专利名称：水稻OsAT1蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种与水稻籽粒千粒重和直连淀粉含量相关的阴离子通道蛋白(水稻OsATl蛋白)及其编码基因和应用。
背景技术：
水稻是我国最主要的粮食作物之一，其播种面积、总产和单产均居粮食作物首位，水稻的生产对我国的国民经济具有重要的作用。目前，随着人民生活水平的提高，水稻生产不但要提高品种的产量，也要注重品质的改良，而水稻的千粒重和直链淀粉含量对稻米的外观、产量和品质具有重要的影响。因此，选育不同千粒重和直链淀粉含量的水稻品种，发掘控制水稻千粒重和直链淀粉含量的主要基因对提高稻谷产量和品质具有重要的意义。
谷粒重量一般以千粒重表示，是衡量水稻产量的因素之一，也是谷粒长度、宽度与厚度的综合指标(杨联松等，粳稻粒形遗传初步研究.杂交水稻，2002, 17(6):46-48)。
人们一般认为粒重受多基因控制，基本呈正态分布(熊振民和孔繁林.水稻粒重的超亲遗传及其在育种中的应用.浙江农业大学学报，1982，8 (I):17-25)，所以谷粒的粒长、粒宽、粒厚和粒重都属于多基因控制的数量性状(石春海和申宗坦.早籼粒形的遗传和改良.中国水稻科学，1995，9 (I): 27-32)。
随着各种分子标记的日趋完善，基因的定位与克隆效率得到很大的提高。到目前为止，已克隆到5个控制水稻粒重的基因，分别为GS3 (Fan et al, GS3, amajorQTL for grain length and weight and minor QTL for grain width andthicknessin rice,encodes a putative transmembrane protein.Theor ApplGenet，2006，112: 1164-1171)、GW2 (Song et al, A QTL for rice grain widthand weight encodes aprev iously unknown RING-type E3ubiquitin Iigase.Nat Genet，2007，39 (5):623-630)、GW5(Wang et al.1solation and initialcharacterization of GW5, a majorQTL associated with rice grain width andweight.Cell Res.2008, 18:1199-1209)/qSW5 (Shomura et al，Deletion in a geneassociated with grain sizeincreased yields during rice domestication.NatGenet，2008，40 (8): 1023-1028)、GIFl (Wang et al, Control of rice grain-fillingand yield by a gene with a potentialsignature of domestication.NatGenet，2008，44 (11):1370-1374)和 GW8(Wang et al,Control of grain size,shape andquality by 0sSPL16in rice.Nat Genet，2012，44(8):950-955)。
GS3是第一个克隆到的控制粒长和粒重的主效基因，它导致粒长变化是由于第二个外显子上发生单碱基突变而使翻译提前终止产生的(Fan et al，GS3，amajorQTL for grain length and weight and minor QTL for grain width andthicknessin rice,encodes a putative transmembrane protein.Theor ApplGenet，2006，112:1164-1171) ;Mao等对GS3蛋白功能进一步研究发现，GS3编码蛋白的N端是一个植物特有的器官大小调节功能域OSR(organ size regulation), OSR对谷粒大小具有负调控的作用，能抑制粒形变长(Mao et al, Linking differential domainfunctionsof the GS3protein to natural variation of grain size in rice.Proc Natl AcadSciUSA, 2010，107(45):19579-19584)。2007年，Song等人成功地克隆并分析了控制水稻粒重的数量性状基因(QTL)GW2(Song et al, A QTL for rice grain width and weight encodes a previouslyunknownRING-type E3ubiquitin ligase.Nat Genet, 2007，39 (5):623-630)，研究表明:GW2 作为一个新的E3泛素连接酶可能参与降解促进细胞分裂的蛋白，从而调控水稻颖壳大小和控制粒重；当GW2的功能缺失或降低时，该基因降解可能与细胞分裂相关蛋白的能力下降，从而加快细胞分裂，增加谷粒颖壳的细胞数目，从而增加水稻谷粒的宽度和粒重。