第四培养基中包含20%KnoCkout血清替代物、ImML-谷氨酰胺、0.1mMP-巯基乙醇、1%非必需氨基酸和5ng/ml bFGF。根据本发明的一些实施例，该成分明确，营养丰富，含有能够维持ESCs (胚胎干细胞)干性的rhbFGF生长因子的第四培养基，能够与滋养层细胞共同长期培养ESCs并能够有效维持ESCs的特性。根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种用于体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包含前面所述的本发明的一组培养基。根据本发明的一些实施例，利用本发明的试剂盒，采用其中的培养基培养胚胎干细胞，能够高效地实现体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞，从而能够有效地制备获得大量的内皮细胞，对于心血管疾病和四肢缺血的治疗意义重大。根据本发明的另一方面，本发明还提供了前面所述的一组培养基，或者试剂盒在体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞中的用途。从而，利用上述一组培养基或试剂盒，能够有效地实现体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞，且诱导分化的效率尤其高。根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤:利用前面所述的一组培养基，培养胚胎干细胞。由此，能够高效快速地诱导ESCs向内皮祖细胞及内皮细胞进行分化，从而能够有效地制备获得大量的内皮细胞，其对心血管疾病和四肢缺血的治疗意义重大。根据本发明的一个实施例，在本发明的体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法中，胚胎干细胞来源于人类。根据本发明的一个实施例，在本发明的体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法中，利用前面所述的一组培养基，培养胚胎干细胞进一步包括:利用该第一培养基对该胚胎干细胞进行第一诱导分化培养，以便获得经过第一诱导分化培养的细胞；利用该第二培养基对该经过第一诱导分化培养的细胞进行第二诱导分化培养，以便获得经过第二诱导分化培养的细胞；以及利用该第三培养基对该经过第二诱导分化培养的细胞进行第三诱导分化培养，以便获得内皮细胞。发明人惊奇地发现，利用上述方法能够高效快速地诱导ESCs向内皮祖细胞及内皮细胞进行分化，从而能够有效地制备获得大量的内皮细胞，进而能够有效地为ECs应用于心血管疾病和四肢缺血的治疗提供了细胞基础，意义重大。需要说明的是，利用上述本发明的方法体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞时，第二诱导分化培养阶段结束后，已经有内皮祖和内皮细胞产生，即经过第二诱导分化培养的细胞中包含有部分内皮祖和内皮细胞。根据本发明的一个实施例，在本发明的体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法中，进行该第一诱导分化培养1.5-3天，优选2天。由此，能够有效促进ESCs向中内胚层分化。根据本发明的另一个实施例，在本发明的体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法中，进行该第二诱导分化培养为4-8天，优选4.5天。由此，能够进一步诱导经过第一诱导分化培养的细胞向内皮祖/内皮细胞分化。根据本发明的再一个实施例，在本发明的体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法中，进行该第三诱导分化培养为3-20天。由此，能够有效促进经过第二诱导分化培养的细胞向内皮祖/内皮细胞的分化，以及内皮祖/内皮细胞的进一步分化成熟。此外，根据本发明的另一个实施例，经过第三诱导分化培养后，可以继续利用第三培养基对获得的内皮细胞进行扩大培养。由此，能够有效制备获得大量内皮细胞。