放射性核素标记的腺病毒的制作方法

专利名称：：放射性核素标记的腺病毒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及放射性核素标记的腺病毒，涉及肿瘤治疗领域。
背景技术：
：腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒，基因组长约36kb，核心由双股DNA链，核蛋白TP和DNA多聚酶构成，衣壳呈规则的20面体结构，直径约80-110nm。衣壳含有240个六联体、12个五联体及12根纤毛，除此之外还有其他一些小蛋白，如VI、VIII、IX等。六联体是形成病毒衣壳20个三角形面的主要蛋白，12个顶端是5个五联体亚单位和3个纤毛蛋白构成的复合物，12根纤毛以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出，纤毛顶端形成头节区。五联体和纤毛的头节区可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。近年来还有很多将腺病毒运用在肿瘤生物治疗中的报道，如使用复制缺陷型腺病毒作为载体搭载一些抗肿瘤因子的编码基因，进入体内后再表达这些因子，期望能起到长效的抗肿瘤作用，以克服直接输注这些抗肿瘤因子的缺陷。溶瘤性腺病毒作为治疗肿瘤的一种新型手段，目前，其研究已经取得了令人可喜的成绩1—2，由于可在肿瘤细胞中复制、裂解肿瘤细胞，成为本领域一大热点。同时也有人开发能在体内表达抗肿瘤因子的溶瘤性腺病毒，以发挥双重功效。比如中国ZL200410046237.x中公开了一种特异性的溶瘤腺病毒，命名为腺病毒KH901，同时还公开了其制备方法其基因序列。腺病毒KH901既可在肿瘤细胞中复制、裂解肿瘤细胞，而且可在肿瘤部位表达GM-CSF，刺激机体的抗肿瘤作用。目前，目前该产品已经进入临床研究阶段。一般认为在传统的肿瘤放化疗之外，可以使用基因治疗手段作为有效的补充，期望两者能在通过不同的机理和途径共同作用以达到抗肿瘤的目的。如Spear2等的研究表明电离辐射可以不改变病毒复制能力而增强病毒hrR3的抗瘤活性。也有实验证实采用腺病毒载体感染Y射线照射后的小鼠肺癌细胞，细胞内lu基因编码产物呈剂量依赖性扩增，肿瘤细胞生长明显受到抑制3。Bradley4等证实了放疗联合删除ICP34.5的R3616进行治疗，可以更好地抑制肿瘤生长，从而提高患者的生存率。国内外均未见放射性核素标记腺病毒及其应用的报道。
发明内容本发明所要解决的主要技术问题是改善腺病毒体内抗肿瘤活性。解决该技术问题的技术方案是提供一种由放射性核素修饰的腺病毒，该腺病毒的衣壳蛋白上修饰有放射性核素。其中，上述的放射性核素为""I、"11、"P、188Re、18bRe、9中的至少一种。其中，上述的腺病毒为溶瘤性腺病毒。优选的，上述的溶瘤性腺病毒为腺病毒KH901。其中，上述每个腺病毒上修饰的放射性核素为5.0X10—32.0X10—2Bq。优选的，上述每个腺病毒上修饰的放射性核素为8.3X10—39.3X10—3Bq。本发明要解决的第二个技术问题是提供了一种制备上述放射性核素修饰的腺病毒的方法。该方法包括以下步骤准备浓度为lX1081X101()VP/ml的腺病毒溶液，然后每IOOyl腺病毒溶液中加入lX1051X107Bq的放射性核素，再每IOOU1加入N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)1100yg，室温下加入磷酸盐缓冲液调节pH值至77.6。反应25分钟，再加入2%的人血清白蛋白(HSA)溶液终止反应。优选的方法为准备浓度为8X109VP/ml的腺病毒KH901，然后每100yl腺病毒溶液加入7.4MBq1311/1251和25ygNBS，再加入pH值为7.5的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液120yl，室温下反应3min，再加入IOy12。