qSW5和GW5实为同一基因，序列分析表明其编码一种新的蛋白，与任何已知功能的蛋白不具有同源性，该基因突变导致粒宽增加，其主要原因在于外稃上表皮细胞数量增加而使外稃增大，从而导致粒宽和粒重的增加(Shomura et al, Deletion in a geneassociated with grain size increased yields during ricedomestication.NatGenet, 2008，40(8):1023-1028)；GIFl编码598个氨基酸组成的蛋白产物，其蛋白为一种细胞壁转化酶，它能把鹿糖转化为淀粉，过量表达该基因能促进籽粒灌衆，提高籽粒粒重(Wang etal, Controlof rice grain-filling and yield by a gene with a potential signatureofdomestication.Nat Genet, 2008，44(11):1370-1374)；GW8编码一个促进细胞增殖的蛋白，该基因能促进细胞分裂和籽粒灌浆，从而增加粒宽和粒重(Wang et al, Control of grain size, shape and quality by0sSPL16in rice.Nat Genet, 2012，44(8):950-955)。稻米的主要成分是淀粉，包括直链淀粉和支链淀粉两种形式。淀粉的组成与结构在相当程度上决定了稻米 品质的优劣，稻米的直连淀粉含量大多在16-30%之间，其主要由Wx基因编码酶GBSSI合成(舒庆尧等.籼稻和粳稻中蜡质基因座位上微卫星标记的多态性及其与直链淀粉含量的关系.遗传学报，1999,26(4):350-358)。研究表明，当植物体内缺少GBSSI蛋白时，合成淀粉中缺乏直链淀粉；利用反义RNA技术特异抑制GBSSI基因的表达，贝U导致直链淀粉含量的下降(Denyer et al.The isolation andcharacterization of novel low-amylosemutants of Pisum sativum L.Plant CellEnviron.1995，18:1019-1026)，说明GBSSI主要负责水稻籽粒直连淀粉的含量。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种水稻OsATl蛋白。本发明的另一目的在于提供上述水稻OsATl蛋白的编码基因，该基因与硅酸分泌通道基因Lsi2编码的蛋白属于同一基因家族(Ma et al, An effluxtransporter ofsilicon in rice.Nature, 2007, 448(12):209-213) 本发明的再一目的在于提供上述水稻OsATl蛋白的编码基因在制备转基因植物中的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现:水稻OsATl蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或该序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸后功能与SEQ ID N0:2所示序列相同的序列。
上述水稻OsATl蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；或在严格条件下可与SEQ ID N0:1杂交并且编码上述水稻OsATl蛋白的DNA分子；或者与SEQ ID NO:1的序列有90%以上的同源性(优选95%以上同源性)，并且编码上述水稻OsATl蛋白的DNA分子；
上述水稻OsATl蛋白的编码基因的启动子，序列如SEQ ID N0:3所示；或严格条件下可与SEQ ID NO: 3所示的DNA分子杂交且具有启动子功能的DNA分子；
所述的严格条件是:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗杂交膜一次。
一种表达载体，是由上述水稻OsATl蛋白的编码基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成。
此外，使用上述水稻OsATl蛋白的编码基因构建植物表达载体时，还可以使用增强子，包括翻译增强子或者转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或是邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构区域。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可以产生颜色变化的酶或是发光化合物的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除锈剂基因)等。