根据本发明的一个实施例，在进行该第一诱导分化培养之前，进一步包括:利用该第五培养基将该胚胎干细胞进行预培养，然后依次进行消化和传代处理。由此，可以有效去除部分滋养层细胞并扩大培养无滋养层培养的ESCs，为后续的诱导分化培养做准备。其中，根据本发明的一个实施例，进行该预培养5-7天。根据本发明的另一个实施例，利用1%的dispase酶进行该消化处理。根据本发明的再一个实施例，按照1:3的比例进行该传代处理2-3次。由此，经过多次无滋养层的传代处理后，可以完全去除滋养层细胞，从而能够避免滋养层细胞对后续诱导分化培养的影响，同时，多次的传代处理也可以获得大量ESCs细胞，为进一步诱导分化获得大量内皮祖/内皮细胞奠定了基础。根据本发明的一个实施例，在将该胚胎干细胞进行预培养之前，进一步包括:利用该第四培养基将该 胚胎干细胞进行滋养层细胞共培养。由此，能够在体外条件下长期维持ESCs的特性。此外，根据本发明的另一个实施例，进一步包括将经过滋养层细胞共培养的胚胎干细胞进行消化和传代处理。由此，可以实现经过滋养层细胞共培养的胚胎干细胞进一步的扩大培养，从而能够获得大量的ESCs，以便为后续的诱导分化培养做准备。其中，根据本发明的一个实施例，利用IV型胶原酶进行该消化处理，按照1:3或1:5的比例进行该传代处理。根据本发明的一个实施例，在进行该第三诱导分化培养之前，进一步包括:将该经过第二诱导分化培养的细胞进行消化和传代处理。由此，可以避免由于细胞的过度增殖而对诱导分化的效率产生负面影响。其中，根据本发明的一个实施例，利用0.25%的胰酶进行该消化处理。根据本发明的另一个实施例，按照1:2或1:3的比例进行该传代处理。根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种内皮细胞或其衍生物，其是通过前面所述的本发明的体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法获得的。根据本发明的实施例，本发明的内皮细胞或其衍生物，能够有效用于梗死或损伤组织的血管新生、四肢缺血以及抗肿瘤的治疗，对于现代医学的发展意义重大。需要说明的是，本发明的一组培养基以及利用该组培养基体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法，均是本发明的发明人经过艰苦的创造性劳动和大量的优化工作才完成的。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。


本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:图1显示了根据本发明一个实施例，本发明的体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的一般方法的流程示意图；图2显示了实施例1中经过第一诱导分化培养的细胞，其干性和中内胚层相关标志基因表达水平的RT-PCR检测结果以及细胞形态图，其中，图2A显示了干性和中胚层相关标志基因表达水平的RT-PCR检测结果，图2B显示了细胞形态图；图3显示了实施例1中经过第二诱导分化培养的细胞，其内皮细胞相关标志基因表达水平的RT-PCR检测结果、流式细胞术检测结果、血管样结构形成和植物凝集素结合实验结果以及细胞形态图，其中，图3A显示了内皮细胞相关标志基因表达水平的RT-PCR检测结果，图3B显示了内皮细胞相关标志基因表达水平的流式细胞术检测结果，图3C显示了细胞形态图，图3D显示了血管样结构形成和植物凝集素结合实验结果；图4显示了实施例1中经过第三诱导分化培养6天获得的内皮细胞，其内皮细胞相关标志基因表达水平的RT-PCR检测结果、流式仪检测结果和细胞形态图，其中，图4A是偏成熟内皮细胞相关标志基因表达水平的RT-PCR检测结果，图4B是内皮细胞相关标志基因⑶31和KDR表达水平的流式仪检测结果，图4C是细胞形态图。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。