专利名称：一种用于检测鸽细环病毒的引物对及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒检测领域，具体涉及一种用于检测鸽细环病毒的引物对及其应用。
背景技术：
细环病毒(Torque teno virus, TTV)是近年来发现的一种新型的人畜共患DNA病毒，1997年首次发现于人类肝炎病中，经输血及粪-口途径等感染，广泛存在于人类、家畜、野生动物及一些伴侣动物体内。细环病毒是细环病毒科细环病毒属，呈球形、无囊膜、环状单股负链DNA病毒。TTV基因组DNA呈高度的差质性，同时由于TTV是单链DNA病毒(细环病毒属)，在感染动物体内血清中滴度差别较大，这也可能是GenBank上目前TTV全基因序列屈指可数的原因。关于T TV的开放阅读框(OFR)位置以及各部分编码基因的功能等更是不甚了解。目前，我国用于细环病毒的实验室诊断手段比较落后，诊断主要依据临床症状进行判断，缺乏快速、简便的诊断方法。国内外已有很多利用PCR方法从活体组织、组织培养物中检测鸽细环病毒的报道，但是并未扩增出该病毒的核苷酸序列，也没有针对此做相关研究，更未对该病毒的检测手段进行研究。到目前为止，TTV对宿主的致病性尚不清楚，但有数据显示其和其他病毒共感染会引起一些疾病。2006年kekarainen等研究人员发现TTV和PCV2混合感染能导致仔猪断奶后多系统呼吸综合征(PMWS)的发生。2008年另有报道TTV能促进PRRS的爆发。2009年Tuijak等对商业化疫苗、药品及实验室常用酶进行猪TTV的检测，结果在猪繁殖与呼吸综合征、猪细小病毒和猪肺炎支原体疫苗等中都检测到TTV的存在。TTV感染呈全球性分布，在人群以及家畜、家禽等动物中感染率较高。目前鸽养殖现已成为畜牧业中相对独立的新兴产业，世界食品消费市场把肉鸽列为优质肉食。国内市场对乳鸽需求量日益增大，发展鸽养殖潜力巨大，市场前景十分广阔。但是国内尚无关于鸽细环病毒的报道，在我国鸽群细环病毒明显高感染率的背景下，尽快建立我国鸽细环病毒的PCR检测方法及试剂盒的研制以便调查和防控此病实乃当务之急，对我国鸽市场的稳定发展具有十分重要的现实意义和市场价值。
发明内容
发明目的:本发明所要解决的技术问题是一种用于检测鸽细环病毒的引物对。本发明还要解决的技术问题是提供一种鸽细环病毒的检测试剂盒。技术方案:为实现上述目的，本发明的一种用于检测鸽细环病毒的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。一种鸽细环病毒的核苷酸序列，所述病毒的核苷酸序列是通过权利要求1所述的引物对进行PCR扩增得到，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1。一种鸽细环病毒的检测试剂盒，它包含权利要求1所述的引物对。所述的鸽细环病毒的检测试剂盒，其特征在于包括:
I)预混剂A:由核苷酸序列如SEQ ID NO:2的上游引物P115 μ L，核苷酸序列如SEQ ID NO:3 的下游引物 Ρ215μ L，2XPCR pre_mix200 μ L，ddH20100 μ L 组成；2)阴性对照:非鸽细环病毒的DNA片段600 μ L3)阳性对照:鸽细环病毒的DNA片段600 μ L所述的鸽细环病毒核苷酸序列的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:I)根据同源性利用引物设计软件设计引物对；2)鸽细环临床病料中病毒DNA的提取；3) PCR扩增:PCR反应体系为25 μ L体系，反应体系中含PCR pre_mixl2.5 μ L，上下游引物各I μ L,病毒DNA2 μ L，Η208.5 μ L，瞬时离心混匀，PCR工作程序为:94°C预变性5min ;94°C变性45s，58°C退火30s，72°C延伸40s，40个循环；72°C再延伸IOmin得到扩增序列如SEQ ID NO:1的核苷酸序列；4) PCR扩增产物分析；5) PCR扩增产物基因测序得到鸽细环病毒的核苷酸序列。所述的鸽细环病毒的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤:I)样品处理:可疑病料的内脏组织进行无菌研钵，加生理盐水研磨，反复冻溶2-3次后5000rmp离心5min,取上清；2)病毒DNA提取:
