以肿瘤chk1为药靶抗癌重组腺病毒的构建方案及用途的制作方法

专利名称：以肿瘤chk1为药靶抗癌重组腺病毒的构建方案及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人类5型腺病毒(Human adenovirus type 5，ADV5)重组体的构建方案，其技术特征在于定向缺失ADV5基因组的923-946nt序列(CTTACC TGC CAC GAG GCT GGC TTT，该序列编码E1A蛋白122至129位氨基酸)，在此基础上，进一步缺失ADV5 E3区28532-29360nt，在该缺失区域引入一个ClaI酶切位点；在ClaI酶切位点中反向插入620bp的外源性CHK1 cDNA片段(相当于CHK1 mRNA的853-250nt)，从而获取对肿瘤具有治疗作用的重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1。本发明属于医学基因工程技术领域。
背景技术：
恶性肿瘤正在成为危害人类健康的首要疾病。据国内最新流行病学调查资料显示我国现有癌症病人300多万人，每年死于恶性肿瘤的患者约为130万人，每年有160万到200万新发的恶性肿瘤病例，并以3％的速度递增，给我国人民的生活和健康造成巨大威胁，一定程度上制约了我国经济的可持续发展。
目前，多数常见肿瘤的治疗仍面临着严峻的挑战，常规的肿瘤治疗手段无法从根本上清除恶性肿瘤，因此，迫切需要在肿瘤治疗方法上进行创新。
在肿瘤发病内在分子机制逐渐明了的新的历史条件下，肿瘤分子医学理论和方法学的突破引发了一系列发展新型肿瘤治疗模式的尝试，用于治疗慢性粒细胞白血病的新药Gleevec正式成为临床处方药，大量分子靶点特异性抗癌化合物进入临床试用，标志着肿瘤治疗的突破到了一个关键的转折点，并已获得阶段性成果，初步凸显出未来肿瘤问题解决的基本轮廓，其最为核心的解决方法之一就是要从肿瘤繁复的基因调控网络中分解出最为关键的分子靶标，实施分子靶向治疗。截止至2001年底，获FDA批准进入临床实验阶段的分子治疗品种已超过三千种，包括细胞传导阻断剂、血管生成抑制剂、肿瘤疫苗和单克隆抗体，为肿瘤问题的最终解决带来了新的希望，可以说，未来人类肿瘤的有效控制在根本上依赖分子治疗的发展完善。
分子治疗的主要手段主要分为三类单克隆抗体、小分子化合物和基因治疗。
基因治疗作为近年医学领域发展中最具有生命活力的部分之一，已广泛应用于多种肿瘤的临床试验性治疗，显示出良好的应用前景。从1989年至2000年底，美国生物制品评价和研究中心 (Center for Biologics Evaluations andResearch，CBER)批准的临床基因治疗试验项目已超过350项，其中约有70％的项目为肿瘤基因治疗，部分已经进入III期临床试验，取得较好疗效，在巨大的医疗需求的推动下，基因治疗制剂将有可能在数年内正式上市成为临床治疗药物，成为肿瘤现有治疗体系的一个不可缺少的组成部分。
重组ADV5载体作为肿瘤基因治疗应用最为广泛的载体之一，其临床可行性和安全性已获公认，腺病毒基因治疗载体具有以下突出的生物学优势和临床应用优势(1)感染谱广，对多种组织源性的肿瘤细胞，无论是处于分裂期还是静止期的细胞，均能有效攻击，因此，抗癌谱广；(2)ADV-TK进入细胞后，以染色体外的形式存在，无突变、致癌的危险性，临床应用安全，使用后仅产生类似感冒样症状，无造血功能和免疫功能抑制；(3)临床应用方便，可通过腔隙(腹腔、胸腔和颅腔等)给药、局部或瘤体内直接注射(一点或多点)以及介入治疗等途径应用；(4)ADV-TK在细胞体内持续表达仅2-3周，尤其适合肿瘤治疗；(5)经静脉或局部应用后仅产生轻微的炎症反应，副作用轻微；(6)临床级数量、质量的腺病毒易于生产、纯化。
目前肿瘤临床试用的绝大部分载体为缺失了E1及E3区的复制缺陷性腺病毒，进入肿瘤病灶后，对肿瘤的杀灭效应依赖于体外高浓度治疗腺病毒的输入，距离注射点较远的病灶的杀灭效应较弱。为此，近年来，出现了从复制缺陷性腺病毒载体向条件复制性腺病毒载体(conditionally replicative adenovirus)转化的新的发展趋势，所谓条件复制性腺病毒载体是指载体能选择性地在肿瘤细胞内复制增殖，将肿瘤细胞作为生产腺病毒的场所，最终达到裂解杀灭肿瘤细胞的治疗目的，肿瘤细胞裂解释放出高浓度的腺病毒后，可进一步感染距离注射点较远的病灶肿瘤细胞，形成新一轮的感染波，周而复始形成一种正反馈，达到最大的治疗效应。此类载体另一个非常理想的优势是它们不能在正常细胞内完成复制，因此对正常细胞无任何杀伤效应，某些权威医学杂志通俗地将之比喻为杀灭肿瘤的“聪明炸弹”(smart bomb)。在实际应用中，取得了较好的预期效果。在第21届美国肿瘤研究年会上，来自休斯顿Anderson肿瘤中心的一份研究报告表明局部注射后，复制缺陷性腺病毒在人体恶性胶质瘤病灶中的分布较局限，在一定程度上影响了疗效的发挥，与此形成鲜明的对比，能在肿瘤细胞内特异性复制的腺病毒ONYX-015，通过在肿瘤局部的增殖，其分布遍及全瘤灶，取得显著疗效。ONYX-015是美国ONYX药物生物技术公司近年研制出的能在肿瘤细胞内选择性复制的腺病毒，其构建特点是在野生型人类5型腺病毒(wild-type)的基因组上，部分缺失(delete)E1B 55 kDa的编码序列，并加入翻译终止信号，但保留19 kDa E1B的编码序列。在正常情况下，野生型腺病毒在细胞内的复制增殖依赖于E1B 55 kDa蛋白对p53蛋白功能的灭活。在携带正常p53基因的正常细胞，ONYX-015由于缺乏E1B 55 kDa，不能在细胞内复制增殖。相反，由于恶性肿瘤患者p53基因的失活率高达50-70％，ONYX-015因而能在肿瘤细胞中增殖复制最终裂解细胞，因而ONYX-015具有杀灭肿瘤细胞的高度选择性，而对正常细胞无杀伤效应。