/。的HSA溶液终止反应。本发明所要解决的第三个技术问题是提供了上述放射性核素修饰的腺病毒在制备抗肿瘤药物组合物中的用途。本发明所要解决的第四个技术问题是提供了一种抗肿瘤药物组合物。该抗肿瘤药物组合物是由上述的放射性核素修饰的腺病毒作为主要活性成分添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。根据本发明的第一个方面，可以用放射性核素对腺病毒的衣壳蛋白进行修饰，如共价修饰或鳌合。标记后能使每个腺病毒的衣壳标记上一定量的放射性核素，以达到能在体内抑制肿瘤生长的作用。根据具体的肿瘤种类和要使用的腺病毒的量可以对每个腺病毒上的标记量可以有一个较大的浮动范围，以达到腺病毒的作用与放射性核素的作用的较好的结合。对于溶瘤性腺病毒，每个腺病毒上修饰的放射性核素为5.0X10—32.0X10—2Bq是一个较好的范围。放射性核素可通过化学键共价连接或者螯合到多肽或蛋白质的氨基酸残基上进行标记。但是要使标记量达到本发明的要求并且不能破坏腺病毒的结构和活性(标记量可根据所加入的病毒的量及通过y计数仪所测得的放射性核素的量计算得出)。螯合可以使用腺病毒衣壳蛋白氨基酸巯基鳌合金属放射性核素，方法是用还原剂(如SnCl2、连二亚硫酸钠、酒石酸亚锡)将腺病毒衣壳蛋白氨基酸的双硫键还原为可鳌合金属放射性核素的巯基，以完成标记;或者通过在氨基酸残基偶联的双功能鳌合剂鳌合上金属放射性核素。双功能螯合剂的特定立体化学结构的螯合基团能牢固结合核素离子，含有的活性官能基团能借助共价键与蛋白质的氨基酸片段连接，这样间接将放射性核素连在蛋白分子上，此方法对标记物的活性影响也比较小，且体内稳定性也比较好。碘修饰的方法可以使用现有的碘标记蛋白质的方法(如氯胺T法，NBS法)，共价修饰的位点主要为衣壳蛋白上的酪氨基酸残基，主要的修饰位点是取代酪氨酸苯环上的氢原子。当然，在本发明中提供了一种放射性碘修饰溶瘤腺病毒的方法，经实验证明能够达到要求。放射性核素是指原子核能自发地发射出某些特殊射线而转变成另一种核素的不稳定核素。可以使用的常见放射性核素的种类为1251、mI、32P、188Re、186Re、9Gy中的至少一种，本发明以1251/1311为模型作为研究的实例。本发明放射性核素标记的腺病毒中被修饰的腺病毒可以是普通的腺病毒，也可以是溶瘤性腺病毒。可以将放射性核素对肿瘤的抑制作用和溶瘤性腺病毒的抗肿瘤作用结合起来，达到更好的作用。另外也可以单独对携带有抗肿瘤多肽基因的腺病毒载体进行修饰，这样就能将抗肿瘤多肽的作用和放射性核素的作用结合起来，起到更好的抗肿瘤效果。优选腺病毒KH901这种能在体内表达抗肿瘤因子的溶瘤性腺病毒。本发明的有益效果在于本发明射性核素1311共价修饰的腺病毒不仅病毒的自身活性没有受到影响，可以正常复制腺病毒溶瘤并分泌表达抗肿瘤因子，而且体内外实验结果也显示:病毒溶瘤治疗与放射性核素的作用相结合，可大大提高对肿瘤细胞的杀伤作用，能够更好地抑制体内的肿瘤生长，很好的起到了协同作用。既能起到更好的作用，同时减少了病人反复注射和反复进行放疗的痛苦与不便，减少了治疗成本，提高了生活质量，还使治疗程序更简便，提高了治疗效率。为肿瘤治疗开辟了新的方式。图1为添加PBS的体积与标记率关系图2为荷瘤裸鼠1311-KH901显像(前位，2h、6h、12h、24h)。图3为荷瘤裸鼠^1311显像(前位，2h、6h、12h、24h)。以下结合附图通过具体实施方式对本发明进行详细的说明具体实施例方式实施例一本发明放射性核素修饰的腺病毒的制备一般而言，制备本发明放射性核素修饰的腺病毒的过程可简要表示如下腺病毒-衣壳蛋白+n放射性核素^^腺病毒-衣壳蛋白一(放射性核素)n其中的放射性核素可以通过化学键共价连接(如1251/1311取代酪氨基酸残基苯环的氢原子)或者通过巯基螯合金属放射性核素或者通过偶联在腺病毒衣壳蛋白的双功能螯合剂螯合金属放射性核素，这样将放射性核素连接到腺病毒表面衣壳蛋白上。