专利名称：一种通用的抗体靶向非病毒型基因导入系统的制作方法
专利说明一种通用的抗体靶向非病毒型基因导入系统 本发明涉及一种通用的抗体靶向非病毒型基因导入系统。基因导入系统或方法可分成两类病毒型基因导入系统，以逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒为载体；非病毒型基因导入，如DNA直接注射，基因枪，磷酸钙共沉淀法，脂质体介导法。由于病毒型基因导入系统存在许多严重不足，如病毒转染有可能激活癌基因等，故非病毒型基因导入系统是目前研究的一个热点，然而所有这些方法均存在一个重大缺陷，这也是目前基因导入和基因治疗亟待解决的重大问题，即基因导入的细胞靶向性或特异性。以抗体为配体的受体介导的基因导入方法能克服这些方法不足，其原理将能识别细胞膜受体的抗体(也可认为是一种配体)先与带强大正电荷的多聚阳离子多肽(常用为多聚赖氨酸，PLL)共价交联，形成抗体-多聚阳离子多肽交联物，再与带负电荷的核酸片段非共价结合形成抗体靶向的非病毒型基因导入系统，然后通过抗体(配体)与细胞表面的受体结合，借助受体内化机制从而将目的基因片段靶向导入细胞中。以抗体为配体的靶向非病毒基因导入系统较其它配体有其独特的优势可以针对任何受体制备其相应抗体；抗体易纯化；靶向性较好。目前已有多种以抗体为配体通过受体介导的基因导入研究的报道，且获得了较好结果，如抗CD3抗体，抗EGF抗体靶向基因的转染，然而这些抗体靶向的非病毒型基因导入系统的构建需要抗体与多聚阳离子多肽的共价交联，这对于抗体的活性有很大影响，因抗体较其它蛋白易变性失活，另外共价交联过程需用较多的抗体，而抗体的成本较高，故有必要寻找避免抗体化学交联的方法。本发明为一种抗体和核酸片段的连接物，能将IgG抗体与核酸片段(包括质粒或寡核苷酸)非共价键结合，组装成抗体靶向非病毒型基因导入系统用于核酸片段的靶向导入，本发明由金黄色葡萄球菌A蛋白(葡萄球菌A蛋白，SPA或A蛋白)与多聚赖氨酸(Poly-L-Lysin，PLL)共价结合形成A蛋白-多聚赖氨酸交联物(SPA-PLL)，将该SPA-PLL交联物与IgG抗体和质粒或寡核苷酸经混合组装成细胞靶向结合的基因导入系统用于基因转染，该基因导入系统为非病毒导入系统。
由于IgG抗体能与一种小分子蛋白SPA以高亲和力，非共价迅速结合，我们可以先将PLL与SPA共价连接形成SPA-PLL交联物，再将IgG抗体通过SPA的非共价结合从而与PLL连结起来，最后与目的基因片段结合组装抗体靶向的非病毒型基因导入系统(见下图解)，这样可避免抗体的化学交联。换句话说，该SPA-PLL交联物有两个“臂”，一只与预导入的基因片段非共价连接，另一只与IgG抗体非共价连接，也即通过SPA-PLL交联物将IgG抗体和基因片段非共价结合在一起，进行基因片段的细胞靶向性导入。这种靶向基因导入系统有多种特性及优越性1、抗体以非共价方式与预导入的基因片段结合，故对抗体的靶向活性无损伤2、因SPA可与多种IgG抗体以高亲和力，非共价迅速结合，故只要制备出SPA-PLL，就可以将任何IgG抗体与任何预导入的基因片段结合构建抗体靶向的非病毒基因导入系统进行基因导入，故该导入系统具有通用性。
3、相对于抗体，SPA的成本很低，且SPA-PLL稳定性很好，易保存，易标准化。
图1为SPA-PLL交联物的洗脱曲线图。
图2为SPA-PLL交联物在200～400nm波长范围内吸收光度图。
图3为非还原型及还原型SPA-PLL交联物的SDS-PAGE电泳图谱。
图4为酶联法检测包被的SPA-PLL交联物(10μg/ml)与多种IgG的结合二抗为HRP标记的山羊抗兔、山羊抗人、山羊抗小鼠或山羊抗牛IgG图。
图5为SPA-PLL交联物结合pEGFP-C1质粒的凝胶移动阻滞实验图。
图6为SPA-PLL交联物结合骨调素反义寡核苷酸的凝胶移动阻滞实验图。
图7为CD44抗体/SPA-PLL/pEGFP-C1复合物处理NRK52E细胞40h后，pEGFP-C1质粒表达绿色荧光蛋白从而在紫外线激发下发出荧光图。
图8为CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物与NRK52E细胞结合的荧光显微镜图(×200)。
图9为CD44抗体靶向的反义、顺义或错义寡核苷酸复合物影响NRK52E细胞骨调素mRNA表达的斑点杂交图。
ADot blot图。B相对积分密度值分析。
图10为不同形式的骨调素AS-ODN影响NRK52E细胞OPNmRNA表达的斑点杂交(CD44/SPA-PLL/AS-ODN#表示细胞经CD44抗体预先处理60 min后再经CD44/SPA-PLL/AS-ODN处理)图。ADot blot图。B相对积分密度值分析。
图11为AS-ODN浓度为30μmol/L的CD44/SPA-PLL/AS-ODN复合物对NRK52E细胞在胶原凝胶表面粘附能力的抑制作用(CD44/SPA-PLL/AS-ODN#表示细胞经CD44抗体预先处理60min后再经CD44/SPA-PLL/AS-ODN处理)图。
图12为不同浓度CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物和SPA-PLL交联物等对NRK52E细胞存活率的影响图。
图13为CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物和SPA-PLL交联物作用不同时间对NRK52E细胞存活率的影响图。
图14为不同浓度CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物和SPA-PLL交联物等对SMMC-7721细胞存活率的影响图。