作为条件复制性腺病毒载体代表产品的ONYX-015在1996年进入临床试验以来，已经取得了非常令人鼓舞的临床疗效，国际著名的医学期刊《TheLancet》在以《基因治疗的新希望》为题的述评中，高度评价ONYX-015的临床应用前景，国际最著名的医学期刊如《Science》、《Nature Medicine》发表了临床试验结果及评论性文章。目前，美国辉瑞(pfizer)药物公司已从ONYX生物技术公司购买使用专利，并已在多种肿瘤进行临床期试验，其中，对复发性、难治性头颈部肿瘤的治疗正进行临床III期试验，已取得非常满意的疗效，对其他肿瘤如转移性结肠癌、肺癌、胰腺癌、口腔粘膜白斑病(oral leukoplakia)和恶性胶质瘤的临床I-II期试验正在进行中，同时，ONYX已经获得以ONYX-015为载体的一些相关的基因治疗重组腺病毒载体(如插入治疗基因TK，CD)的专利，正从临床前期试验向临床期试验过渡。可以预见，ONYX-015及其相关的基因治疗产品在不久的将来，在美国将正式进入临床应用，在癌症基因治疗的临床开发产品中显示出非常良好的临床应用前景。国内已有4例与ONYX-015类似原理的专利申请专利申请“一种缺陷型病毒及其构建方法”(申请号为99124030.8)通过缺失E1B 55kDa位于2809-3329bp编码序列，并在缺失部位插入终止码的方法得到E1B 55kDa部分缺失的构建体；专利申请“缺失凋亡抑制基因病毒的构建及在肿瘤基因治疗中的应用”(申请号为98113494.7)，部分缺失E1B 55kDa编码序列，并在该缺失部位插入标志基因LacZ，得到E1B 55kDa部分缺失同时携带标志基因的病毒构建体，该构建体的另一特点是有E3区的缺失；专利申请“一种缺失E1A编码序列的重组腺病毒构建的获得及用途”(申请号为01144628.5)，缺失E1A(382-1630nt)序列，筛选出不能表达E1A功能蛋白的重组腺病毒构建体；专利申请“一种联合缺失19kDa、55kDa E1B编码序列重组腺病毒构建体的构建及用途”(申请号为01144629.3)，通过联合缺失19kDa、55kDa E1B编码序列，筛选出不能表达E1B功能蛋白的重组腺病毒构建体。
国内外现有的条件复制性腺病毒载体发明与第一代ADV5基因治疗载体相比，无论在治疗原理上，还是在实际治疗效果上均具有明显的改进，并取得突破性进展，被称为第二代ADV5基因治疗载体。然而，第二代ADV5基因治疗载体均有一些共同的缺点(1)基于腺病毒生物学基础设计的载体虽然具备肿瘤条件复制性的治疗优势，由于设计上的种种不足，获取的腺病毒在肿瘤细胞中的复制、裂解肿瘤细胞的效力远远弱于野生型ADV5，如单用ONYX-015的抗癌有效率仅为0-14％。(2)第二代ADV5基因治疗载体的应用仍以肿瘤局部注射为主，在应用中受到极大的限制，在绝大部分情况下，肿瘤是一种全身性疾病，需经静脉用药的途径进行系统性治疗，以控制原发及转移病灶，因此，第二代ADV5基因治疗载体的选择性和对肿瘤细胞的杀伤效率须进一步加强，以适应改进用药途径的需要。(3)第二代ADV5基因治疗载体均未携带有效的治疗性目的基因，使治疗效应的发挥受到限制。(4)由于现有的分子靶点绝大部分缺乏肿瘤特异性，以第二代ADV5基因治疗载体结合外源性启动子，治疗基因的策略虽然具有相对的肿瘤选择性，但仍不能避免对正常组织细胞的毒性作用。
另外，近年来已经确定了许多肿瘤分子药靶，针对这些分子药靶设计单克隆抗体、小分子化合物，已成为肿瘤治疗发展的主要趋势，其中，一部分已经成为处方药，尚有大量的分子治疗手段正在临床试用评估阶段，取得了较好的初步结果。尽管如此，由于这些新的分子靶点及其分子阻遏手段，绝大部分缺乏肿瘤特异性，由此产生的剂量限制性毒性，仍然是这些疗法目前普遍面临和亟待解决的关键问题，极大地限制了肿瘤问题的解决。

发明内容
基于以上技术背景和重大的医疗需求，本发明将公开一种第三代ADV5基因治疗载体的构建方案，通过该方案获得的构建体具有肿瘤特异性复制、肿瘤特异性表达外源性插入反义基因、肿瘤特异性旁观者效应等明显的优势，并具备高度的治疗指数，适于静脉用药，可以解决目前肿瘤治疗技术和实践中关键的不足之处。
本发明的理论基础基于现有对ADV5腺病毒生物学的深入认识和研究。当ADV5进入细胞后1小时内，ADV5就会表达出E1A功能蛋白，其生物学效应主要包括两方面首先，E1A蛋白结合视网膜母细胞瘤突变基因(Rb)蛋白，使宿主细胞内源性转录因子E2F从Rb-E2F的复合物中释放出来，与此同时，E1A蛋白将激活ADV5表达出E1B功能蛋白，以此灭活宿主细胞内源性转录因子P53对细胞周期驱动激酶的抑制，在E1A、E1B和E2F的共同驱动下，宿主细胞进入DNA合成期，为腺病毒基因组的自我复制提供前提条件；其次，ADV5依赖E1A蛋白激活ADV5的早期基因(E1B，E2，E3，E4)和晚期基因(L1-6)的表达，为腺病毒基因组的自我复制、腺病毒颗粒的包装、逃避宿主细胞的免疫清除、裂解细胞、释放腺病毒颗粒、再感染等完整的生命周期提供允许环境。由此可见，ADV5依赖E1A蛋白启动其序贯性的生命周期，最终裂解宿主细胞。
功能蛋白E1A的编码序列位于ADV5基因组560-1112nt，1229-1545nt，包含三个重要序列分别为677-799nt，此序列为E1A保守序列1(CR1)，用于结合转录辅助因子P300；917-979nt为E1A保守序列2(CR2)，用于结合视网膜母细胞瘤突变基因(Rb)；1007-1115nt为保守序列3(CR3)，为基因转录激活区。
由于几乎所有的肿瘤均存在Rb调控径路的缺陷，如果对E1A 917-979nt的CR2区加以不同的缺失改造，达到在灭活E1A蛋白的RB结合特性的同时尽可能保留E1A转录激活特性的效果，那么，由此获取的腺病毒重组体将有可能在肿瘤细胞内有效复制，最终杀灭肿瘤细胞。另一方面，正常细胞具有的Rb调控径路，可以有效遏止腺病毒重组体依赖E1A蛋白启动其序贯性的生命周期，最终仅形成流产感染。这一理论推测已经为近来二个独立的研究组的工作所证实，Fueyo等(Oncogene，2000，192-12)构建了缺失E1A923-946nt的腺病毒重组体，观察到该腺病毒重组体选择性地在肿瘤细胞内复制，其复制特性强于野生型腺病毒，而对正常细胞无任何毒性作用，单用该腺病毒重组体可显著抑制肿瘤生长；Heise等(Nature Medicine，2000，101134-1139)更深入地证实该构建体对肿瘤细胞具有高度选择性，从静脉单用该腺病毒重组体可显著抑制肿瘤生长并抑制肿瘤转移。
尽管Fueyo与Heise等的前期工作为发展第三代ADV5基因治疗载体提供了关键的理论线索，他们的工作仍有明显的不足之处，他们发展出的ADV5基因治疗载体不包含任何插入性外源性治疗基因，限制了抗肿瘤效应的发挥。为此，本发明在此基础上构建一种新型的ADV5重组体，其技术特征在于定向缺失ADV5基因组的923-946nt序列，并进一步缺失ADV5 E3区28532-29360nt，在该缺失区域引入一个ClaI酶切位点；在ClaI酶切位点中反向插入620bp的外源性CHK1 cDNA片段(相当于CHK1 mRNA的853-250nt)，从而获取对肿瘤具有治疗作用的重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1。