3) PCR扩增:PCR反应体系为25 μ L体系，反应体系中含PCR pre_mixl2.5 μ L，上下游Primer各I μ L，上述病毒DNA2 μ L，Η208.5 μ L，瞬时离心混匀；PCR工作程序为:94°C预变性5min ;94°C变性45s，58。。退火30s，72。。延伸40s，40个循环；72°C再延伸IOmin,4) PCR扩增产物分析。采用上述试剂盒的检测方法，具体步骤如下:(I)样品处理:取实验动物的内脏可疑病料组织于无菌研钵，加生理盐水研磨，反复冻融后离心，取上清450yL;(2)DNA提取:在上清450 μ L中加入蛋白酶K至终浓度500 μ g/mL，加入SDS至终浓度lOg/USSO水浴30-50min,用苯酹、苯酹-氯仿(体积比1:1)混合液及氯仿各抽提I次，吸取水相，加入1/10体积的3mol/L NaAc (pH5.2)及2.5倍体积的无水乙醇沉淀，12000r/min4°C离心15_20min，沉淀悬浮于超纯水中得到DNA提取液；(3) PCR扩增:在PCR试剂管内加入1-2 μ LDNA提取液，预混剂A23-24 μ L，瞬时离心混匀，置PCR仪内进行扩增，94°C预变性5min ;94°C变性45s，58°C退火30s，72°C延伸40s,40个循环；72°C再延伸lOmin，同时设立阴性和阳性对照。(4)PCR扩增产物分析:取5-10 μ L PCR扩增产物加于1_1.5%琼脂糖凝胶孔中，放于电压为100 130V的电泳槽里电泳45min，于紫外投射仪中观察结果。如果扩增出一条约500bp的片段，则表明待检组织鸽细环病毒阳性，如果没有扩增出500bp的片段，则表明待检组织鸽细环病毒阴性。有益效果:与现有技术相比，本发明的优点如下:本发明获得的一种应用于检测鸽细环病毒的引物对，在特异引物对的基础上，优化了 PCR条件，扩增出了鸽细环病毒的核苷酸序列，并优化了检测条件和检测体系制备了检测该病毒的试剂盒。该试剂盒具有较高的特异性和稳定性，灵敏度达5pg，可以快速准确检测鸽细环病毒。因此该试剂盒可以作为快速检测鸽细环病毒的有效工具。
图1:PCR方法特异性实验的电泳图。图2 =PCR方法敏感性实验的电泳图。
具体实施例方式实施例1:试剂盒的制备。1、病毒及病料的来源和处理鸽细环临床病料于2009年10月采自江苏丹阳、安徽等地病鸽内脏器官。取
0.5-2.0g内脏组织于无菌研钵,加生理盐水研磨，反复冻溶2-3次后5000rmp离心5min,取上清于_20°C保存。鸽圆环阳性病料，鸡贫血阳性病料，猪圆环阳性病料由实验室保存。2、试剂PCR pre-mix、蛋白酶 K 购自大连 Takara 公司；DNA Marker、GoldView 购自南京上高生物公司；引物由上海英俊合成。其它试剂均为进口或国产分析纯试剂。1、引物的设计与合成根据GenBank中TTV的全基因序列，使用引物设计软件Primer5.0设计一对检测引物。TTV 引物为:p TTVl(5’ -GATACCCAGCTTTCCACTTTGC-3，)；pTTV2 (5，-GTGTTATTGCTGTCGGGTCGT-3’)，预期扩增片段大小约为 512bp。2、阳性对照:即含有鸽细环病毒的DNA片段3、阴性对照:非鸽细环病毒的DNA片段实施例2:检测方法按照以下步骤进行检测:(I)样品处理:取鸽细环临床病料于2009年10月采自江苏丹阳、安徽等地病鸽内脏器官，取0.5-2.0g内脏组织于无菌研钵，加生理盐水研磨，反复冻溶2-3次后5000rmp离心5min，取上清于-20°C保存。鸽圆环阳性病料，鸡贫血阳性病料，猪圆环阳性病料由实验
室保存。(2)病毒DNA的提取:将可疑病料组织悬浮液冻融3次，离心取上清450 μ L，加入蛋白酶K至终浓度500μ g/mL，加入SDS至终浓度10g/L，55°C水浴30min，用苯酚、苯酚-氯仿(体积比1:1)混合液及氯仿各抽提I次，吸取水相，加入1/10体积的3mol/LNaAc (pH5.2)及2.5倍体积的无水乙醇沉淀，12000r/min4°C离心15min,沉淀悬浮于超纯水中，-20°C保存备用。(3) PCR扩增:PCR反应体系为25 μ L体系，反应体系中含PCR pre_mixl2.5 μ L，上下游Primer各I μ L，DNA2 μ L，Η208.5 μ L，瞬时离心混匀。PCR工作程序为:94°C预变性5min ;94°C变性 45s，58°C退火 30s，72。。延伸 40s，40 个循环；72°C再延伸 10min，4°C保存。(4)PCR扩增产物分析:结束后取8 μ L PCR扩增产物加于1%琼脂糖凝胶孔中放于电压为100 130V的电泳槽里电泳45min，于紫外投射仪中观察结果。从图1可以看出:只有鸽细环病毒扩增出了一条约500bp的片段，鸽圆环阳性病料，鸡贫血阳性病料，猪圆环阳性病料均未扩增出片段。实施例3:特异性实验用与实施例2相同的方法提取鸽细环阳性病料、鸽圆环阳性病料、鸡贫血阳性病料，猪圆环阳性病料的DNA，并以此为模板，用设计的引物进行PCR扩增。用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，只有鸽细环病毒扩增出一条约500bp的片段(见图1)，将鸽细环阳性病料的PCR产物进行基因测序，与GenBank中已发表的序列进行比较，结果与已发表的人细环和猪细环基因序列达55-75%的同源性，考虑到鸽细环病毒不同物种间的高度差质性，可表明所扩增的片段为鸽细环病毒，而鸽圆环病毒病料、鸡贫血病毒病料、猪圆环病毒病料和鸽腺病毒病料均未扩增出条带来，这表明该方法所扩增的片段为鸽细环病毒的特异性片段。