图15为CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物和SPA-PLL交联物作用不同时间对SMMC-7721细胞存活率的影响图。下面对本发明作较详尽的描述。内容包括SPA-PLL交联物的构建；SPA-PLL交联物的一些理化特性及其与多种IgG抗体，基因片段的结合特性(体现SPA-PLL交联物的核心作用和通用性)；抗体靶向非病毒型基因导入系统的组装及其用于细胞靶向转染的举例说明；SPA-PLL交联物及其基因导入系统的毒性作用。
一、PA-PLL交联物的制备及纯化。
1、主要材料(1)蛋白A(SPA，MW20000 D)，Sigma公司产品；(2)多聚赖氨酸(PLL，MW25700D)，Sigma公司产品；(3)异型双功能交联剂SPDP(3-[2-吡啶乙基]丙酸-N-琥珀酰亚胺酯，N-succinimidy[3-(2-pyridyldithio)proponate])，Sigma公司产品；(4)二硫苏糖醇(DTT)，Roche公司产品；(5)SephadexG50分子筛(fine)，Pharmacia公司产品；(6)透析袋，Serva公司产品。
2、主要方法(1)SPA与PLL的化学交联1)PLL-PDP，SPA-PDP的制备取10mg PLL或SPA用1ml 0.1M的PBS(pH7.5)溶解，置于透析袋中于4℃对0.1M的PBS(pH7.5)透析过夜，取出PLL或SPA按PLL或SPA与SPDP的1∶2摩尔比加入SPDP溶液(无水乙醇溶解，浓度20mM)50ul，缓慢搅拌加入，于室温下作用60min，再次置于透析袋中于4℃对0.1M的PBS(pH7.5)透析过夜，其间换透析液使其充分透析去除未反应的SPDP等小分子物质，获得纯化PLL-PDP或SPA-PDP，于4℃保存。(2)PLL-PDP还原生成PLL-SH将10mg PLL-PDP置于透析袋中于4℃对0.1M醋酸缓冲液(pH4.5)透析过夜，使PLL-PDP的pH值为4.5，取出PLL-PDP加入1M DTT，使DTT终浓度为50mM，于室温下作用30min后转入透析袋中于4℃对0.1M的PBS(pH7.5)透析过夜，获得纯化的PLL-SH。透析期间充入氮气以避免PLL-SH氧化！(3)PLL-SH与SPA-PDP反应生成SPA-PLL交联物将等量PLL-SH与SPA-PDP混合于室温下搅拌22h(期间充入氮气以避免PLL-SH氧化)，获得含有SPA-PLL交联物的混合物。
(2)SPA-PLL交联物的纯化常规方法处理SephadexG50，装层析柱，按下列条件进行层析，收集合并第一峰液体即为纯化SPA-PLL交联物，将合并的液体置于透析袋中用聚乙二醇浓缩至适当体积，过滤除菌，于4℃保存。层析条件检测波长226nm；洗脱液0.1M的PBS(pH7.5)；柱长62cm；柱直径10mm；柱体积50ml；进样量0.9ml(＜2％)；流速≤0.5ml/min；1.5ml/管。
3结果SPA-PDP与PLL-SH反应后的混合物中除SPA-PLL交联物外，还有未反应的SPA-PDP与PLL-SH及其它反应产物，故需将SPA-PLL交联物分离纯化出来。我们采用SephadexG50分子筛分离洗脱，获得3个蛋白峰(参阅图1所示)，首峰应是SPA-PLL交联物。
二，SPA-PLL交联物主要的理化性质1、主要材料(1)30％丙烯酰胺/0.8％亚甲双丙烯酰胺，4×Tris·Cl/SDS(pH8.8)，4×Tris·Cl/SDS(pH6.8)，自配；(2)过硫酸铵(AP)，TEMED(四甲基乙烯基二胺)，Sigma公司产品；(3)3×SDS蛋白加样缓冲液，1×SDS电泳缓冲液，自配；(4)考马斯亮蓝R-250(Coomssia BrilliantR-250)，Sigma公司产品；(5)DTT，同前；(6)BCA-100 proteinQuantitation Kit，上海博彩生物科技有限公司产品。
2、主要方法(1)SPA-PLL交联物的波长扫描将SPA-PLL交联物的PBS(0.1M，pH7.5)溶液于200～400nm波长范围内测定吸收光度(A值)，观察其最大吸收光度。
(2)PA-PLL交联物的浓度测定采用BCA法测定。按BCA-100protein Quantitation Kit说明书进行。大致过程将SolutinA和SolutionB按比例混合成Mix(A+B)液；将标准的牛血清白蛋白(BSA)用0.1M的PBS(pH7.5)稀释成以下不同浓度(μg/ml)50，100，200，400，500；在BSA溶液或SPA-PLL样品中加入Mix(A+B)液，混匀后于37℃保温30min，待液体冷至室温后于波长562nm处测吸收光度(A值)(以0.1M的PBS pH7.5调零)，绘制BSA的标准曲线，从标准曲线计算出SPA-PLL交联物的浓度。
(3)SDS-PAGE电泳按照精编分子生物学实验指南方法进行。大致过程组装凝胶模具，先配制10％的分离胶加入模具中，待胶凝固后在其表面加入5％的层析胶同时放入样品梳以形成样品槽，待胶凝固后上样，于1×SDS电泳缓冲液中电泳(100V，恒压)，待溴酚蓝指示剂接近分离胶底部停止电泳；将凝胶置于考马斯亮蓝R-250染色液中室温振荡3～4h后，在脱色液中脱色，观察结果。样品的处理采用非还原型和还原型方法非还原型法即样品与非还原型的3×SDS蛋白加样缓冲液混合即可；还原型法即样品先经过量的DTT作用10min，再与非还原型的3×SDS蛋白加样缓冲液混合。
3、结果(1)SPA-PLL交联物的最大吸收波长将SPA-PLL交联物在200～400nm波长范围内测定吸收光度(A)，在210nm处有最大光吸收值，这是因为含有大量肽键所致(图2)，并且在280nm处有一小吸收峰，可能是SPA所致。