—般方法:根据本发明的一些实施例，参照图1，本发明的体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法一般包括以下步骤:首先，依次利用第四培养基将胚胎干细胞进行滋养层细胞共培养，以及利用第五培养基将胚胎干细胞进行预培养，然后，利用该第一培养基对该胚胎干细胞进行第一诱导分化培养，以便获得经过第一诱导分化培养的细胞。接着，利用该第二培养基对该经过第一诱导分化培养的细胞进行第二诱导分化培养，以便获得经过第二诱导分化培养的细胞。然后，利用该第三培养基对该经过第二诱导分化培养的细胞进行第三诱导分化培养，以便获得内皮细胞。实施例1参照图1，采用本发明的体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法，按照以下步骤培养胚胎干细胞:1、滋养层细胞共培养采用第四培养基，将小鼠成纤维细胞作为滋养层细胞与未分化的人胚胎干细胞细胞(即hESCs，Hl和H9)共培养。其中，第四培养基的基本组成为:78%D-MEM/F-12基本培养基(GIBC0，N0.12400-016)，添加了 20%Knockout 血清替代物(GIBC0，10828)，ImM L-谷氨酰胺(GIBC0, 35050) ,0.1mM^ -巯基乙醇(Invitrogen, 21985-023)，1% 非必需氨基酸(NEAA(英文缩写)，Invitrogen, 11140-050),以及5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF (英文缩写)，Millipore, GF003)。经过滋养层细胞共培养后，对hESCs进行观察，如果需要传代，则用IV型胶原酶将待传代的hESCs消化成小的细胞团，之后根据细胞密度按照1:3或者是1:5进行传代处理。2、预培养然后，将上述经过滋养层细胞共培养，生长状态良好的hESCs传代至无饲养层的Matrigel (超纯层纤连蛋白，BD，354277)上，用第五培养基即专用的mTeSR培养基(StemCell, #05850)进行培养。待hESCs生长至5_7天时，根据细胞的大小及密度进行消化处理，消化时使用lmg/ml dispase酶(中性蛋白酶,stem cell, 07923)。然后,将经过消化处理的细胞接种至铺有Matrigel的孔板中，常规静置培养。诱导分化前将经过预培养的hESCs进行2-3次无滋养层的传代处理。其中，进行上述传代处理，主要采用的仪器为:5910型离心机(日本久保田)，显微镜(OLYMPUS，CKX31)，具体方法包括:a、弃旧的培养基，用IXPBS洗三次。b、加入lmg/ml dispase酶(stem cell,07923)进行消化处理，并于显微镜下观察细胞，若克隆发生卷边，则弃dispase酶终止消化，并用I XPBS洗三次(避免用力吹打细胞，防止克隆丢失)。
C、添加入新的mTeSR培养基(Stem Cell, #05850)，并用该培养基轻柔吹打克隆，使得胚胎干细胞(ESCs)克隆从孔板上脱落。其中，要求尽量将所有克隆均吹打下来，并尽量将克隆吹打成均一大小的细胞团块。d、根据所得细胞密度，按照1:2或者1:3的比例，将上述hESCs克隆接种于含有mTeSR培养基并处理有Matrigel的孔板中，之后将细胞置于37°C，5%C02的培养箱中静置过夜培养。e、24小时后，根据克隆的大小进行换液处理(即继续培养)或者下面所述的诱导分
化培养。3、诱导分化培养按照以下步骤，将上述经过预培养及传代处理的hESCs进行内皮细胞的诱导分化:3.1第一诱导分化培养首先，待上述经过预培养及传代处理的hESCs贴壁后，根据克隆的大小选择是否进行内皮细胞的诱导分化。选取合适的孔板，要求孔板中含有尽可能多的大小合适的hESCs克隆(即含十几至几十个细胞的克隆)，利用第一培养基对其进行第一诱导分化培养48小时，以便获得经过第一诱导分化培养的细胞。其中，第一培养基为添加了 1%的胰岛素铁硒传递蛋白(ITS (英文缩写)，GIBC0，41400-045)、0.05%BSA (牛血清白蛋白，GIBCO，11021-029)、1% 非必需氨基酸(NEAA (英文缩写)，Invitrogen, 11140-050)和 25ng/ml 重组人骨形态发生蛋白 4 (rhBMP-4, RD, 314-BP)的MDM/F12培养基。其中，在本文中所述的“MDM/F12培养基”包含:75%的添加了GlutaMAX -1 的 MDM 培养基(GIBC0，31980)，以及 25% 的添加了 GlutaMAX _I 的 F12 培养基(GIBC0，37165)。3.2第二 诱导分化培养将上述获得的经过第一诱导分化培养的细胞，弃第一培养基并用PBS洗涤一次，之后利用第二培养基进行第二诱导分化培养4-8天，以便获得经过第二诱导分化培养的细胞。其中，第二培养基为添加了 1%胰岛素铁硒传递蛋白(GIBC0，41400-045)、