CHK1基因全称为细胞周期检测点激酶基因1，是DNA损伤细胞周期检测点的关键激活基因，已有充分的证据表明CHK1是细胞必要的生存基因，而灭活CHK1将直接诱导细胞凋亡，因此，在本发明中被选为分子药靶。
与现有的重组腺病毒构建体相比，本发明达到了以下效果1、该重组腺病毒构建体缺失E1A蛋白的923-946nt序列，缺失范围小于Fueyo与Heise等报道的构建体，在理论和实际上达到了在灭活E1A蛋白的RB结合特性的同时尽可能保留E1A转录激活特性的效果。更为重要的是，我们在Δ923-946ADV5载体的E3 6.7K/gp19K区反向插入620bp的外源性CHK1 cDNA片段(相当于CHK1 mRNA的853-250nt)，使反义CHK1 cDNA的表达依赖ADV5自身E3区转录单位的内源性启动子，该启动子具有类似CMV启动子的高活性，启动子的开放完全依赖于腺病毒在细胞内的复制，腺病毒如不复制，外源性反义CHK1 cDNA将不表达。由于这种全新的设计，使这一新的构建体可通过三重机制达到选择性杀灭肿瘤细胞的治疗目的，即构建体只在肿瘤细胞内的复制，可使外源性反义CHK1 cDNA拷贝数大为增加；构建体携带反义CHK1 cDNA只在肿瘤细胞内表达，特异性灭活肿瘤细胞的CHK1基因表达，达到杀灭肿瘤细胞的目的，避免了对正常细胞的攻击；构建体以肿瘤细胞为复制宿主，在肿瘤局部可产生高浓度腺病毒，形成强效旁观者效应。此外，本发明也将为后继其他分子治疗提供一种使用的设计模式。
2、国外大型的跨国制药公司目前正在开发多种作用于细胞周期检测点的抗肿瘤药，成为药物研发的主要领域之一，但这些药物仍未很好解决作用靶点选择性的问题，限制了临床疗效的发挥，本发明采用更为特异性的细胞周期分子靶点CHK1，是一种全新的作用于细胞周期检测点的抗肿瘤药。
3、对肿瘤细胞系及正常对照细胞体外实验结果表明，该重组腺病毒构建体对正常细胞CHK1基因的表达无明显影响，对细胞活性无明显影响，相反，它可特异性灭活CHK1基因的表达，显著地杀灭肿瘤细胞。
4、对肿瘤动物模型的体内模型研究证实，通过肿瘤局部注射或静脉注射的用药途径，该重组腺病毒构建体对受试的所有肿瘤动物模型均具显著的治疗作用，并可有效抑制肿瘤转移，且对动物无明显的治疗相关毒性。
四

附图1质粒pXC1的结构示意图，该质粒包含人类5型腺病毒(ADV5)21-5790nt序列。
附图2质粒pBHGE3的结构示意图，该质粒包含除ADV5包装信号(194-358nt)外的全部基因组序列，并在194-358nt之间插入一段人工序列，全长37436bp。
附图3ADV5 E3区结构图，该区域编码7种蛋白，要缺失的区域为28530-29355bp，为E3 6.7k/gp 19k区域，在该区域反向插入620bp的外源性CHK1 cDNA片段(相当于CHK1 mRNA的853-250nt)。
附图4pCDNA3.1的质粒结构图，该载体用于构建中间载体pCDNA3.1-ΔE3。
附图5重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1结构示意图。
附图6重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1的序列及结构说明。
五具体实施例方式
除特别注明外，本技术流程中所用的酶和PCR引物均购自美国Gibco公司。
实施例1pXC1系列突变体(Δ923-946pXC1)的构建1、pXC1购于Microbix Biosystem Inc.(Toronato，Ontario，Canada，目录号PD-01-03)，该质粒包含人类5型腺病毒(ADV5)21-5790nt序列，其质粒结构图见附图1，该质粒的194-358nt为ADV5腺病毒包装信号，序列560-1112nt，1229-1545nt为功能蛋白E1A的编码序列，9883-9888nt包含BamHI酶切位点，1338-1343nt包含XbaI酶切位点。
2、采用3次PCR法缺失923-946nt。
(1)、片段1的获取引物1＝5′-CGGGA TCCGGG CCC CCA TTT CC-3′(相当于9883-9902nt，下划线部分为BamHI酶切位点)；引物2＝5′-GTC ACTGGG TGG ATC GAT CAC CTCCGG TAC-3′(相当于922-905nt，下划线部分为与引物3互补部分)；以pXC1为模板，行PCR反应，反应体系总体积为100μl，包括含MgCl2的10×PCR缓冲液10μl、2mM dNTP 10μl、10μM引物1 1μl、10μM引物2 1μl、pXC1 10ng、pfu高保真Taq酶2.5u、加水至100μl；反应条件为95℃30秒；95℃45秒、60℃1分钟、72℃2分钟共28循环；72℃延伸10分钟。PCR产物为940bp(片段1)，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于后继PCR反应。
(2)、片段2的获取引物3＝5′-GAG GTG ATC GAT CCA CCC AGTGACGAC GAG-3′(相当于911-947nt，下划线部分为与引物2互补部分)；引物4＝5′-TGCTCT AGACAC AGG TGA TGT CG-3′(相当于1344-1325nt，下划线部分为XbaI酶切位点)；以pXC1为模板，行PCR反应，反应条件同上，产物为400bp(片段2)，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于后继PCR反应。
(3)、片段3的获取将50ng片段1与25ng片段2混合，作为模板行PCR反应，上游引物为引物1，下游引物为引物4，反应条件同上，产物约为1400bp(片段3)，用QIAquick 8 PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN，German，Cat28142)纯化后，用BamHI，XbaI双酶切过夜，酶切产物在1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切片段用于克隆。
3、将pXC1用BamHI，XbaI双酶切过夜，酶切产物在1％琼脂糖凝胶电泳分离后产生2条带，约为1400bp和6200bp，回收6200bp酶切片段用于克隆。