所述的植物表达载体优选pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301 或 pBI121。
携带有上述的水稻OsATl蛋白的编码基因的植物表达载体可以通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或是组织中。被转化的宿主植物可以是水稻或其它作物。
上述的水稻OsATl蛋白或水稻OsATl蛋白的编码基因，可用于改善水稻千粒重和降低籽粒直连淀粉含量的能力。如，水稻OsATl蛋白在制备改善植物千粒重和降低籽粒直连淀粉含量药剂中的应用；或者，水稻OsATl蛋白的编码基因在制备改善植物千粒重和降低籽粒直连淀粉含量的转基因植物中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
实验结果表明，转OsATl基因植株表现为水稻籽粒千粒重和直连淀粉含量下降，其蛋白质和编码基因对调控水稻籽粒千粒重和直连淀粉含量的有重要的实际意义，在实际应用中可以将OsATl基因转入不同的水稻品种中以培育更加理想的水稻栽培品种，或调节OsATl基因的表达获得相应的水稻籽粒千粒重和直链淀粉含量的水稻品种。OsATl蛋白及其编码基因在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
图1是本发明的水稻OsATl基因的琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道M为分子量标记DL2000plus (购自TAKARA);泳道1-2为目的基因。
图2是定量PCR分析转基因植株中OsATl的表达情况示意图；其中，WT:野生型水稻植株中花11 ；pOX:Line3 =OsATl过量表达水稻转基因植株。图3是过量表达OsATl的转基因水稻表型示意图；其中，WT:野生型水稻中花11 ；p0X:Line3:OsATI过量表达水稻转基因植株。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1水稻OsAT I基因的克隆根据NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)提供的关于 OsATl 基因的 cDNA 序列设计引物，引物序列如下:OsATl-Fl: ACGAAGCTTGTTCTTGATTGGCGGCAATG (下划线部分为限制性内切酶HindIII识别位点)
OsATl-Rl: ACTACGCGTTCAGTTGCTTCTGATGAGCAG (下划线部分为限制性内切酶 MluI识别位点)以粳稻品种中花112周的幼苗叶片cDNA为模板，在引物OsATl-Fl和OsATl-Rl的引导下，用常规方法扩增OsATl基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳(结果如图1所示)，回收并纯化大约1600bp左右的DNA片段，将该片段克隆到pMD18-T载体(购自TAKARA公司)上，获得pMD18-T-0sATl载体，送北京奥科生物技术有限公司测序，测序结果表明，该DNA片段的序列如SEQ ID NO:1所示；编码如SEQ ID NO: 2所示序列的蛋白，在其DNA两端引入了合适的酶切位点。实施例2遗传转化鉴定目的基因的功能将OsATl基因克隆入植物过量表达载体pCAMBIA1380 (购自澳大利亚CAMBIA公司)多克隆位点的HindIII和MluI酶切位点之间，得到含有OsATl基因的植物表达载体，然后利用农杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11的成熟胚的愈伤组织，方法如下述文献描述(Hiei et al, Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA.PlantJ, 1994，6 (2): 271-282)，经过预分化、分化，得到16株转化植株，经过PCR鉴定，全部为阳性，PCR引物序列如下:引物1:5’ -CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC-3’ (SEQ ID N0:6)；引物2:5，-TAGCGCGTCTGCTGCTCCATACA-3’(SEQ ID NO:7);PCR 扩增条件为:94 °C 2min ；94 °C 30sec, 58 °C 30sec, 72 °C lmin, 35 个循环；72 °C 5min。