实施例4:敏感性实验以鸽细环病料提取的DNA为模板，从500ngDNA开始按10倍递减稀释总共有6个浓度，其浓度分别为500ng、50ng、5ng、500pg、50pg、5pg,同时设置一个阴性对照。用鴻细环PCR反应程序进行扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，见图2，其中第I泳道为Maker5000，第2至第8泳道分别表示模板浓度为5pg、50pg、500pg、5ng、50ng、500ng的实验结果，结果表明PCR方法可检测出5pg的模板DNA，具有较高的敏感性。实施例5:稳定性实验将试剂保存于_20°C，经过一年的保存和反复冻融后，对鸽细环病毒的模板重新进行检测，结果表明，该试剂盒的稳定性较好，可以长期保存。实施例6:临床病料检测使用实施例2的方法对来自于六个不同省份的鸽场，总计144份临床病料进行检测。144份鸽子血清所提的DNA中，其中有67份检测为阳性，总感染率为46.5%，说明鸽细环病毒在我国鸽群中普遍存在。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种用于检测鸽细环病毒的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQID NO:2 和 SEQ ID NO:3。
2.一种鸽细环病毒的核苷酸序列，其特征在于，所述病毒的核苷酸序列是通过权利要求I所述的引物对进行PCR扩增得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
3.一种鸽细环病毒的检测试剂盒，它包含权利要求1所述的引物对。
4.根据权利要求3所述的鸽细环病毒的检测试剂盒，其特征在于包括: 1)预混剂A:由核苷酸序列如SEQ ID NO:2的上游引物P115 μ L，核苷酸序列如SEQ IDNO:3 的下游引物 Ρ215μ L，2XPCR pre-mix200 μ L, ddH20100 μ L 组成； 2)阴性对照:非鸽细环病毒的DNA片段600μ L 3)阳性对照:鸽细环病毒的DNA片段600μ L。
5.权利要求2所述的鸽细环病毒核苷酸序列的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)根据同源性利用引物设计软件设计引物对； 2)鸽细环临床病料中病毒DNA的提取； 3)PCR扩增:PCR反应体系为25 μ L体系，反应体系中含PCR pre-mixl2.5 μ L，上下游引物各I μ L，病毒DNA2 μ L，Η208.5 μ L，瞬时离心混匀，PCR工作程序为:94°C预变性5min ；94°C变性45s，58°C退火30s，72°C延伸40s，40个循环；72°C再延伸IOmin得到扩增序列如SEQ ID NO:1的核苷酸序列； 4)PCR扩增产物分析；` 5)PCR扩增产物基因测序得到鸽细环病毒的核苷酸序列。
6.权利要求3所述的鸽细环病毒的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)样品处理:可疑病料的内脏组织进行无菌研钵，加生理盐水研磨，反复冻溶2-3次后5000rmp离心5min,取上清； 2)病毒DNA提取: 3)PCR扩增:PCR反应体系为25 μ L体系，反应体系中含PCR pre-mixl2.5 μ L，上下游Primer各I μ L，上述病毒DNA2 μ L，Η208.5 μ L，瞬时离心混匀；PCR工作程序为:94°C预变性5min ;94°C变性 45s，58°C退火 30s，72。。延伸 40s, 40 个循环；72°C再延伸 IOmin, 4)PCR扩增产物分析。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测鸽细环病毒的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQID NO2和SEQ ID NO3；还公开了一种鸽细环病毒的核苷酸序列及其制备方法，该病毒的核苷酸序列是通过所述的引物对进行PCR得到，其核苷酸序列如SEQ ID NO1；还公开了一种包含上述引物对的鸽细环病毒的检测试剂盒及其检测方法。本发明获得的一种应用于检测鸽细环病毒的引物对，在特异引物对的基础上，优化了PCR条件，扩增出了鸽细环病毒的核苷酸序列，并优化了检测条件和检测体系制备了检测该病毒的试剂盒。该试剂盒具有较高的特异性和稳定性，灵敏度达5pg，可以快速准确检测鸽细环病毒。该试剂盒可以作为快速检测鸽细环病毒的有效工具。
文档编号C12Q1/68GK103205511SQ20131015415
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月27日 优先权日2013年4月27日
发明者张志成, 庄林林, 蒋加进, 戴鼎震 申请人:金陵科技学院