4、取40ng的6200bp pXC1酶切片段及90ng片段3，用DNA T4连接酶做连接反应，取1.5μl转入100μl DH5α感受态细菌，挑取阳性克隆，质粒小提，DNA测序鉴定筛选得到缺失121-129AA 923-946nt的pXC1质粒突变体-Δ923-946pXC1，用于重组腺病毒的克隆。
实施例2Δ923-946ADV5重组腺病毒的构建1、pBHGE3购于Microbix Biosystem Inc.(Toronato，Ontario，Canada，目录号PD-01-12)，该质粒包含除ADV5包装信号(194-358nt)外的全部基因组序列，并在194-358nt之间插入一段人工序列，全长37436bp，其结构见附图2。
pBHGE3从Microbix Biosystem Inc.获取时，总量为10μg，先电转入感受态细菌，挑取阳性克隆，由于质粒片段很长，需用CsCl2-Eb超速离心法纯化质粒，按“分子克隆”一书的方法进行。
2、同源重组法获取Δ923-946ADV5重组腺病毒构建体，方法如下(1)、在15cm培养皿中种入7.5×105293细胞(ATCC，U.S.A，目录号CRL-1573)，培养液为10％FBS DMEM，到第二天，细胞应为1-1.5×106，大约70％的细胞融合；转染前3-4小时，换成新鲜培养液。
(2)、配制共转染DNA-磷酸钙溶液将1600μl灭菌的2×HBS(280mMNaCl，43mM HEPES，10mM KCl，10mM Na2HPO4.7H2O，2％dextrose，pH7.05-7.15)；pBHGE3和Δ923-946pXC1各42μg；加灭菌的双蒸水至2840μl混匀，缓慢加入50μl 2.5M的CaCl2，颠倒混匀，在室温下让DNM/CaCl2沉淀45-60分钟，形成微混浊的沉淀。
(3)、加500μl上述混合液至含5ml 60mm培养皿的293细胞中，在37℃、5％CO2中孵育4-6小时，吸去上述液体，用PBS洗一次。
(4)、用含15％的甘油DMEM处理1-2分钟以促进转染效率，用PBS洗一次，换为完全培养液。
(5)、制备10％低溶点琼脂糖PBS，高压灭菌，分装成10ml，用前在沸水中融化，保温在45℃，在用前加入30ml 10％FBS DMEM，终浓度为1.2％，即刻使用。
吸去培养液，加入5ml上述液体。每4-5天，加入3ml上述液体。
(6)、14-21天，噬斑出现，选定6-12个噬斑，用记号笔划圈，用200μl的吸头，将噬斑转移到含10％FBS DMEM的0.5ml的24孔板，在37℃中滤过24小时。
(7)、在24孔板培养皿中种入1×105293细胞，培养液为10％FBS DMEM，到第二天，细胞应为2×105，大约70％的细胞融合，吸去液体，从上述滤过液取100μl(大约为103腺病毒)加入，轻轻晃动液体3次，在37℃、5％CO2中孵育90分钟。
(8)、加入完全培养基至1ml，将细胞放置于37℃、5％CO2中孵育5-10天，直至完全的CPE出现。所谓CPE，即细胞毒效应，细胞表现为变圆，漂浮，细胞以核仁为主。假如10天后，完全的CPE未出现，则提示腺病毒的效价太低，需进行第二轮的扩增。
(9)、将培养板进行三轮的冻--解冻的循环，释放出腺病毒，将裂解液收集于15ml试管，最大速度离心10分钟，收集上清液，冻于-80℃，该液体称为第二代腺病毒，大约为5×107/ml腺病毒。
(10)、对以上腺病毒进行再次扩增，在75cm2培养皿中种入5×106293细胞，培养液为10ml10％FBS DMEM，到第二天，细胞应为1×107，大约70％细胞融合；转染前3-4小时，换成新鲜培养液；取1ml第二代腺病毒储存液加入完全培养基至1ml，用于转染；该MOI约为5；除去75cm2培养皿的液体，加入以上液体，轻轻摇动三次；在37℃、5％CO2中孵育90分钟；加入9ml 10％FBS DMEM，在37℃、5％CO2中孵育4-7天，用于提取腺病毒DNA用于阳性腺病毒的筛选。
(11)、因为293细胞基因组包含完整的E1A基因，提取阳性腺病毒DNA时容易污染293细胞DNA，造成鉴定失败，为此将Δ923-946ADV5在肿瘤细胞Hela(ATCC，U.S.A，目录号CCL-2)中再扩增一次，用于鉴定，步骤如下在6孔板培养皿中种入1×105Hela细胞，培养液为10％FBS DMEM，到第二天，细胞应为2×105，大约70％的细胞融合，吸去液体，从上述滤过液取100μl(大约为103腺病毒)加入，轻轻晃动液体3次，在37℃、5％CO2中孵育90分钟。
(12)、加入完全培养基至1ml，将细胞放置于37℃、5％CO2中孵育5-10天，直至完全的CPE出现，将细胞刮下，收集于1.5ml EP管，离心弃上清，加入300μl PBS溶液，进行三轮的冻--解冻的循环，释放出腺病毒，将裂解液最大速度离心10分钟，收集上清液，冻于-80℃，用Qiagen公司试剂盒miniDNA isolation kit，参照试剂盒说明提取DNA。以腺病毒DNA为模板，行PCR反应，上游引物＝5′-CG GGA TCC GGG CCC CCA TTT CC-3′，下游引物＝5′-TGC TCT AGA CAC AGG TGA TGT CG-3′，反应体系总体积为100μl，包括含MgCl2的10×PCR缓冲液10μl、2mM dNTP10μl、10μM上游引物1μl、10μM下游引物1μl、腺病毒DNA 10ng、p(u高保真Taq酶2.5u、加水至100μl。反应条件为95℃30秒；95℃45秒、60℃1分钟、72℃2分钟共28循环；72℃延伸10分钟。PCR产物为1400bp，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于DNA测序，测序引物为5′-AGCCGGAGCA GAGAGCCTTG-3′，挑选出正确克隆用于构建Δ923-946ADV5/CHK1重组腺病毒。
实施例3ADV5 E3区的亚克隆载体pCDNA3.1-ΔE3的构建1、ADV5 E3区全称为ADV5早期区域3，该区域在内源性启动子的驱动下，编码7种蛋白，序列、结构、功能如下(参见附图3)12.5k，27858-28179nt，功能未明；6.7k，27547-28736nt，功能未明；gp19k，28735-29215nt，结合MHCI类抗原，抑制其呈递至细胞表面，其结果是逃避CTL的清除；ADP，29419-29770nt，裂解细胞，释放腺病毒；RIDα，29784-30057nt，与RIDβ形成复合物，防止TNF的裂解，清除FAS抗原；RIDβ，30062-30458nt；14.7k，30453-30837，抑制TNF的裂解。