上述的n为正数，表示每个腺病毒上标记的放射性核素的原子数，其值为使每个腺病毒上修饰的放射性核素量达到要求。由于现有技术难以直接检测放射性核素的数量，故使用通用的以放射性的量来表示放射性核素数量的方式。本发明中比较优选的范围的为使每个腺病毒上放射性核素为5.0X10—32.0X10—2Bq。更优选的，使每个腺病毒上修饰的放射性核素为8.3X10—39.3X10—3Bq。1、材料准备用BALB/c小鼠24只，体重约20g，雌雄不限，分为8组，每组3只(四川大学实验动物中心提供)。腺病毒KH901由成都康弘生物科技有限公司提供(其其制备方法及基因序列见中国专利ZL200410046237.x);Na1251/Na1311由成都中核高通同位素股份有限公司生产(无载体、无还原剂、放射化学纯度》96%，pH值7.08.0，y杂质〈0.1%)，S印hadexG-10为pharmacia公司生产(瑞士)；N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)为sigma产品(USA)，人血清白蛋白HSA(上海)，分析纯；丙酮(成都新川化学试剂有限责任公司)，分析纯；y计数仪(国营二六二厂)，ESJ120-4电子分析天平(沈阳)，漩涡混合器XW-80A(上海医科大学)，分布收集器(上海)。2、制备方法采用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)作为氧化剂，NBS以三蒸水溶解，浓度为O.5mg/ml;调整腿901液体为8X109VP/ml;固定1251/1311的用量，改变腿901及NBS的用量，以筛选得最佳修饰条件。各反应管内先加入腿901100U1，然后加入1251/1311溶液0.5yl(约7.4MBq)，最后分别加入NBS溶液30、50、70、100y1，室温下分别加入适量的O.05mol/L的磷酸盐缓冲液，盖紧管口。使用漩涡混合器混匀。反应约3分钟后，再每管加入IOyl2。/。的HSA溶液终止反应。保持其它条件不变，再分别考察1251/1311的用量、反应时间、pH值、反应体积对1251/1311-腿901标记率的影响。标记率(标记产物与加入的总放射核素的比值)的纸层析法检测固定相为新华I号纸，展开剂为丙酮生理盐水=1:1(体积比)，1251/1311-KH901的Rf=0.00.1，游离lM^m工的Rf=0.9L0。采用相同方法，固定1251/1311及朋3的用量，改变腿901的量分别为25、50、75、100、130、150y1，反应3分钟后，取样测标记率。3、制备方法的优化方法的优化及确定a、1251/1311用量、腿901量及NBS用量与标记率的关系1251/1311用量为7.4MBq时标记率较高；NBS用量达到25Ug时标记率达到最高，再增加无明显变化，因此，反应最佳条件为:每100ylKH901(8X10VP/mL)、7.4MBq1/1、25ygNBS。标记率可达到78%b、反应时间对标记率的影响标记率在2min内随时间延长快速提高，3min以后随时间延长标记率无明显变化，反应310min标记率都能达到75。/。以上，确定反应时间为310miruc、pH值对标记率的影响保持其它条件不变时，pH在6.57.5时标记率随pH值增大而提高，到pH值7.5时标记率最高，再增大pH值标记率反而有所下降，确定本实验的最佳pH值为7.5。d、反应体积对标记率的影响本次实验通过往反应体系中加入一定量的磷酸盐缓冲液调节反应体积及pH值，发现当反应体积过小时标记率不高，可能由于溶液的缓冲能力不够，pH值未调节到有利于反应的范围；随反应体积的增大标记率也随之增大，之后随反应体积增大，标记率反而下降，如图l。可能由于体积过度增大时，反应物的有效浓度降低，分子间相互作用减弱，标记率降低。本实验选择磷酸盐缓冲液加入体积为每IOOul反应体系加入80y1160yl，最佳为120yl。