(2)SPA-PLL交联物的浓度测定采用BCA法建立起蛋白的浓度测定的直线回归方程Y＝0.009783+0.000615x(r＝0.9995)，于562nm波长处比色可知SPA-PLL交联物的平均A562为0.182，经计算可得SPA-PLL交联物的浓度为280μg/ml(3)SPA-PLL交联物的纯度未经还原剂DTT处理的SPA-PLL交联物，SDS PAGE电泳后染色无条带出现(图3)，说明SPA-PLL交联物纯度较高，无游离的SPA等其它组份存在；SPA-PLL交联物经DTT处理后电泳染色，可见在分子量约20000处出现一蛋白条带(栏4)，该蛋白应是SPA，说明SPA是以-S-S-键结合在SPA-PLL交联物中，DTT的处理能使SPA被还原出来。游离SPA是否经DTT还原处理，电泳后染色均在分子量约20000处出现条带，而游离PLL是否经DTT还原处理则电泳染色后均无条带出现(参阅图3所示1、单抗Hab18+DTT2、蛋白分子量marker.3、SPA-PLL交联物.4、SPA-PLL交联物+DTT.5、游离PLL+DTT.6，游离SPA+DTT)。游离PLL及未经DTT处理的SPA-PLL交联物经电泳后染色无条带出现，这可能由于PLL及SPA-PLL交联物带强大正电荷，在从负极向正极的电泳过程中未能泳动而仍停留在加样孔中所致。
结论所制备的SPA-PLL交联物纯度较高，确实由SPA和PLL构成。
三、PA-PLL交联物的结合性质所制备的SPA-PLL交联物应是一种抗体和核酸片段的连接物，也即既能良好结合多种IgG抗体，又能良好结合多种核酸片段或基因片断，从而组装成抗体靶向非病毒型基因导入系统用于细胞的特异性转染。
(一)SPA-PLL交联物结合IgG能力(SPA活性)
1、主要材料(1)SPA，PLL同前；(2)酶标条板NUNC公司产品；(3)包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)，酶联洗涤液(PBST即PBS-Tween20)，自配；(4)正常山羊血清，武汉博士德公司产品；(5)多种IgG兔抗大鼠CD44抗体(IgG)，武汉博士德公司产品；正常兔血清IgG，正常山羊血清IgG，正常人血清IgG，正常小牛血清IgG，均为华美生物工程公司产品；(6)小鼠抗人肝癌单抗HAb18，第四军医大学病理教研室产品；(7)HRP(辣根过氧化物酶)标记的兔抗山羊IgG，HRP标记的山羊抗兔IgG，HRP标记的山羊抗人IgG，HRP标记的山羊抗牛IgG，HRP标记的山羊抗小鼠IgG，均为华美生物工程公司产品；(8)酶联底物(邻苯二胺，OPD)，Sigma公司产品。(9)Dynex-24100，酶标仪，美国生产。
2、主要方法(1)样品的包被按常规酶联包被方法进行。大致过程用包被缓冲液将SPA-PLL交联物或PLL，SPA稀释成终浓度10μg/ml，将稀释的样品加入酶联板中(100μl/孔)于4℃过夜即可。
(2)酶联法检测包被的SPA-PLL交联物与多种IgG的结合按常规酶联方法进行。大致过程取已包被的酶联板去上清，加入酶联洗涤液洗1次；用正常山羊血清(200μl/孔)于37℃封闭60min；同上洗涤3次，加入各自的IgG(100μl/孔)，于37℃孵育45min；同上洗涤3次，加入各自对应的HRP标记的山羊抗IgG二抗(100μl/孔)，同上孵育30min；洗涤液洗涤4次后尽量摔尽孔中余液，加入酶联底物液(100μl/孔)，避光显色10～30min，加入终止液(2N硫酸)终止显色反应，于490nm波长处测吸收光度(A值)，以比值(样品孔A490/空白对照孔A490)大于或等于2.0为阳性。
(3)中和抑制实验按常规中和抑制酶联方法进行。大致过程先将1∶1000稀释的HRP标记的兔抗小鼠IgG与不同浓度的SPA-PLL交联物混合于4℃过夜；取SPA包被的酶联板去上清，同上封闭，洗涤，加入以上混合物，同上孵育，洗涤，加入酶联底物液显色，测定A490，观察结果。
3、结果用SPA-PLL交联物或SPA或PLL包被酶联板，兔抗大鼠CD44抗体(IgG)，正常兔血清IgG，正常人血清IgG及小鼠单抗(HAb18)均能与包被的SPA-PLL交联物或SPA结合，且具有IgG浓度依赖性，不与包被的PLL结合；而正常山羊IgG，牛IgG与包被的SPA-PLL结合阴性(参阅图4所示，表1)，表现为其A490仅为0.3左右，与培养基对照孔(均值0.28)接近，提示SPA-PLL交联物可与多种IgG抗体良好结合，但与山羊，牛等一些动物来源的IgG抗体不结合；用SPA包被酶联板，SPA-PLL交联物预先处理能抑制HRP标记的兔抗小鼠IgG与包被的SPA的结合，且具有SPA-PLL浓度依赖性(表2)，提示SPA-PLL交联物与IgG结合具有SPA特异性。这些结果表明，SPA-PLL交联物能良好地结合多种IgG抗体，保持较好的SPA活性，交联过程对SPA的结合特性无明显影响。
表1酶联法检测HRP标记的兔IgG与包被的SPA-PLL交联物等结合包被物 A492(X±SD)SPA-PLL交联物1.022±0.15游离PLL 0.117±0.01游离SPA 1.607±0.22表2酶联法检测SPA-PLL交联物抑制HRP标记的兔IgG与包被SPA的结合