本实验的目的是要缺失E3区28530-29355nt区域，并在重组腺病毒的E36.7k/gp 19k区域插入外源性治疗基因。
2、采用3次PCR法缺失ADV5 E3区28532-29360nt。
(1)、片段1的获取引物1＝5′-GGG TCA ACG GAA TCC GCG CC-3′(相当于27301-27320nt)；引物2＝5′-CCC ACA TAG AGT ATC GATTGCGCC TIT GGC CTA ATA-3′(相当于28531-28514nt)(下划线部分为与引物3互补部分，ATC GAT为ClaI酶切位点)；ADV5腺病毒基因组DNA模板来源于野生型ADV5(成都本元基因治疗公司)，腺病毒DNA的获取步骤如下野生型ADV5腺病毒转染293细胞，在75cm2培养瓶中接种5×106293细胞，次日，大约70％细胞融合，细胞应为1×107个；转染前3-4小时，换成新鲜培养液，吸取待检1μl野生型ADV5腺病毒，与1ml DMEM混匀，使MOI约为20；除去75cm2培养瓶的液体，加入上述液体，轻轻摇动三次，在37℃、5％CO2中孵育90分钟；加入9ml 10％FBS DMEM，在37℃、5％CO2中孵育72小时，弃去培养液，用PBS洗三次，弃去液体，加入800μl新鲜配制的细胞裂解液，37℃孵育1小时，将裂解后的细胞混合物加入1.5ml的eppendorf管中，4℃ 12000g离心45分钟；取上清，用等体积的酚/氯仿抽提一次，取上层液体，加入1/10体积的3M NaAc，2体积的无水乙醇，在-20℃孵育一小时，12,000g离心30分钟，70％乙醇洗一次，用25μl TE重悬腺病毒DNA，在分光光度计上测定DNA的浓度，将DNA冻存于-70℃待用。
以ADV5 DNA为模板，行PCR反应，反应体系总体积为100μl，包括含MgCl2的10×PCR缓冲液10μl、2mM dNTP 10μl、10μM引物1 1μl、10μM引物2 1μl、ADV5 DNA 200ng、pfu高保真Taq酶2.5u、加水至100μl；反应条件为94℃30秒；94℃30秒、62℃1分钟、72℃1分钟共28循环；72℃延伸10分钟。PCR产物为1200bp(片段1)，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于后继PCR反应。
(2)、片段2的获取引物3＝5′-GCC AAA GGC GCA ATC GATACT CTATGT GGG ATA TGC TCC AG-3′(相当于29361-29383n)(下划线部分为与引物2互补部分，ATC GAT为ClaI酶切位点)；引物4＝5′-GGG GAA CAA AACGCA GAT AGG-3′(相当于30090-30120nt)；PCR反应条件同上，产物为780bp(片段2)，常规电泳分离纯化后，检测浓度用于后继PCR反应。
(3)、片段3的获取将50ng片段1与25ng片段2混合，作为模板行PCR反应，上游引物为引物1，下游引物为引物4，反应条件同上，产物约为2200bp(片段3)，用QIAquick 8 PCR产物纯化试剂盒(QIAGEN，German，Cat28142)纯化后，用EcoRI酶切过夜，酶切产物在1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收，酶切片段用于后继连接反应。
3、将pCDNA3.1(Invitrogen，U.S.A.，CatV79020)用EcoRI酶切过夜，酶切产物在1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切片段，去磷酸化后用于后继连接反应，pCDNA3.1的结构见附图4。
4、将PCR反应产物片段3与酶切、去磷酸化后pCDNA3.1连接，取1.5μl转入100μl DH5α感受态细菌，挑取阳性克隆，质粒小提，DNA测序鉴定筛选得到缺失28532-29360nt的pCDNA3.1质粒突变体-pCDNA3.1-ΔE3，用于插入外源性治疗基因的亚克隆。
实施例4在载体pCDNA3.1-ΔE3的中反向插入620bp的外源性CHK1cDNA片段1、外源性CHK1 cDNA片段从白血病细胞系HL-60(ATCC，U.S.A，目录号CCL-240)的RNA中扩增而来，RNA提取采用RNA提取试剂盒RNeasy MiniKit(QIAGEN，GERMAN，目录号74104)，具体步骤参照生产商提供的试剂盒说明书进行。
2、逆转录条件5×MMLV缓冲液4μl、10mM dNTP 1μl、OligdT(50ng/ml)1μl、总RNA 2μl、Rnasin 0.5μl、MMLV逆转录酶1μl、加无RNA酶水至20μl；逆转录反应产物用于PCR反应。上游引物为5′-CCATC GATCTG AAGAAG CAG TCG CAG TG-3′(相当于CHK1 cDNA编码序列的250-269nt；下划线部分为ClaI酶切位点)；下游引物为5′-CCATC GATTTC CAA GGG TTGAGG TAT GT-3′(相当于CHK1 cDNA编码序列的853-834nt；下划线部分为ClaI酶切位点)，扩增片段包括CHK1 cDNA编码序列的853-250nt，全长约为620bp。
反应体系总体积为100μl，包括含MgCl2的10×PCR缓冲液10μl、2mM dNTP 10μl、10μM上游引物1μl、10μM下游引物1μl、逆转录反应产物2μl、pfu高保真Taq酶2.5u、加水至100μl；反应条件为94℃30秒；94℃30秒、62℃1分钟、72℃1分钟共30循环；72℃延伸7分钟。
3、PCR产物为620bp，ClaI酶切后，常规电泳分离纯化，检测浓度用于后继PCR反应。载体pCDNA3.1-ΔE3用ClaI酶切线形化后，常规电泳分离纯化，去磷酸化后与620bp的外源性CHK1 cDNA片段连接，取1.5μl转入100μl DH5α感受态细菌，挑取阳性克隆，质粒小提，DNA测序鉴定筛选得到在ClaI酶切位点反向插入620bp的外源性CHK1 cDNA片段的质粒突变体-pCDNA3.1-ΔE3/ASCHK1，用于后继重组腺病毒的克隆。