本发明以Mather^报道的N—溴代琥珀酰亚胺(NBS)方法作为基础，开发适合对腿901进行1251/1311修饰的方法，最后确定的方法如下准备浓度为1X1081X1010VP/mL的腺病毒溶液，然后每100yl腺病毒溶液中加入lX1051X107Bq的放射性核素，再每100yl加入NBS1100yg，室温下加入磷酸盐缓冲液调节pH值至77.6。反应25分钟，再加入2%的人血清白蛋白(HSA)溶液终止反应。优选的方法为当取IOOy1浓度为8X109VP/mL的腺病毒腿901时，加入7.4MBq1311/1251和25ygNBS，再加入pH值为7.5的0.05mol/L的磷酸盐缓冲液120y1，室温下反应3min，再加入IOyl2。/。的HSA溶液终止反应。标记率可达到78%以上。经纯化后标记物的放化纯度可达到95%以上。该方法主要针对1311和1251标记腺病毒，反应体系简单，步骤简便，标记率高，是一种比较理想的放射性碘标记腺病毒的方法。实施例二本发明放射性核素标记的腺病毒的纯化制备和体外稳定性采用S印hadexG-10(0.5cmX30cm)凝胶柱层析法，使用实施例一的修饰方法制备1251/1311标记的腺病毒(分别制备1251、1311标记的腺病毒)，得到了标记率高的反应溶液后进行分离纯化。上样前先往柱内加入一定量的白蛋白饱和，以消除层析柱对腺病毒KH901的非特异性吸附。上样并将样本量定容至O.5ml，采用部分收集器连续收集淋洗液50管，1ml/管(约15滴)，每管洗脱液分别取出IOul测定各管的放射性计数(min—。，确定标记物和游离碘的峰位，取第一峰(第一峰为1251/1311-腿901)，经0.22um微孔滤膜过滤除菌，置于4。C保存备用。标记物纯化后用纸层析法测得放化纯度达到95%以上，1251/1311-101901修饰产物中每个腿901腺病毒上修饰的1251/1311约为8.329.25X10—3Bq。将实施例二制备的腺病毒放置在4'C冰箱，用纸层析法测定标记物于标记后l、2、3、4、5、6、7天内不同时间的放射化学纯度。结果表明1251/1311-腿901在4。C冰箱放置7天其放化纯度基本稳定，保持在93%95%，表明其在体外具有较强的稳定性。为了使该产品便于以后在临床中使用更方便安全，可将该产品存储在-S(TC条件下。实施例三本发明放射性核素修饰的腺病毒体内生物学分布及稳定性检测目前，放射性核素用于肿瘤治疗既可以直接在肿瘤局部应用，也可以通过抗体靶向治疗。为了更好地将肿瘤的病毒溶瘤治疗和放射性核素治疗有机结合，利用病毒溶瘤和核素协同杀伤、杀死肿瘤细胞；同时，为了探讨腿901的体内生物学特点，本发明进行1251-腿901正常小鼠体内的生物学分布实验，既研究了1251-腿901的体内稳定性，也为KH901的溶瘤治疗的进一步研究奠定基础准备8组小鼠，每组5只，每只小鼠经尾静脉注射O.1ml放化纯度为94%的1251-腿901。另取两个O.lml1251-KH901作为标准源。分别于注射后15min、30min、lh、2h、4h、8h、12h、24h各取出一组小鼠断头取血，解剖取出各主要脏器，称重并测定其放射性计数。结果以每克组织放射性摄取百分比(％ID/g)表示。1251-腿901标记物在正常小鼠体内的生物分布列于表1。结果显示1251-腿901主要分布在肝脏中，其次在肾脏、脾脏中含量也较高，除肝脏及肾脏外24h内各个脏器的放射性摄取随时间的延长不断下降，24h后肝脏及肾脏的放射性分布仍较高，肠道的放射性分布一直较低表一<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>用放射性核素"3l对特异性溶瘤重组腺病毒KH901进行标记及标记物在正常小鼠体内生物学分布试验，结果显示01901可以被1251进行修饰，修饰物经纯化后体外稳定性好，在4'C体外放置7天后放化纯可保持在93%95%。标记物在正常小鼠体内主要分布在肝脏，其次在肾脏、脾脏中含量也较高。24h内各脏器的放射性摄取随时间的延长不断下降，24h后肝脏及肾脏的放射性分布仍较高，肠道的放射性分布一直较低。