SPA-PLL交联物(μg/m1) A492(X±SD)0 3.287±0.223501.274±0.156100 0.579±0.122200 0.224±0.116结论SPA-PLL交联物具有结合多种IgG抗体的活性(二)SPA-PLL交联物结合核酸片断的能力(PLL活性)质粒和寡核苷酸是常用于基因转染的核酸片断，SPA-PLL交联物均能良好地结合质粒或寡核苷酸SPA-PLL交联物与质粒结合1、主要材料(1)绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-C1)，按常规细菌转化实验将pEGFP-C1质粒转化感受态TG1细菌，筛选，扩增质粒，采用Qiagenplasmid mega kit质粒提取纯化试剂盒提取pEGFP-C1质粒，紫外分光光度法测定质粒DNA含量；(2)HEPES平衡盐溶液(HEPES BanlancedSolution，HBS)，自配；(3)电泳缓冲液(0.5×TBE)，自配；(4)DNA上样缓冲液(6×)，华美生物工程公司产品；(5)DNA分子量Marker(221～4058bp)，上海博彩生物科技有限公司产品。
2、主要方法(1)SPA-PLL/pEGFP-C1质粒复合物制备将pEGFP-C1质粒用HEPES平衡盐溶液稀释成浓度0.125μg/μl，取5μl与不同浓度等体积SPA-PLL交联物混合，于室温下作用60min即制备成SPA-PLL/pEGFP-C1质粒复合物；(2)质粒DNA凝胶阻滞实验参照文献方法进行。具体步骤制备1％的琼脂糖凝胶，将凝胶置于电泳缓冲液中，在样品孔中加入SPA-PLL/pEGFP-C1质粒复合物，DNA分子量Marker等，于70V恒压下电泳，待溴酚蓝指示剂迁移至离加样孔4cm左右时停止电泳，于320nm紫外线处观察，凝胶成像系统中成像。
3、结果pEGFP-C1质粒分子量约4.7kb左右，经琼脂糖凝胶电泳时有多种条带出现，这是由于pEGFP-C1质粒存在多种构型所致；当280μg/ml，140μg/ml的SPA-PLL交联物与等体积pEGFP-C1质粒混合后电泳，无pEGFP-C1质粒条带出现；当70μg/ml的SPA-PLL交联物与等体积pEGFP-C1质粒混合后电泳，有部分质粒条带出现；200μg/ml的游离PLL与等体积pEGFP-C1质粒混合后电泳，无pEGFP-C1质粒条带出现；1000μg/ml游离SPA与等体积pEGFP-C1质粒混合后电泳，有pEGFP-C1质粒条带出现[参阅图5所示1DNAmarker；2游离pEGFP质粒；3pEGFP质粒+SPA-PLL交联物(280μg/ml)；4pEGFP质粒+SPA-PLL交联物(140μg/ml)；5pEGFP质粒+SPA-PLL交联物(70μg/ml)；6pEGFP质粒+游离PLL(200μg/ml)；7pEGFP质粒+游离SPA(1000μg/ml)]。
这些结果表明，带正电荷的SPA-PLL交联物及游离PLL均能很好地中和带负电荷的质粒的负电荷，形成电中性或带正电荷的SPA-PLL/pEGFP-C1质粒复合物，从而仍存在于加样孔中不能在电场中的移动，且这种电荷中和作用具有SPA-PLL交联物浓度依赖性，显示SPA-PLL交联物具有良好地结合质粒的能力，保持较好的PLL活性，交联过程对PLL的结合特性无明显影响。
结论SPA-PLL交联物具有良好地结合质粒的能力SPA-PLL交联物与寡核苷酸片段的结合1、主要材料(1)大鼠骨调素(osteopontin，OPN)反义寡核苷酸(AS-ODN)，其碱基序列与OPN mRNA上游部分(含起始密码)碱基互补，序列为5‘AAC CAC TGC CAG TCT CAT 3‘，所有碱基均经硫代修饰，由上海Sangon公司经亚磷酰胺法合成，PAGE纯化，紫外分光光度法定量。(2)HEPES平衡盐溶液，自配；(3)电泳缓冲液(1×TBE)，自配；(4)DNA上样缓冲液(6×)，华美生物工程公司产品；(5)DNA分子量Marker(100～1500bp)，上海博彩生物科技有限公司产品。
2、主要方法(1)SPA-PLL/AS-ODN复合物制备将AS-ODN用HEPES平衡盐溶液稀释成浓度0.58μg/μl，取5μl与不同浓度等体积SPA-PLL交联物混合，于室温下作用60min即制备成SPA-PLL/AS-ODN复合物；(2)制备2％的琼脂糖凝胶，在样品孔中加入SPA-PLL/AS-ODN复合物，DNA分子量Marker等，用1×TBE为电泳缓冲液，于70V恒压下电泳15min，立即于320nm紫外线处观察，凝胶成像系统中成像。
3、结果AS-ODN含18个核苷酸，分子量很小，在2％琼脂糖凝胶电泳中泳动速度较快，且易扩散，故电泳时间应很短；SPA-PLL交联物能抑制AS-ODN的泳动，且具有浓度依赖性，游离PLL(200μg/ml)及较高浓度(280μg/ml，140μg/ml)SPA-PLL交联物能完全抑制AS-ODN的泳动[参阅图6所示1DNA marker；2游离AS-ODN；3AS-ODN+PLL(200μg/ml)；4AS-ODN+SPA-PLL交联物(280μg/ml)；5AS-ODN+SPA-PL交联物L(140μg/ml)；6AS-ODN+SPA-PLL交联物(70μg/ml)；7AS-ODN+SPA-PLL交联物(35μg/ml)；8AS-ODN+SPA-PLL交联物(17.5μg/ml)；7AS-ODN+SPA(1000μg/ml))]，而游离SPA无抑制作用，提示SPA-PLL交联物具有良好地结合寡核苷酸片断能力，该能力由PLL而非SPA赋予。
结论SPA-PLL交联物具有良好地结合寡核苷酸片断的能力四、抗体靶向非病毒型基因导入系统的组装及应用举例SPA-PLL交联物显示出既可良好地结合多种IgG又可良好结合质粒和寡核苷酸片段的特性即该复合物与IgG抗体和核酸片断结合即可组装成抗体靶向非病毒型基因导入系统，该组装也即SPA-PLL交联物与IgG抗体和预导入的基因的结合过程极其简便，且为非共价结合，即将SPA-PLL交联物与IgG抗体和预导入的基因混合，在室温下静置30～60分钟即可。下面列举实例说明几种抗体靶向非病毒型基因导入系统的组装及靶向转染细胞情况。