实施例5重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1的获取重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1的获取按照参考文献《Adenovirus methods and protocol》(edited by William S.M.Wold，constructionof mutations in the adenovirus early region 3<E3>transcription units，11-24)建立的连接法(ligation protocol)进行。
1、TP DNA的提取
(1)、取重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5 2×108，溶于10ml DMEM，使MOI约为10；在一瓶80-90％融合的75cm2培养皿种入293细胞，此时细胞约为2×107细胞，加入1ml以上液体，轻轻摇动三次，在37℃、5％CO2中孵育90分钟，加入10％FBS DMEM至总液体量为10ml，在37℃、5％CO2中孵育4-5天，得到2×1010腺病毒，离心，弃去上清，加入10ml 10％FBSDMEM，进行三轮的冻或解冻的循环，释放出腺病毒，浓度为2×109/ml，将裂解液以1ml的体积分装冻存为10管。第二次扩增转染前，取一管上述冻存液加入9ml DMEM，浓度为2×109/ml，转染10×75cm2培养皿的细胞，在十瓶80-90％融合的75cm2培养皿293细胞，约各为2×107细胞，各加入1ml以上液体，轻轻摇动三次，在37℃、5％CO2中孵育90分钟，加入10％FBS DMEM至总液体量为10ml，在37℃、5％CO2中孵育4-5天，离心，弃去上清，重复以上转染十次，得到总共2×1013腺病毒，冻存于-80℃，保存待纯化。
(2)、293细胞的收集、浓缩及冻存以30ml PBS再悬浮细胞沉淀，将细胞悬液合并置于2个50ml的离心管中，在液氮，37℃水浴中交替冻融三次，使细胞破裂、溶解，释放出Δ923-946ADV5，在普通离心机上2500rpm离心5分钟以除去细胞碎片，离心取上清，冻于-70℃待纯化。
(3)、Δ923-9464DV5的分离纯化Δ923-9464DV5采用氯化铯密度梯度离心法进行纯化，可获得极高纯度的腺病毒。
将上清置于CsCl2液中(Gibco，U.S.A，目录号456-32)，在两个SW-40TL转子上离心4℃，35,000rpm (150,000×g)，1小时。
CsCl2梯度离心液的制备A1.5gm/ml CsCl2梯度离心液，30g CsCl2，溶解于PBS中，其终体积为42.5ml。
B1.35gm/ml CsCl2梯度离心液，取15ml A液，加PBS 7ml，其终体积为21ml。
C1.25gm/ml CsCl2梯度离心液，取11ml A液，加PBS 9ml，其终体积为20ml。过滤除菌，精确称取每一管除菌后的液体重量，并在必要时进行比重的调整。
梯度离心管的制备将上述制备的溶液按照如下方式加至12容积的离心管中，其加入的体积及顺序如下0.5ml 1.5gm/ml CsCl2梯度离心液；3.0ml 1.35gm/ml CsCl2梯度离心液；3.0ml 1.25gm/ml CsCl2梯度离心液。梯度形成后，在每一管加入6ml细胞裂解液上清，用PBS平衡各管的重量。
经离心后，腺病毒将以一层白色区带出现在1.35gm/ml CsCl2梯度离心液及1.25gm/ml CsCl2梯度离心液之间。通过抽吸吸出上层蛋白质，用巴氏德吸管小心吸出中层含腺病毒部分，将其收入一个无菌的100ml离心管中。
将第一次离心得到的腺病毒溶液以1.35gm/ml CsCl2梯度离心液稀释至72ml，将其分配至6只无菌的离心管中，平衡重量后，用上述条件进行单一梯度离心，离心时间延长至18小时。
经上述离心过夜后，Δ923-946ADV5腺病毒将再次形成一层白色区带。通过抽吸吸出上层蛋白质，用巴氏德吸管小心吸出中层含腺病毒部分，将其收入一个无菌的100ml离心管中，其收获量大约为15ml。
(4)、透析法去除残留的氯化铯及其他小分子物质透析除去提取物中的残留的氯化铯及小分子杂质。透析液10mmol Tris-HCl pH 7.5、1mmol MgCl2透析体积 1000ml×3次。透析方法将磁棒加至透析液中，置4℃预冷，然后进行搅拌透析。可制备100×Tris-HCl/MgCl2储存液备用，临用前稀释到1×透析液。离心产物在透析前先用等量的透析液加以稀释后置透析管，以免因腺病毒浓度过高透析后产生沉淀。用于透析的透析管在临用前以去离子水浸泡30分钟，然后再用灭菌的蒸馏水进行冲洗，夹紧透析管的下口，将透析管置于1升稀释液中，以锡箔封住透析瓶瓶口，以防直接光照，将其置于磁力搅拌器上在4℃搅拌透析过夜，同样条件重复以上透析2次。所得腺病毒即为纯化腺病毒。
(5)、柱层析纯化Δ923-946ADV5腺病毒TP DNA在柱层析仪(湖北省科学仪器公司，目录号SSM-213)上准备250ml的Sepharose 4B(Sigma，U.S.A，目录号4B-200)层析柱，置4℃，调节流速至18ml/h；在腺病毒液中加入等体积的含2mmol/L的蛋白酶抑制剂pefabloc(Boehringger Mannheim，目录号1429876)的8M盐酸异硫氰酸胍(Sigma，U.S.A，目录号G9284)，置冰上10min后，上样于层析柱，根据吸光度A260/280的比值，收集TP-DNA(A260/280＝1.8-2.0)，检测DNA浓度后保存在4℃备用。
2、连接反应(1)、pCDNA3.1-ΔE3/ASCHK1质粒用EcoRI酶切，得到10μg包含插入DNA片段在内的EcoRI酶切片段，去磷酸化反应后酶切片段在1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收，用于连接反应；(2)、2.5μgΔ923-946ADV5 TP DNA用EcoRI酶切后，加入5μg包含插入DNA片段在内的EcoRI酶切片段和10U T4连接酶，在16℃条件下，常规连接反应。
3、连接产物共转染293细胞(1)、在60mm培养皿中种入5×105293细胞，培养液为10％FBS DMEM，到第二天，细胞应为1×106，大约70％的细胞融合；转染前3-4小时，换成新鲜培养液。