0.05%BSA(GIBCO, 11021-029)、1% 非必需氨基酸(Invitrogen, 11140-050)、50ng/ml 重组人血管内皮细胞生长因子(rhVEGF (英文缩写)，PEPR0TECH，100-20)以及50ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF (英文缩写)，Millipore, GF003)的頂DM/F12培养基。进行第二诱导分化培养4.5天后，经过第二诱导分化培养的细胞生长至接近孔板密度的90%以上。3.3第三诱导分化培养在开始第三诱导分化培养之前，利用0.25%胰酶，将经过第二诱导分化培养的细胞进行消化处理，并按照1:2或者是1:3的比例进行传代处理。其中，进行消化和传代处理，主要采用的仪器为:5910型离心机(日本久保田)，显微镜(OLYMPUS，CKX31)，具体方法包括:a、弃旧的培养基，用IXPBS洗三次。b、加入0.25%胰酶(AMRESC0，0458)，使用PBS进行配置，之后过滤除菌，4°C保存或者_20°C保存)进行消化处理，并于显微镜下观察细胞，若细胞间隙变大，细胞与孔板之间发生脱离则添加含10%血清的生长培养基(即MDM培养基+10%FBS)，终止消化。
C、收集细胞，于IOOOrpm条件下离心5分钟。之后弃上清并使用PBS重悬洗涤细胞，以便去除终止消化中使用的血清，然后于IOOOrpm条件下再次离心5分钟。d、弃上清，用EGM2培养基(Lonza，cc-4176)重悬细胞，并根据细胞密度，按照1:2或者1:3的比例进行接种，然后置于37°C，5%C02的培养箱中静置过夜培养。e、根据细胞生长情况，选择进行换液(即继续培养)或者是传代处理。然后，利用第三培养基，将上述经过第二诱导分化培养及传代处理的细胞进行第三诱导分化培养3-20天，以便获得内皮细胞。其中，第三培养基为EGM2培养基(Lonza, cc-4176)。进行第三诱导分化培养3_6天时，根据细胞密度考虑是否进行传代处理。其中，进行消化和传代处理，主要采用的仪器为:5910型离心机(日本久保田)，显微镜(OLYMPUS，CKX31)，具体方法包括:a、弃旧的培养基， 用IXPBS洗三次。b、加入0.25%胰酶(AMRESC0，0458)，使用PBS进行配置，之后过滤除菌，4°C保存或者_20°C保存)进行消化处理，并于显微镜下观察细胞，若细胞间隙变大，细胞与孔板之间发生脱离则终止消化。C、收集细胞，于IOOOrpm条件下离心5分钟。之后弃上清并用PBS重悬细胞，然后于IOOOrpm下离心5分钟。d、弃上清，用EGM2培养基(Lonza，cc-4176)重悬细胞，并根据细胞密度，按照1:2或者1:3的比例进行接种，然后置于37°C，5%C02的培养箱中静置过夜培养。此外，当细胞生长状态良好时，可进一步于第三培养基中进行扩大培养，以便获得更多的内皮细胞。实施例2分别对实施例1中获得的经过第一诱导分化培养的细胞、经过第二诱导分化培养的细胞，以及经过第三诱导分化培养6天获得的内皮细胞，进行流式细胞术和RT-PCR检测，并于显微镜下观察三个阶段中细胞的形态学变化。一、具体检测方法:1、流式细胞术检测使用仪器:5910型离心机(日本久保田)，DH-1I旋转混合仪(宁波新芝公司)，流式仪器(BD，FACSAria)o方法:1.1消化细胞:(I)弃旧的培养基，用IXPBS洗三次。(2)加入0.25%胰酶将待检测细胞进行消化处理，并于显微镜下观察细胞，若细胞间隙变大，细胞与孔板之间发生脱离则添加入新的终止培养基，终止消化。(3)收集细胞，于IOOOrpm条件下离心5分钟，之后弃上清并用PBS重悬细胞。