大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)细胞在细胞因子EGF作用下能表达CD44分子及骨调素(osteopontin，OPN)，将能识别NRK52E细胞表面受体CD44的抗体为配体，通过SPA-PLL交联物的非共价结合，与绿色荧光蛋白质粒或骨调素反义寡核苷酸组装抗体靶向非病毒型基因导入系统(CD44抗体/SPA-PLL/pEGFP-C1或CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN)，期望该导入系统能特异性或靶向性将绿色荧光蛋白质粒或骨调素反义寡核苷酸导入大鼠肾小管上皮细胞中并使核酸片断发挥作用。
(一)将绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-C1)靶向导入表达CD44分子的大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)细胞中CD44抗体靶向的绿色荧光蛋白质粒导入系统的组装1、主要材料(1)HEPES平衡盐溶液，自配；(2)绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-C1)，本室纯化；(3)兔抗大鼠CD44抗体(IgG)，武汉博士德公司产品；(4)SPA-PLL交联物，同前制备。
2、主要方法(1)SPA-PLL交联物与pEGFP-C1质粒结合的适宜质量比的确定同上采用质粒DNA凝胶阻滞实验，可得SPA-PLL交联物与pEGFP-C1质粒适宜质量比1∶0.89。
(2)SPA-PLL交联物与CD44抗体结合的适宜质量比的确定按常规中和抑制酶联方法进行。大致过程一定浓度的兔抗大鼠CD44抗体(20μg/ml)与不同浓度的SPA-PLL交联物混合于4℃过夜；取SPA包被的酶联板去上清，同上节法封闭，洗涤，加入SPA-PLL/CD44抗体混合物，同上节孵育，洗涤，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗(100μl/孔)，同上孵育30min；洗涤液洗涤4次后尽量摔尽孔中余液，加入酶联底物液显色，测定A490，按下式计算SPA-PLL交联物抑制CD44抗体与包被SPA结合的抑制率。以达到最大抑制率时所需最小的SPA-PLL交联物的量与CD44抗体的质量比即为SPA-PLL交联物与抗体适宜质量比。
抑制率＝(1-实验孔A490/对照孔A490)×100％(实验孔指在固定浓度CD44抗体中混合0～200μg/ml浓度的SPA-PLL交联物；对照孔指在固定浓度CD44抗体中混合PBS)。经计算可得SPA-PLL交联物与CD44抗体结合的合适质量比1∶0.5。
(3)CD44/SPA-PLL/pEGFP-C1质粒复合物即CD44抗体靶向的绿色荧光蛋白质粒导入系统的组装将SPA-PLL交联物，质粒pEGFP-C1分别用HEPES平衡盐溶液溶解，按SPA-PLL交联物与pEGFP-C1质粒适宜质量比1∶0.89混合，室温静置60min；按SPA-PLL交联物与抗体适宜质量比1∶0.5再将该混合物与抗体混合，室温静置60min即获得CD44抗体/SPA-PLL/pEGFP-C1复合物，过滤。
结论将SPA-PLL交联物与CD44抗体和pEGFP-C1质粒混合，于室温下分别静置60min即组装成CD44抗体靶向的绿色荧光蛋白质粒导入系统，组装过程简单方便，为非共价结合。
CD44抗体靶向的绿色荧光蛋白质粒导入系统靶向转染表达CD44分子的大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)细胞1、主要材料(1)CD44/SPA-PLL/PEGFP-C1质粒复合物，同上制备；(2)绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-C1)，本室纯化；(3)兔抗大鼠CD44抗体(IgG)，同上；(4)RPMI1640培养基，Gibco公司产品；(5)小牛血清，杭州四季青公司产品；(6)小鼠表皮生长因子(EGF)，Gibco公司产品；(7)6孔细胞培养板，Corning Costar公司产品；(8)大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)，本室提供。
2、主要方法(1)细胞的培养将NRK52E细胞用胰蛋白酶-EDTA消化下来，计数后加入直径35cm的6孔板中(5×105/孔)，用含EGF(0.5μg/ml)的10％小牛血清的1640培养基培养至细胞密度为60～70％的融合度。
(2)细胞转染实验将细胞去上清分别加入下列复合物CD44/SPA-PLL/pEGFP-C1质粒复合物，SPA-PLL/pEGFP-C1质粒复合物，游离pEGFP-C1质粒，CD44抗体+pEGFP-C1质粒混合物，同时设置含EGF(0.5μg/ml)的10％小牛血清的1640培养基对照。这些复合物或混合物均用含EGF(0.5μg/ml)的10％小牛血清的1640培养基稀释，其中pEGFP-C1质粒量均为2.5μg/ml，于37℃，5％CO2条件下培养16h，用无血清1640培养基洗涤2次后换含10％小牛血清的1640培养基，继续培养24h，用PBS洗涤后于荧光显微镜下观察GFP蛋白的表达和在细胞中的定位。同时先将细胞预先经CD44抗体(50μg/ml)于4℃孵育60min，再加入CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物，再按上述方法进行实验以观察该复合物转染的特异性。