(2)、将连接产物与20μg鲑鱼精DNA混合，加入灭菌水至总体积450μl，加入2.5M 50μl CaCl2。在500μl灭菌的2×HBS(280mM NaCl，43mM HEPES，10mM KCl，10mM Na2HPO4.7H2O，2％ dextrose，pH 7.05-7.15)中缓慢加入DNA/CaCl2，沉淀45-60分钟，形成微混浊的沉淀。
(3)、加500μl上述混合液至60mm培养皿的293细胞中，在37℃，5％CO2中孵育1/2小时，吸去上述液体，用PBS洗一次。
(4)、用含15％的甘油DMEM处理1-2分钟以促进转染效率，用PBS洗一次，换为完全培养液。
(5)、制备10％低溶点琼脂糖PBS，高压灭菌，分装成10ml，用前在沸水中融化，保温在45℃，在用前加入30ml 10％FBS DMEM，终浓度为1.2％，即刻使用。
吸去培养液，加入5ml上述液体。每4-5天，加入3ml上述液体。
(6)、14-21天，噬斑出现，选定6-12个噬斑，用记号笔划圈，用200μl的吸头，将噬斑转移到含10％FBS DMEM的0.5ml的24孔板，在37℃中滤过24小时。
(7)、在24孔板培养皿中种入1×105293细胞，培养液为10％FBS DMEM，到第二天，细胞应为2×105，大约70％的细胞融合，吸去液体，从上述滤过液取100μl(大约为103腺病毒)加入，轻轻晃动液体3次，在37℃、5％CO2中孵育90分钟。
4、噬斑的挑取和鉴定通过以上实验步骤得到重组腺病毒构建体，再转染293细胞，提取腺病毒DNA，测序鉴定Δ923-946ADV5/ASCHK1，阳性腺病毒应缺失ADV5 923-946nt序列，并缺失ADV5 E3区28532-29360nt，在该区域包含外源性CHK1 cDNA片段(相当于CHK1 mRNA的853-250nt)，其他基因组结构与野生型ADV5完全相同，其序列及结构见附图6。
实施例6重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1特征鉴定1、重组腺病毒构建体的体外肿瘤特异性复制的鉴定本实验的目的在于鉴定Δ923-946ADV5/ASCHK1重组腺病毒在一系列肿瘤及正常细胞中的复制特点，实验将以野生型ADV5为阳性对照，以ADV-TK为阴性对照(为本研究组自行构建的复制缺陷型腺病毒)。选用细胞系为A549(ATCC，U.S.A，目录号CCL-185)，Hela，人成骨细胞瘤细胞系U-2OS(P53+，RB-；ATCC，U.S.A，目录号HTB-96)，人转移性腺瘤细胞系HS700T(P53-，RB-；ATCC，U.S.A，目录号HTB-147)，人结肠癌细胞系DLD-1(P53-，RB-；ATCC，U.S.A，目录号CCL-221)，MCF-7(P53+，RB+；ATCC，U.S.A，目录号HTB-22)。选用的细胞系具有不同的P53、RB基因表型；具有不同组织源性，因此实验结果可代表不同类型的肿瘤。选用的正常细胞为原代的血管内皮细胞、原代的肺小气管上皮细胞、前列腺上皮细胞、骨髓单个核细胞，这些正常细胞从临床标本中分离获取，选用原则为静脉用药后将接触大量腺病毒的正常组织细胞。
(1)、在24孔板培养皿中种入1×105肿瘤或正常骨髓单个核细胞，培养液为10％FBS DMEM，到第二天，细胞应为2×105，大约70％的细胞融合，吸去液体，加入达到70％所需的MOI稀释至100μl加入，轻轻晃动液体3次，在37℃、5％CO2中孵育90分钟。
加入含1％FBS DMEM培养基至1ml，将细胞放置于37℃、5％CO2中孵育3-10天，观察细胞出现完全CPE所需的时间。
实验结果表明，阳性对照腺病毒野生型人腺病毒5无选择性地裂解肿瘤和正常细胞；复制缺陷型腺病毒(ADV-TK)不能裂解任何细胞，重组腺病毒构建体Δ923-946AD5/ASCHK1选择性地裂解肿瘤细胞，其效应显著强于野生型人腺病毒5，同时该重组腺病毒构建体对正常对照细胞系无明显影响。结果充分表明重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1选择性杀灭肿瘤细胞，具体数据见下表


(2)、为进一步进行定量检测Δ923-946ADV5/ASCHK1重组腺病毒构建体在肿瘤细胞中复制效率，进行了以下实验在24孔板培养皿中各种入1×105各种肿瘤细胞或原代正常细胞，培养液为10％FBS DMEM，到第二天，细胞应为2×105，大约70％的细胞融合，吸去液体，加入Δ923-946ADV5/ASCHK1 10MOI稀释至100μl加入，轻轻晃动液体3次，在37℃、5％CO2中孵育90分钟。
加入含1％FBS DMEM培养基至1ml，将细胞放置于37℃、5％CO2中孵育6天。
加入300μl PBS溶液，进行三轮的冻或解冻的循环，释放出腺病毒，将裂解液最大速度离心10分钟，收集上清液，冻于-80℃，用TCID50在293细胞中检测腺病毒的滴度。
结果表明Δ923-946ADV5/ASCHK1在肿瘤细胞中复制后其效价强于起始的500-2000倍，而在正常细胞中感染效价无明显变化，结果充分表明该重组腺病毒构建体具有在肿瘤细胞内特异性复制的特性。
2、重组腺病毒构建体的体外选择性灭活肿瘤细胞CHK1表达特性的鉴定本实验的目的在于鉴定Δ923-946ADV5/ASCHK1重组腺病毒在对一系列肿瘤及正常细胞CHK1表达的影响，实验选用细胞系为A549，Hela，人成骨细胞瘤细胞系U-2OS(P53+，RB-)，人转移性腺瘤细胞系HS700T(P53-，RB-)，人结肠癌细胞系DLD-1(P53-，RB-)，MCF-7(P53+，RB+)。选用的细胞系具有不同的P53，RB基因表型；具有不同组织源性，因此实验结果可代表不同类型的肿瘤。选用的正常细胞为原代的血管内皮细胞、原代的肺小气管上皮细胞、前列腺上皮细胞、骨髓单个核细胞，选用原则为静脉用药后将接触大量腺病毒的正常组织细胞。
在24孔板培养皿中种入1×105肿瘤或正常骨髓单个核细胞，培养液为10％FBS DMEM，到第二天，细胞应为2×105，大约70％的细胞融合，吸去液体，加入达到70％所需的MOI稀释至100μl加入，轻轻晃动液体3次，在37℃、5％CO2中孵育90分钟。
加入含1％FBS DMEM培养基至1ml，将细胞放置于37℃ 5％FBS DMEM培养基至1ml，将细胞放置于37℃、5％CO2中孵育3-10天，提取细胞总蛋白检测CHK1蛋白表达水平的变化。