1.2标记抗体:根据抗体说明书，将上述获得的经过消化处理的细胞置于离心管中并将4-7 X IO5细胞重悬于100 ill PBS中，之后添加相应的抗体，即抗人CD31-APC(eBioscience, 17-0319-42)和抗人 CD309-PE(血管内皮生长因子受体 2，VEGFR2/KDR; R&D systems, 560494),然后充分混勻，并将离心管置于旋转混合仪上进行流式抗体的孵育和标记，时间为40分钟。1.3 洗抗体:标记完成后，使用1.4ml PBS重悬上述经过抗体标记的细胞，并于IOOOrpm下离心5分钟。之后弃上清，并使用1.5ml PBS再次重悬细胞,然后于IOOOrpm下离心5分钟,之后重复该步骤(即弃上清、重悬之后离心)。1.4 重悬:弃上清，利用300-500 U I PBS或者2%多聚甲醛重悬经过上述处理的细胞。1.5流式细胞术检测按照产品说明书及操作指南，将上述获得的重悬细胞进行流式细胞术的检测。2、RT-PCR (实时定量 PCR)检测2.1RNA 提取使用仪器:离心机(sigma公司，3_18k)。方法:(I)细胞的收集-贴壁细 胞:于离心管中，利用胶原酶或胰酶将待检测细胞进行消化离心后，PBS洗两次，再次进行离心后弃上清，然后利用ImlTRIZOL(Invitrogen, 15596018)裂解细胞，之后按照后续步骤进行RNA的提取。(2)将样品(即经过裂解的细胞)于室温下静置5-15分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。(3)每管加入0.2ml氯仿(国药集团化学试剂有限公司，10006892)盖上盖子，剧烈充分摇匀15s，然后于室温下静置10分钟。(4)于4°C，12000g条件下离心15分钟，RNA溶解在上层的水层里边，体积大约为50%。(5)将上述离心管中的上层无色水相层轻柔转移至新的1.5ml离心管中。(6)向新的离心管中加入0.5ml异丙醇(国药集团化学试剂有限公司，80109292),之后轻柔混匀，室温放置lOmin。(7)于4°C，12000g条件下离心15分钟，弃上清，则底部会有白色的RNA沉淀。(8)弃上清，向离心管中加入由DEPC水(无RNA酶的水)配制的75%的酒精(国药集团化学试剂有限公司，10009292)，重悬RNA，之后于4°C，12000g下离心15分钟。(9)弃净上清，静置5-10min，待酒精挥发且底部RNA刚好变无色时加入10-30 ylDEPC水(无RNA酶的水)，之后进行浓度测定。(10)将提取获得的RNA于_70°C下保存，备用。2.2反转录使用TaKaRa的反转录系统，根据操作说明将0.8 y g上述提取获得的RNA进行20 u I体系的反转录。使用仪器:PCR仪(Eppendorff公司，mascercycler),小型台式离心机(杭州奥盛，K6)具体方法:(I)按照以下配比，将下述各组分充分混匀:
模版RNA 500-800ng (根据实际RNA浓度添加对应的体积)Oligo dT 引物 2.0ii I无RNA 酶的水(RNase Free dH20 (DEPC 水))使液体终体积为 12.0 iU。(2)将上述混合物进行离心，然后置于70°C下lOmin，冰上急冷2min，再离心数秒，使液体集中于离心管管底，以便获得经过处理的模版RNA。(3)按照以下配比，于离心管中配制反转录反应体系:
权利要求
1.一组培养基，其特征在于，包括: 第一培养基，所述第一培养基为添加了胰岛素铁硒传递蛋白、BSA、非必需氨基酸和rhBMP-4 的 MDM/F12 培养基； 第二培养基，所述第二培养基为添加了胰岛素铁硒传递蛋白、BSA、非必需氨基酸、rhVEGF和rhbFGF的MDM/F12培养基；以及 第三培养基，所述第三培养基为EGM2培养基。
2.根据权利要求1所述的一组培养基，其特征在于，所述IMDM/F12培养基包含: 75%的添加了 GlutaMAX -1的MDM培养基；以及 25%的添加了 GlutaMAX -1的F12培养基。
3.根据权利要求1所述的一组培养基，其特征在于，所述第一培养基中包含1%的胰岛素铁硒传递蛋白、0.05%BSA、1%非必需氨基酸和25ng/ml rhBMP-4。