3、结果CD44抗体/SPA-PLL/pEGFP-C1复合物处理细胞40h后，荧光显微镜下观察可见部分细胞发出绿色荧光，且荧光主要分布于细胞核中(参阅图7所示)，表明pEGFP-C1质粒转染进入细胞核内，并进行了有效的转录，翻译生成了绿色荧光蛋白从而在紫外线激发下发出荧光；然而游离pEGFP-C1质粒，SPA-PLL/pEGFP-C1复合物或CD44抗体+pEGFP-C1质粒的混合物处理细胞40h，未观察到细胞绿色荧光阳性(表3)，提示CD44抗体/SPA-PLL/pEGFP-C1复合物转染细胞的有效性。将NRK52E细胞预先经CD44抗体(50ug/ml)于4℃孵育60min，再加入CD44抗体/SPA-PLL/pEGFP-C1复合物处理细胞40h观察，则未观察到细胞绿色荧光阳性，表明CD44抗体能阻断该复合物与细胞的结合，提示CD44抗体/SPA-PLL/pEGFP-C1复合物转染细胞具特异性或靶向性。
表3pEGFP-C1质粒的不同形式转染NRK52E细胞40h后表达绿色荧光蛋白的情况pEGFP-C1形式 荧光CD44抗体/SPA-PLL/pEGFP-C1 +SPA-PLL/pEGFP-C1 -游离pEGFP-C1 -CD44抗体+pEGFP-C1 -完全1640培养基 -结论CD44抗体靶向的绿色荧光蛋白质粒导入系统能将绿色荧光蛋白质粒靶向导入大鼠肾小管上皮细胞中，并使该质粒在细胞获得有效表达。
(二)将骨调素反义寡核苷酸靶向导入表达CD44分子的大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)细胞中CD44抗体靶向的反义寡核苷酸导入系统的组装1，主要材料(1)HEPES平衡盐溶液，自配；(2)大鼠骨调素(osteopontin，OPN)反义寡核苷酸(AS-ODN)，同前；(3)兔抗大鼠CD44抗体(IgG)，同前；(4)SPA-PLL复合物，同前制备。
2、主要方法(1)SPA-PLL交联物与AS-ODN结合的适宜质量比的确定同前采用寡核苷酸凝胶阻滞实验，可得SPA-PLL交联物与AS-ODN适宜质量比1∶4.1；(2)SPA-PLL交联物与CD44抗体结合的适宜质量比的测定同前方法测定，SPA-PLL交联物与CD44抗体结合的适宜质量比为1∶0.5；(3)CD44/SPA-PLL/AS-ODN复合物即CD44抗体靶向反义寡核苷酸的导入系统的组装将SPA-PLL交联物，AS-ODN分别用HEPES平衡盐溶液溶解，按SPA-PLL交联物与AS-ODN适宜质量比1∶4.1混合，室温静置60min；按SPA-PLL交联物与抗体适宜质量比1∶0.5再将该混合物与抗体混合，室温静置60min即获得CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物，过滤。
结论将SPA-PLL交联物与CD44抗体和OPN反义寡核苷酸混合，于室温下分别静置60min即组装成CD44抗体靶向的OPN反义寡核苷酸导入系统，组装过程简单方便，为非共价结合。
CD44抗体靶向的反义寡核苷酸导入系统靶向转染表达CD44分子的大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)细胞的观察1、主要材料(1)FAM标记的AS-ODN，5’端经荧光素(FAM)标记，由上海Sangon公司经亚磷酰胺法合成，PAGE纯化，紫外分光光度法定量；(2)CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物，同上制备；(3)SPA-PLL/AS-ODN复合物，自制；(4)兔抗大鼠CD44抗体(IgG)，同上；(5)CD44抗体+AS-ODN混合物；(6)RPMI1640培养基，Gibco公司产品；(7)小牛血清，杭州四季青公司产品；(8)小鼠表皮生长因子(EGF)，Gibco公司产品；(9)6孔细胞培养板，Corning Costar公司产品；(10)大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)，本室提供。
2、主要方法(1)细胞的培养同前；(2)细胞转染实验将细胞去上清分别加入下列复合物CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物，SPA-PLL/AS-ODN复合物，游离AS-ODN，CD44抗体+AS-ODN混合物。同时设置含EGF(0.5ug/ml)的10％小牛血清的1640培养基对照。这些复合物或混合物均用含EGF(0.5ug/ml)的10％小牛血清的1640培养基稀释，其中AS-ODN量均为52μg/ml，于37℃，5％CO2条件下培养2h，用冷PBS洗涤细胞2次后于荧光显微镜下观察。同时先将细胞预先经CD44抗体(50ug/ml)于4℃孵育60min，再加入CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物，再按上述方法进行实验以观察该复合物转染的特异性。