体内生物学分布实验表明1251-KH901在肝中摄取较高，且滞留时间较长，提示标记物可能对肝脏的毒副作用较大，另一方面，也提示可以进一步研究标记物对肝癌细胞的作用。在血液中放射性较低且清除较快，说明其显像时本底可能较低，有作为显像剂的潜在应用价值。甲状腺内的放射性较高，可能由于没有封闭甲状腺，摄取游离的1251所致。各脏器的放射性分布随着时间的延长总体呈下降趋势，24小时后肝脏及肾脏的放射性分布仍较高，肠道的放射性分布一直较低。实施例四放射性核素标记后KH901的生物学活性检测该实验及结果如下由于KH901的E3区安插有GM-CSF的cDNA，可在肿瘤部位表达GM-CSF因子，增强机体的抗肿瘤作用。沈富兵等已经通过实验证实KH901在肿瘤细胞中表达高水平的粒细胞一单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)，而在正常细胞中只有少量GM-CSF产生。本实验通过以MOI二IOPPC和MOI二lPPC的1311-KH901感染人肿瘤细胞，24小时后采用ELISA法测定GM-CSF的免疫活性。可间接反映1311-腿901标记物的生物学活性。1311-KH901在体外肿瘤细胞中表达GM-CSF的检测将人肿瘤细胞H印G2按1X10V孔接种于24孔细胞培养板，待细胞长满孔底时，分别以MOI二IOPPC和M0I二1PPC的mi-KH901感染培养板各孔细胞，然后在37'C、5%C02培养箱中分别孵育24小时，分别收集细胞上清培养液，用ELISA法(按试剂盒说明书操作，试剂盒为BPBBiomedicals,Inc，测定GM-CSF免疫活性。统计学分析全部实验数据以均数±标准差(；±s)表示，釆用SPSSIS.0统计软件进行分析，P值小于0.05为有统计学意义。两种方法的比较用成组设计t检验。表2不同感染复数的l"I-KH%1在体外肿瘤细胞中GM^SF的表达<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>结果列于表2。可见，M0I=10PPC和M0I二1PPC的"4一KH901感染人肿瘤细胞H印G2时，可表达大量的GM-CSF，P〉0.05，两者之间无统计学差异。表明放射性标记处理对腺病毒的生物活性无影响。实施例五本发明1311—腿901对荷人肝癌的裸鼠的治疗实验腺病毒KH901的体外特异性抗肿瘤作用研究表明6KH901可选择性的在肿瘤细胞中复制，而在正常细胞中复制能力差。沈富兵^等已经证实KH901在荷瘤鼠体内具有抗肿瘤作用，并表达高水平的GM-CSF。以上KH901体内外实验均表明其会成为一种很有前途的临床基因治疗药物。但是，KH901在体内的生物学行为还不清楚，采用一般的药物代谢研究方法无法了解。故本发明125I/131I-KH901的体内功效就更加难以预测。H印G2裸鼠移植瘤模型构建选择指数期生长细胞计数达106107cells/ml的H印G2细胞，1000r/min离心5min，弃去上清，用PBS将细胞重悬为浓度5X1061X107cells/ml的单细胞悬液，备用。取20只裸鼠，按0.2ml/只快速将单细胞悬液接种于裸鼠右前肢内侧腋窝皮下。实验步骤严格遵循无菌原则，在华西医学实验动物中心饲养。2周左右，肿瘤长至约0.8cmXl.Ocm，用于实验。肝癌裸鼠的治疗实验分组取20只荷人肝癌裸鼠，按体重、肿瘤大小的等级分成4个组，每组5只，再将每个组中的荷瘤裸鼠随机分配到各实验组及对照组，每组4只，分别接受不同处理。a、阴性对照组(A组)每只荷瘤裸鼠经尾静脉注射0.2ml生理盐水；b、阳性对照组(B组)每只荷瘤裸鼠经尾静脉注射O.1mg/0.2ml表阿霉素；c、1311-01901瘤体注射组(C组)每只荷瘤裸鼠经肿瘤中心部位直接缓慢注射0.2ml1311-腿901(1.52MBq1311，1.6X109VP/每鼠)；d、1311组(D组)每只荷瘤裸鼠经尾静脉注射0.2mlNa1311(1.52MBq);e、KH901瘤体注射组(E组)每只荷瘤裸鼠经肿瘤中心部位直接缓慢注射O.2mlKH901(1.6X109VP/每鼠)实施方案接受不同处理的各组动物均在相同SPF级华西动物实验中心饲养，并在给药前3d至实验结束口服O.1XKI溶液以保护甲状腺，阳性对照组，隔3周重复给药一次；A组、C组、D组及E组均间隔2天重复给药一次，共给药3次。