4.根据权利要求1所述的一组培养基，其特征在于，所述第二培养基中包含1%胰岛素铁硒传递蛋白、0.05%BSA、1%非必需氨基酸、50ng/ml rhVEGF以及50ng/ml rhbFGF。
5.根据权利要求1所述的一组培养基，其特征在于，进一步包括: 第四培养基，所述第四培养基为添加了 Knockout血清替代物、L-谷氨酰胺、P -巯基乙醇、非必需氨基酸和rhbFGF的 D-MEM/F-12培养基；以及第五培养基，所述第五培养基为mTeSR培养基， 其中，所述第四培养基中包含20%Knockout血清替代物、ImM L-谷氨酰胺、0.1mMP-巯基乙醇、1%非必需氨基酸和5ng/ml rhbFGF。
6.一种用于体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述的一组培养基。
7.权利要求1-5任一项所述的一组培养基,或者权利要求6所述的试剂盒在体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞中的用途。
8.—种体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤: 利用权利要求1-5任一项所述的一组培养基，培养胚胎干细胞， 任选地，所述胚胎干细胞来源于人类。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用权利要求1-5任一项所述的一组培养基，培养胚胎干细胞进一步包括: 利用所述第一培养基对所述胚胎干细胞进行第一诱导分化培养，以便获得经过第一诱导分化培养的细胞； 利用所述第二培养基对所述经过第一诱导分化培养的细胞进行第二诱导分化培养，以便获得经过第二诱导分化培养的细胞；以及 利用所述第三培养基对所述经过第二诱导分化培养的细胞进行第三诱导分化培养，以便获得内皮细胞，其中 进行所述第一诱导分化培养1.5-3天，优选2天， 进行所述第二诱导分化培养4-8天，优选4.5天， 进行所述第三诱导分化培养3-20天， 在进行所述第一诱导分化培养之前，进一步包括: 利用所述第五培养基将所述胚胎干细胞进行预培养，然后依次进行消化和传代处理，其中，进行所述预培养5-7天，利用1%的dispase酶进行所述消化处理，按照1:3的比例进行所述传代处理2-3次， 在将所述胚胎干细胞进行预培养之前，进一步包括:利用所述第四培养基将所述胚胎干细胞进行滋养层细胞共培养，以及进一步包括将经过滋养层细胞共培养的胚胎干细胞进行消化和传代处理，其中利用IV型胶原酶进行所述消化处理，按照1:3或1:5的比例进行所述传代处理， 在进行所述第三诱导分化培养之前，进一步包括:将所述经过第二诱导分化培养的细胞进行消化和传代处理，其中利用0.25%的胰酶进行所述消化处理，按照1:2或1:3的比例进行所述传代处理。
10.一种内皮细胞或其衍生物，其是通过权利要求8或9所述的体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法获得的。 ·
全文摘要
本发明公开了用于体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的一组培养基和试剂盒，及其在体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞中的用途、体外诱导胚胎干细胞分化为内皮细胞的方法，以及内皮细胞或其衍生物。其中，该组培养基包括第一培养基，其为添加了胰岛素铁硒传递蛋白、BSA、非必需氨基酸和rhBMP-4的IMDM/F12培养基；第二培养基，其为添加了胰岛素铁硒传递蛋白、BSA、非必需氨基酸、rhVEGF和rhbFGF的IMDM/F12培养基；以及第三培养基，其为EGM2培养基。利用本发明的该组培养基能够高效快速地诱导胚胎干细胞向内皮祖细胞及内皮细胞进行分化。
文档编号C12N5/071GK103194423SQ201310073318
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者裴雪涛, 谢小燕, 岳 文, 何丽娟, 李艳华, 南雪, 姚海雷, 房芳, 张博文 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所