3、结果CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物与NRK52E细胞孵育后能较好地与细胞结合，表现为复合物结合在细胞周围发出黄绿色荧光(参阅图8所示)，而SPA-PLL/AS-ODN复合物，游离AS-ODN，CD44抗体+AS-ODN混合物与细胞孵育2h后经洗涤则未见细胞发出荧光，提示CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物能特异性结合在靶细胞表面；当细胞预先用CD44抗体处理再与CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物孵育则未见该复合物结合在细胞周围，进一步提示CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物能特异性或靶向性结合NRK52E细胞。
结论CD44抗体靶向的OPN反义寡核苷酸导入系统能将OPN反义寡核苷酸靶向导入大鼠肾小管上皮细胞中。CD44抗体靶向的反义寡核苷酸导入系统靶向转染表达大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)细胞对OPN mRNA表达及粘附活性的影响1、主要材料(1)大鼠骨调素(osteopontin，OPN)反义寡核苷酸(AS-ODN)，同前；顺义寡核苷酸(S-ODN)碱基序列5’ATG AGA CTG GCA GTG GTT3’；错义寡核苷酸(MS-ODN)碱基序列5’CTC TCA CAC TAA AGC GTC3’；以上片断所有碱基均经硫代修饰，由上海Sangon公司经亚磷酰胺法合成，PAGE纯化，紫外分光光度法定量；(2)兔抗大鼠CD44抗体(IgG)，同上；(3)CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物，CD44抗体/SPA-PLL/S-ODN复合物，CD44抗体/SPA-PLL/MS-ODN复合物，SPA-PLL/AS-ODN复合物，CD44抗体+AS-ODN混合物均按上述CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物制备方法制备；(4)RPMI1640培养基，Gibco公司产品；(5)小牛血清，杭州四季青公司产品；(6)小鼠表皮生长因子(EGF)，Gibco公司产品；(7)Vitrogen100，Celtrix公司产品(8)6孔细胞培养板，Corning Costar公司产品；(9)大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)，本室提供。
2、主要方法(1)细胞的培养同前；(2)细胞转染实验将细胞去上清分别加入1ml不同浓度的下列复合物(1)CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物(2)CD44抗体/SPA-PLL/S-ODN复合物(3)CD44抗体/SPA-PLL/MS-ODN复合物(4)SPA-PLL/AS-ODN复合物(5)游离AS-ODN(6)CD44抗体+AS-ODN混合物，这些复合物或混合物均用含EGF(0.5μg/ml)的10％小牛血清的1640培养基稀释，同时设置含EGF(0.5ug/ml)的10％小牛血清的1640培养基对照，于37℃，5％CO2条件下培养2h，用无血清1640培养基洗涤3次，再继续培养48h，收集细胞提取总RNA。(3)细胞总RNA的提取按Trizol试剂盒说明书操作，同前。(4)RNA的斑点杂交按“The Dig System User’sGuide for Filter Hybridization”说明书(Boehringer Mannheim公司)操作；(5)胶原凝胶的制备将Vitrogen100与此1×和10×M199培养基混合，使胶原的终浓度为2mg/ml，调pH值为7.4，加入到6孔板中于37℃过夜使胶凝固；(6)细胞粘附实验将经处理的细胞用胰蛋白酶-EDTA消化下来计数(细胞浓度2.5×105/ml)，取200μl加在胶原凝胶表面，于37℃，5％CO2条件下培养，于不同时间点用培养基冲洗凝胶表面计数未贴附的细胞和已贴附的细胞，按下式计算细胞在凝胶中的贴附率(％)。贴附率(％)＝贴附细胞数/加入细胞数×100％3、结果(1)CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物对NRK52E细胞OPN mRNA表达的抑制作用RNA斑点杂交结果表明，当同CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物共培养48h，NRK52E细胞OPN-mRNA水平较低，明显低于未加药物的1640培养基对照，且具有AS-ODN一定的浓度依赖性，其最低抑制浓度为10μmmol/L；而经CD44抗体/SPA-PLL/S-ODN复合物或CD44抗体/SPA-PLL/MS-ODN复合物处理的细胞OPN-mRNA水平仍然较高，即使30μmmol/L浓度也未表现出明显抑制作用(参阅图9所示)，提示AS-ODN能特异性抑制大鼠小管上皮细胞OPN mRNA表达也即AS-ODN具有基因水平的特异性反义抑制作用。如将细胞预先经CD44抗体(50ug/ml)于4℃孵育60min，加入CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物处理，或经SPA-PLL/AS-ODN复合物，CD44抗体+AS-ODN混合物，游离AS-ODN处理则NRK52E细胞OPN-mRNA水平无明显降低(参阅图10所示)，提示CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物对NRK52E细胞OPN mRNA表达的抑制作用也具有细胞特异性或靶向性。CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物对NRK52E细胞OPN mRNA表达具有细胞和基因水平的双重抑制作用。