肿瘤生长情况检测实验期间每隔3d定时专人观察肿瘤生长情况(表面有无渍疡、坏死等)，并用游标卡尺测量肿瘤的大小(长径a、短径b)，连续观察各组肿瘤大小，直至实验结束，观察期为1月。按公式计算肿瘤体积及肿瘤生长抑制率肿瘤体积(cm3)V二ab2/2肿瘤抑制率(％)=〔l一(治疗组开始平均瘤重-治疗组结束平均瘤重)/(对照组开始平均瘤重-对照组结束平均瘤重)〕xioo%统计学分析全部实验数据以均数±标准差(；±s)表示，釆用SPSSIS.O统计软件进行分析，P值小于0.05为有统计学意义。两种方法的比较用配对t检验，各荷瘤裸鼠处理组间的比较采用完全随机设计的方差分析，各组间各变量比较采用方差分析。实验结果显示各组肿瘤生长情况见表3。_表3给药前后肿瘤体枳的变化〔n=4,;±0<table>complextableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>可见，给药前各处理组肿瘤体积无统计学差异性，"4-KH901通过瘤内注射给药，与1311尾静脉给药组及腿901瘤内给药组比较，抑瘤率有统计学差异；1311组、KH901瘤内给药组抑瘤率与阳性对照组比较有统计学差异，与阴性对照组比较无统计学差异。可以看出，1311-腿901对荷人肝癌裸鼠具有治疗作用，且在本实验中表现出了比单独使用1311组或腿901更好的效果。另外，该实验期间，阳性对照组有一只荷瘤裸鼠不能耐受化疗药物毒性而死亡，余荷瘤裸鼠均耐受治疗，无死亡。1311-01901治疗后，荷瘤裸鼠一般情况改善，食欲增加，体重增加正常。实施例六本发明1311—01901对荷人肝癌的裸鼠的显像实验1311—腿901在荷瘤裸鼠体内的核素显像取出荷H印G2瘤(肿瘤约0.8cmXl.Ocm)裸鼠1只，仰卧固定，经瘤内注射0.2ml131I-KH901(3.7MBq);再取荷瘤(肿瘤约O.8cmXl.Ocm)裸鼠1只，经瘤体内注射相同剂量的Na1311，作为对照。注射后各自分别于2h、6h、12h、24h进行静态采集放射性核素显像，观察1311-腿90和^1311在肿瘤部位的浓聚情况。荷瘤裸鼠显像结果如图2可见，注射1311-腿901的荷瘤裸鼠自始至终在瘤体内均有很强的放射性滞留，随时间延长肿瘤部位的放射性摄取未见明显减弱，24h后肿瘤仍清晰显影，部位、大小仍与实际相符；而在整个显像期间，仅在2h、6h时有膀胱影像外，均未见其它组织有明显的放射性分布。但是，注射Na^4的荷瘤裸鼠自始至终均明显见膀胱影像(见图3)，随时间延长膀胱、颈部显像有增强的迹象，而在整个显像期间，仅在2h时隐约可见肿瘤部位的显像，其余时间均未见明显的肿瘤影像。本实验表明本发明放射性核素标记的腺病毒KH901能够富集在肿瘤部位持续发挥功能。以上的较优的具体实施方式是对本发明作进一步的举例说明，但并非对本发明范围的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的精神及所附上的权利要求书定义的范围之内。参考文献1、沈富兵，杨春，雷宁等。特异性溶瘤重组腺病毒腿901对荷瘤鼠肿瘤生长的抑制作用和表达GM-CSF的研究。