实验结果表明，重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1选择性灭活肿瘤细胞CHK1蛋白表达至不能检测水平，同时该重组腺病毒构建体对正常对照细胞系CHK1蛋白表达无明显影响。结果充分表明重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1选择性灭活肿瘤细胞CHK1基因的表达。
3、重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1体内抗肿瘤特性鉴定(1)、肿瘤细胞动物模型选择MCF-7肿瘤生长良好，全身状况较好荷瘤动物，颈椎脱臼处死。无菌条件下取出瘤块，用手术刀切割成1-2mm径的MCF-7瘤块，套管针接种于裸小鼠双侧，约一周后实验动物腋下可见肿瘤，当肿瘤生长至6-7mm，按瘤体积大小分层分组。每组5-8只动物，用1×108pfu腺病毒直接肿瘤内注射，连续5天，治疗后用游标卡尺测量肿瘤长、宽径，直至实验终点(90天或肿瘤体积大于1cm3)。
实验结果表明，在实验终点时，阳性对照腺病毒野生型人腺病毒5肿瘤抑制率为80％±2％；复制缺陷型腺病毒(ADV-TK)肿瘤抑制率为-50％±2％；重组腺病毒构建体Δ923-9464DV5/ASCHK1肿瘤抑制率为92％±4％，结果充分表明重组腺病毒构建体923-946ADV5/ASCHK1具有明确的体内抗肿瘤效应。
(2)、重组腺病毒构建体静脉用药选择肿瘤生长良好，全身状况较好荷瘤动物，颈椎脱臼处死。无菌条件下取出瘤块，用手术刀切割成1-2mm径的瘤块，套管针接种于裸小鼠双侧，约一周后实验动物腋下可见肿瘤，当肿瘤生长至4-5mm，按瘤体积大小分层分组。每组5-8只动物，用1×108pfu腺病毒静脉内注射，连续5天，治疗后用游标卡尺测量肿瘤长、宽径，直至实验终点(60天或肿瘤体积大于1cm3)，实验结果表明，在实验终点时，阳性对照腺病毒野生型人腺病毒5肿瘤抑制率为60％±2％；复制缺陷型腺病毒(ADV-TK)肿瘤抑制率为-70％±2％；重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1肿瘤抑制率为94％±4％，结果充分表明重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1静脉用药具有明确的体内抗肿瘤效应。
(3)、重组腺病毒构建体静脉用药抑制肿瘤微转移选MDA-MB-231肿瘤(ATCC，U.S.A，目录号HTB-26)生长良好，全身状况较好荷瘤动物，颈椎脱臼处死。无菌条件下取出瘤块，用手术刀切割成1-2mm径的瘤块，套管针接种于裸鼠乳部，约一周后实验动物腋下可见肿瘤，当肿瘤生长至4-5mm，按瘤体积大小分层分组。每组5-8只动物，用1×108pfu腺病毒静脉内注射，连续5天，治疗后用游标卡尺测量肿瘤长、宽径，直至实验终点(90天或肿瘤体积大于1.2cm3)，取出肿瘤、气管、肺淋巴结，病理检测微转移。实验结果表明，在实验终点时，阳性对照腺病毒野生型人腺病毒5肿瘤抑制率为60％±2％，肿瘤转移的发生率为45％±5％；复制缺陷型腺病毒(ADV-TK)肿瘤抑制率为-70％±2％，肿瘤转移的发生率为100％；重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1肿瘤抑制率为92％±5％，肿瘤转移的发生率为0％。结果充分表明重组腺病毒构建体923-946ADV5/ASCHK1静脉用药具有明确的体内抗肿瘤和抑制肿瘤转移的效应。
权利要求
1.一组重组腺病毒构建体，其命名及技术特征在于该构建体命名为Δ923-946ADV5/ASCHK1，它缺失了ADV5 923-946nt序列CTT ACC TGC CACGAG GCT GGC TTT，该序列编码E1A蛋白122至129位氨基酸，同时，它缺失了ADV5 E3区28532-29360nt，在该缺失区域引入一个ClaI酶切位点，在ClaI酶切位点中反向插入相当于CHK1 mRNA 853-250nt的外源性CHK1cDNA片段，其他基因组结构与野生型ADV5完全相同。
2.构建权利要求1所述的重组腺病毒构建体的方法，其特征在于用PCR扩增定点缺失技术缺失pXC1质粒中E1A的编码区923-946nt序列，组成新的载体Δ923-946pXC1，Δ923-946pXC1质粒与穿梭载体pBHGE3共转染293细胞，筛选出表达E1A突变体功能蛋白的重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5；采用PCR扩增定点缺失技术缺失ADV5 E3区28532-29360nt，并在该缺失区域引入一个ClaI酶切位点，组成新的载体pCDNA3.1-ΔE3，在ClaI酶切位点处反向插入相当于CHK1 mRNA的853-250nt的cDNA片段，组成新的载体pCDNA3.1-ΔE3/ASCHK1；用Δ923-946ADV5提取含末端蛋白的DNA，用EcoRI酶切，与用EcoRI酶切出的载体pCDNA3.1-ΔE3/ASCHK1片段共转染293细胞，筛选出表达E1A突变体功能蛋白的重组腺病毒构建体Δ923-946ADV5/ASCHK1。
3.权利要求1所述的重组腺病毒构建体在制备用于肿瘤治疗的药物中的应用。
4.权利要求1所述的重组腺病毒构建体在制备基因治疗载体中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种人工改造人类5型腺病毒(ADV5)的构建方案，以及用该方案获取的重组腺病毒构建体在肿瘤治疗中的具体用途。用PCR扩增定点缺失、同源重组、转染、腺病毒单克隆纯化等技术，获得一种重组腺病毒构建体，其特征在于ADV5基因组E1A保守序列2(CR2)编码序列24个碱基缺失；ADV5 E3区28532－29360 nt缺失；并在该区域反向插入部分CHK1 cDNA片段。该重组腺病毒构建体能选择性地在肿瘤细胞内复制增殖；插入的反义CHK1 cDNA片段在肿瘤细胞内特异性表达；对肿瘤细胞具有强效旁观者效应。从而特异性杀灭肿瘤细胞，同时对正常细胞无杀灭效应。该构建体在肿瘤治疗药物、诊断试剂的制备中具有独特的实用价值，同时也为肿瘤基因治疗提供了理想的基因靶点特异性治疗应用途径。
文档编号C12N7/01GK1552880SQ03126760
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月5日 优先权日2003年6月5日
发明者周剑峰, 马丁, 卢运萍, 王世宣, 陈刚, 高庆蕾 申请人:深圳市奥尼克斯基因技术有限公司