专利名称：一种可被猪物种NF-κB转录因子所识别的DNA片段、重组载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物基因工程领域，具体而言，涉及一种可被猪物种NF-K B转录因子所识别的DNA片段、重组载体及其应用。
背景技术：
NF-κ B信号通路在猪抗病免疫反应中起着至关重要的作用。NF K B存在于绝大多数类型的组织和细胞，是一类非常关键的转录因子，并组成转录因子NF K B家族(Ghoshet al., 1998 ；Miyamoto and Verma, 1995 ；Siebenlist et al., 1994),哺乳动物中此家族的五位成员分别是:NFk BI (p50)，NFk B2(p52, p49, p50B)，RelA (p65)，c-Rel, RelB0 所有成员都含有一个保守的由300个左右氨基酸组成的Rel同源区，该同源区是NFk B蛋白特有的功能域，负责形成 二聚体，并与DNA识别位点及抑制蛋白I K BQnhibitor κ B)结合(Baeuerle and Henkel, 1994 ;Perkins, 2007)。哺乳类动物中 I κ B 家族成员有 7 个,分别是11^0，11^@，11^丫，11^8，Bcl-3, plOO 和 pl05。通常情况下，NF κ B 家族是以同源或异源二聚体形式与I κ B蛋白形成复合物，以非活性形式存在于细胞质中。关于I κ B蛋白与NFk B亚单位结合后阻止NFk B与靶基因调控区结合的机理业已阐明(Brasier，2006 ；DiDonato et al.，1996 ；K1 ement et al.，1996):当 IkB 蛋白与 NF κΒ ρ65 亚基结合时，使ρ65的空间构象改变，ρ65亚基Ig样结构域的氨基末端旋转180° ,从而使与祀DNA序列结合的关键氨基酸残基被屏蔽，从而抑制NF κ B与靶基因调控区的特异性结合。而I κ B蛋白N端第32、36位丝氨酸残基从NF κ B-1 κ B复合物中位置凸出，极易被I κ B蛋白激酶(IkB kinase, IKK)磷酸化,磷酸化的IkB进一步被蛋白酶体泛素化降解,使NF κ B激活，从NF κ B-1 κ B复合物中解离出并转位于细胞核，与相应的靶基因结合。但同时I κ B在被降解后又可迅速再合成，并能进入细胞核与NF κ B结合，而NF κ B-1 κ B复合物的形成使NF κ B从其所结合的DNA位点上脱离，并重新转移至细胞质，由此实现NF κ B激活与失活的循环，完成NF κ B作为一种转录因子的调控功能。目前国际学术界普遍采用知名生物技术公司(如Stratagene和Clontech)开发的商业化人用NF-κ B报告载体作为各个哺乳动物中通用的研究工具，但其中所隐含的问题仍不容忽视，原因在于:在不同的物种中，NF-κ B转录因子所识别并结合的特异DNA序列不尽相同，因此人用NF-κ B报告载体所得数据的灵敏性和稳定性不一定能够满足研究者的要求。如果能够开发出一套适用于猪的NF-κ B报告系统，则可为猪的免疫学研究提供更为精细、可靠的工具。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可被猪物种NF- κ B转录因子所识别的DNA片段和重组载体，以及该DNA片段作为调控猪物种NF- κ B信号通路下游基因表达的启动子的应用、该重组载体作为检测猪物种NF-κ B转录因子转录活性强度的报告载体的应用。本发明提供的DNA片段是由猪物种的多个NF- κ B结合位点按不同顺序排列而成的核苷酸序列，并且具有启动子活性。本发明中的术语“启动子”系指DNA上一段序列，RNA聚合酶结合到该序列上，可以起始基因的转录。具体地，本发明的第一个目的是这样实现的:—种可被猪物种NF-κ B转录因子所识别的DNA片段，其核苷酸序列是如下(I)或
(2):(I)序列表中序列1、序列2、序列3、序列4、序列5或序列6所示的核苷酸序列；(2)与所述(I)的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。本发明的DNA片段还包括与来自序列1、序列2、序列3、序列4、序列5或序列6所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。这里使用的术语“互补的”系指遵循碱基配对原则产生的之意。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列90%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同源性”指与天然核苷酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的启动子核苷酸序列具有优选地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(% )表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。含有上述的DNA片段的重组载体也属于本发明的保护范围之内。上述的重组载体，其中所述的载体是pGL3_bas i c。优选地，上述的重组载体是在pGL3_basic载体的多克隆位点通过Mlul、BglII双酶切插入上述的DNA片段后得到的重组载体。含有上述DNA片段的转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。含有上述的DNA片段的重组菌也属于本发明的保护范围之内。本发明的另一个目的在于提供上述的DNA片段作为启动子的应用。上述的启动子为调控猪物种NF-κ B信号通路下游基因表达的启动子。本发明的又一目的在于提供上述的重组载体作为检测猪物种NF- κ B转录因子转录活性强度的报告载体的应用。试验证明:本发明提供的DNA片段作为猪物种NF-K B转录因子的识别核苷酸序列，可作为启动子调控NF-κ B信号通路下游基因的表达，从而通过下游基因的表达强度来判断猪细胞内NF-κ B转录因子转录活性的强度。本发明提供的报告载体是将上述DNA片段插入到pGL3-basic的多克隆位点(即萤火虫荧光素酶编码基因的5’端)而获得的调控型表达载体，该载体可与稳定型表达载体pRL-TK配合使用(以后者海肾荧光素酶表达量作为内对照)，可检测NF-κ B转录因子转录活性的强度，为猪的免疫学研究提 供了更为精细、可靠的工具。