四川大学学报(医学版)，2007;38(3):286—3902、SpearMA，S皿F，ElingDJ，etal.Cytotoxicity,即optosis，andviralreplicationintumorcellstreatedwithoncolyticribonucleotidereductase-defectiveherpessimplextype1virus(hrR3)combinedwithionizingradiation.CancerGeneTher，2000;7:1051-10593、TangDc，Je皿elleRS，ShiZ，CarboneDP,LoyaF，ChangCH，etal.Overexpressionofadenovirus—encodedtransgeiiesfromthecytomegalovirusimmediateearlypromoterinirradiatedtumorcells.HumGeneTher，1997;8(17):2117-21244、Bradley瓜KataokaY，AdvaniS，ChungSM，AraniRB，GillespieGY，etal.Ionizingradiationimprovessurvivalinmicebearingintracranialhigh-gradegliomasinjectedwithgeneticallymodifiedherpessimplexvirus.ClinCancerRes，1999;5:1517-5225、MatherSJ，WardBG..Highefficiencyiodinationofmonoclonalantibodiesforradiotherapy.JNuclMed，1987;28⑥1034-10366、沈富兵，常建华，杨春，等。特异性溶瘤重组腺病毒KH901的体外特异性抗肿瘤作用研究。四川大学学报(医学版)，2007;38(1):31—3权利要求1.放射性核素标记的腺病毒，其特征在于放射性核素修饰在腺病毒衣壳蛋白上。2.根据权利要求l所述的放射性核素标记的腺病毒，其特征在于所述的放射性核素为。1、^、1SSRe、1SSRe、；Y中的至少一种。3.根据权利要求l所述的放射性核素标记的腺病毒，其特征在于所述的腺病毒为溶瘤性腺病毒。4.根据权利要求3所述的放射性核素标记的腺病毒，其特征在于所述的溶瘤性腺病毒为腺病毒KH901。5.根据权利要求l所述的放射性核素标记的腺病毒，其特征在于所述每个腺病毒上修饰的放射性核素为5'^10—OxlO:Bq。6.根据权利要求5所述的放射性核素标记的腺病毒，其特征在于所述每个腺病毒上修饰的放射性核素为8.3X3X]C^Bq。7.制备权利要求16所述的放射性核素标记的腺病毒的方法，其特征在于包括以下步骤加入浓度为1xx10i:'VP/ni的腺病毒溶液，然后每IOOyl腺病毒溶液中加入1X1(^—1X10'Bq的放射性核素，再每100y1加入N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)1100yg，室温下加入磷酸盐缓冲液调节pH值至77.6，反应25分钟，再加入浓度为2%的人血清白蛋白溶液终止反应。8.根据权利要求7利要求16所述的放射性核素标记的腺病毒的方法，其特征在于包括以下步骤准备浓度为8X109的腺病毒KH901，然后每IOOyl腺病毒溶液加入7.4d口I和25MSNBS，再加入pH值为7.5的o.05mol/L的磷酸盐缓冲液120y1，室温下反应3min，再加入IOyl2%的人血清白蛋白溶液终止反应。9.权利要求16任一项所述的放射性核素标记的腺病毒在制备抗肿瘤药物组合物中的用途。10.抗肿瘤药物组合物，由权利要求16任一项所述的放射性核素标记的腺病毒为主要活性成分添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。全文摘要本发明涉及放射性核素标记的腺病毒，涉及肿瘤治疗领域。该放射性核素标记的腺病毒是将放射性核素共价或螯合修饰在腺病毒衣壳蛋白上。所述的放射性核素为可以选择¹²⁵I、¹³¹I、³²P、¹⁸⁸Re、¹⁸⁶Re、⁹⁰Y中的至少一种。本发明放射性核素标记的腺病毒能够起到更好的抗肿瘤作用，为本领域提供了一种新的选择。文档编号C12N7/00GK101338303SQ20081030432公开日2009年1月7日申请日期2008年8月29日优先权日2008年8月29日发明者李云春,米彦霞申请人:四川大学华西医院