经过PCR鉴定为阳性的转基因植株，提取Tl代转基因植株叶片基因组DNA进行Southern Blot检测插入基因的拷贝数，选择单拷贝的转基因植株分单株收取种子，然后取100粒以上种子发芽后利用潮霉素进行筛选，若没有死亡则表明种子已经纯合；选择已经纯合的转基因种子和野生型水稻中花11种子萌发后，利用木村B营养液(调pH为4.8)培养水稻至4叶期，然后提取水稻RNA，检测总RNA浓度和完整度后再合成cDNA第一链，以水稻Actin作为内参基因，加入等量的cDNA模板，在荧光定量PCR仪扩增Actin和OsATl，从图2可以看出，在转基因植株叶片中OsATl的表达较野生型水稻提高了 11倍；所用PCR引物序列如下:Actin-F:5’-GCCACACTGTCCCCATCTATG-3’ (SEQ ID N0:8)；Actin-R:5，-AGGTCGAGACGAAGGATAGCAT-3’ (SEQ ID N0:9)；AT1-F:5，-CGTCACCTCCCACCGCTTCT-3’ (SEQ ID NO: 10)；AT1-R:5’-TGGTGACAGGGACGGGCTTC-3’ (SEQ ID NO: 11)；PCR扩增条件为:95°C IOmin ；95°C 15sec，60°C lmin，40 个循环；60_95°C分析溶解曲线。木村B 营养液具体配方为:(NH4) 2S04 (0.365mM)，KH2PO4 (0.182mM)，KNO3 (0.183mM)，K2SO4 (0.086mM)，Ca (NO3) 2 (0.366mM)，MgSO4 (0.548mM)，EDTA-Fem (0.020mM)，MnCl2.4H20 (0.091 X I(T3HiM)，ZnSO4.7H20 (0.77 X I(T3HiM)，CuSO4.5H20 (0.32 X I(T3HiM)，H3BO3 (0.0462mM)，(NH4)6Mo7024.4H20 (0.145 X I(T3HiM)。通过以上实验，证实了过量表达OsATl的转基因植株为阳性植株，转基因植株在核酸表达水平较野生型提高了 11倍(图2)，并且从图3中可以看出，水稻成熟后，过量表达OsATl的转基因植株的株高比野生型植株要低，其叶片向内卷曲(图3A);过量表达OsATl的转基因植株的稻穗长度 和结实率与野生型植株差异不大，但谷粒粒形有较大差异，转基因植株的粒长和粒宽明显变小(图3B和图3C)。为了检验转基因纯合植株对水稻籽粒相关性状和米质的影响，进一步对转基因纯合植株收获后进行考种和米质分析，考种和米质分析方法参照部颁标准《NY147-88米质测定方法》，并采用FOSS Infratec 1241Grain Analyzer进行自动测定。具体如下:稻米收获干燥后贮藏3个月，测定品质性状。糙米率、精米率、整精米率、长宽比的测定参照部颁标准《NY147-88米质测定方法》。直连淀粉与蛋白质含量的测定采用FOSS Infratec 1241GrainAnalyzer进行自动测定。结果如表I所示，过量表达OsATl的转基因纯合植株的千粒重只有野生型水稻中花11的57.3% ;并且直链淀粉含量也下降了 13%，统计分析表明，过量表达OsATl的转基因植株和野生型水稻中花11的粒长、粒宽、千粒重和直链淀粉含量差异性显著(表I)。表I (WT为野生型植株中花11 ；p0X:Line3:过量表达OsATl的水稻转基因植株)
权利要求
1.水稻OsATl蛋白，特征在于:其序列如SEQID NO:2所示。
2.权利要求1所述的水稻OsATl蛋白的编码基因，特征在于:其序列如SEQID NO:1所/Jn ο
3.—种表达载体，其特征在于:是由权利要求2所述的水稻OsATl蛋白的编码基因插入到植物表达载体的多克隆位点构建而成。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于:所述的植物表达载体为pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301 或 pBI121。
5.权利要求2所述的水稻OsATl蛋白的编码基因在改善水稻千粒重和降低籽粒直连淀粉含量中的 应用。
全文摘要
本发明公开了一种水稻OsAT1蛋白及其编码基因与应用。水稻OsAT1蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示，其编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。水稻OsAT1蛋白及其编码基因可以用于改善水稻千粒重和降低籽粒直连淀粉含量。本发明中，转OsAT1基因植株表现为水稻籽粒千粒重和直连淀粉含量下降，其蛋白质和编码基因对调控水稻籽粒千粒重和直连淀粉含量的有重要的实际意义，在实际应用中可以将OsAT1基因转入不同的水稻品种中以培育更加理想的水稻栽培品种，或调节OsAT1基因的表达获得相应的水稻籽粒千粒重和直链淀粉含量的水稻品种。
文档编号C12N15/82GK103145818SQ20131007346
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者张建军, 彭新湘, 田华, 刘娥娥, 陈燕, 周晓垂 申请人:华南农业大学