图1为以Stratagene公司的pNF- κ B-Luc载体作为对照报告载体，检测猪NF- κ Βρ65过表达所致NF- κ B信号通路的激活。图2为以实施例1的载体A作为报告质粒，检测猪NF- κ B ρ65过表达所致NF- κ B信号通路的激活。图3为以实施例1的载体B作为报告质粒，检测猪NF- κ B ρ65过表达所致NF- κ B信号通路的激活。图4为以实施例1的载体C作为报告质粒，检测猪NF- κ B ρ65过表达所致NF- κ B信号通路的激活。
图5为以实施例1的载体D作为报告质粒，检测猪NF- κ B ρ65过表达所致NF- κ B
信号通路的激活。图6为以本实施例1的载体E作为报告质粒，检测猪NF-kB ρ65过表达所致NF-κ B信号通路的激活。图7为以实施例1的载体F作为报告质粒，检测猪NF- κ B ρ65过表达所致NF- κ B信号通路的激活。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商购买得到。以下实施例中的定量试验，均至少设置三次重复实验，结果取平均值。细胞系PIEC(猪血管内皮细胞):购自中国科学院上海细胞库，产品目录号:GN015。pNF-κ B-Luc 载体购自 Stratagene 公司，货号:#219077。pRL-TK 购自 Promega 公司，货号:E2241。pcDNA3.1 (+)购自 Invitrogen 公司，货号:V790_20。pGL3_Basic 购自Promega公司，货号:E1751。pcDNA3.1 (+) _pp65为本实验室保存，是猪NF-κ B转录因子p65亚基的过表达载体，在以下实施例中作为NF-κ B激活剂使用，其作用已在有关文献中得到证实(Hegang Li,Guojian Ma,Duan Gui, Shuanping Zhao,Pan Wang,Kongwang He,XueminWang,Jinxue Ruan,Jiyue Cao,Shulin Yang,Kui L1.Characterization of the porcinep65subunit of NF-κ B and its association with virus antibody levels.MolecularImmunology, 48 (2011):914-923)。pcDNA3.1 (+)-pp65 载体序列如序列表所不。实施例1、重组载体的构建按照如下序列合成单链寡核苷酸(上海英骏生物技术有限公司合成):AF:cgcg tAGGACTTTCCGGAAATTCCCCGGGAAACCCCGAGAAATCCCCGGGAGTTTCTCGGGAAGTACCaAR: gatctGGTACTTCCCGAGAMCTCCCGGGGATTTCTCGGGGTTTCCCGGGGMTTTCCGGAMGTCCTaBF: cgcgtAGGACTTTCCGGGAMCCCCGGAMTTCCCCGAGAMTCCCCGGGMGTACCGGGAGTTTCTCaBR: gatctGAGAMCTCCCGGTACTTCCCGGGGATTTCTCGGGGMTTTCCGGGGTTTCCCGGAMGTCCTaCF: cgcgtGGGMGTACCGGGAGTTTCTCGAGAMTCCCCGGGAMCCCCGGAMTTCCCCAGGACTTTCCaCR: gatctGGAMGTCCTGGGGMTTTCCGGGGTTTCCCGGGGATTTCTCGAGAMCTCCCGGTACTTCCCaDF: cgcgtGGGAGTTTCTCGGGAMCCCCAGGACTTTCCGAGAMTCCCCGGGMGTACCGGAMTTCCCCa
权利要求
1.一种可被猪物种NF-K B转录因子所识别的DNA片段，其核苷酸序列是如下(I)或(2): (1)序列表中序列1、序列2、序列3、序列4、序列5或序列6所示的核苷酸序列； (2)与所述(I)的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述的DNA片段的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述的载体是pGL3-basic。
4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述的重组载体是在pGL3-basic载体的多克隆位点通过Mlul、BglII双酶切插入权利要求1所述的DNA片段后得到的重组载体。
5.含有权利要求1所述的DNA片段的转基因细胞系。
6.含有权利要求1所述的DNA片段的重组菌。
7.权利要求1所述的DNA片段作为启动子的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述的启动子为调控猪物种NF-KB信号通路下游基因表达的启动子。
9.权利要求2或3或4所述的重组载体作为检测猪物种NF-K B转录因子转录活性强度的报告载 体的应用。
全文摘要
本发明公开了一种可被猪物种NF-κB转录因子所识别的DNA片段、及其应用。本发明的DNA片段，其核苷酸序列是如下(1)或(2)(1)序列表中序列1、序列2、序列3、序列4、序列5或序列6所示的核苷酸序列；(2)与所述(1)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。本发明的重组载体为含有该DNA片段的重组载体。试验证明本发明提供的DNA片段可作为启动子调控NF-κB信号通路下游基因的表达，从而通过下游基因的表达强度来判断猪细胞内NF-κB转录因子转录活性的强度。
文档编号C12N15/113GK103205426SQ20131007374
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月8日 优先权日2013年3月8日
发明者李和刚, 赵金山, 阮进学, 江科, 侯乐乐, 郝小静, 李培培, 张宝珣 申请人:青岛市畜牧兽医研究所