(2)CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物对NRK52E细胞粘附能力的影响在胶原凝胶板上培养时，经CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物处理的细胞很容易被洗涤下来，而经CD44抗体/SPA-PLL/S-ODN复合物，CD44抗体/SPA-PLL/MS-ODN复合物，SPA-PLL/AS-ODN复合物，CD44抗体+AS-ODN混合物处理的细胞及1640培养基对照处理的细胞仍紧紧地贴附于板上(参阅图11所示)，提示CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物可通过抑制OPN的表达从而在细胞水平，基因水平特异性地抑制NRK52E细胞的粘附功能；当将细胞预先经CD44抗体(50μg/ml)于4℃孵育60min，加入CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物处理，则该细胞不容易被洗涤下来而是较紧密贴附于板上(参阅图11所示)，进一步提示CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合。
结论CD44抗体靶向的OPN反义寡核苷酸导入系统能将OPN反义寡核苷酸靶向导入大鼠肾小管上皮细胞中，该反义寡核苷酸在细胞中发挥出反义抑制作用。
五、抗体靶向非病毒型基因导入系统的毒性作用由于抗体靶向非病毒型基因导入系统能选择性或者说特异性将目的基因导入靶细胞中，让目的基因在细胞中发挥作用，故一般希望该导入系统无或低毒性。该导入系统的关键组成部分是SPA-PLL复合物，因此SPA-PLL复合物毒性大小决定着抗体靶向非病毒型基因导入系统的毒性作用，下面实验以抗体靶向非病毒型基因导入系统(CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN)和SPA-PLL交联物对培养的两种细胞存活率的影响来说明抗体靶向非病毒型基因导入系统对转染细胞的毒性作用。
(一)SPA-PLL交联物和抗体靶向非病毒型基因导入系统(CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN)对大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)的毒性作用1、主要材料(1)CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物，SPA-PLL交联物，SPA，PLL，同前；(2)噻唑蓝(MTT)，Sigma公司产品；(3)二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，Sigma公司产品；(4)大鼠肾小管上皮细胞株(NRK52E)，同前；(5)96孔细胞培养板，公司产品；(6)RPMI1640培养基，Gibco公司产品；(7)小牛血清，杭州四季青公司产品。
2、主要方法(1)细胞的培养同前；(2)，MTT比色分析将NRK52E细胞用胰蛋白酶-EDTA消化下来，计数后加入96孔板(5×104/孔)。待细胞贴壁后加入不同浓度CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物，SPA-PLL交联物，SPA，PLL(每个浓度均作4复孔)，于37℃，5％CO2条件下培养不同时间，加入MTT(5mg/ml，12μg/孔)，继续培养4-8h，吸弃上清，加入DMSO(120μl/孔)，混匀后于570nm波长处测吸收光度(A)，按下式计算细胞存活率存活率＝(实验孔A570/对照孔A570)×100％3、结果(1)不同浓度SPA-PLL交联物及CD44/SPA-PLL/AS-ODN复合物对细胞的毒性作用当与NRK52E细胞共同孵育72h，SPA-PLL交联物和CD44/SPA-PLL/AS-ODN复合物在低浓度范围内(0～62.5μg/ml)对细胞毒性作用较小(细胞存活率＞85％)，在高浓度时(＞125μg/ml)对细胞毒性作用显著增强(参阅图12所示)；游离PLL对细胞的毒性作用明显，且呈浓度依赖性；而游离SPA对细胞无毒性作用，细胞存活良好(＞90％)。
(2)同一浓度SPA-PLL交联物及CD44/SPA-PLL/AS-ODN复合物处理不同时间对细胞的毒性作用浓度为31.3μg/ml的SPA-PLL交联物或CD44/SPA-PLL/AS-ODN复合物处理的细胞存活率较高(＞85％)，无时间依赖性，游离SPA处理对NRK52E细胞无任何毒性作用，然而PLL的处理能明显降低细胞存活率，且具有时间依赖性(参阅图13所示)。
结论抗体靶向非病毒型基因导入系统(CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN)及SPA-PLL交联物对大鼠肾小管上皮细胞在常用浓度内无毒性作用。
(二)SPA-PLL交联物和抗体靶向非病毒型基因导入系统(CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN)对人肝癌SMMC-7721细胞的毒性作用1、主要材料(1)CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物，SPA-PLL交联物，SPA，PLL，同前；(2)噻唑蓝(MTT)，Sigma公司产品；(3)二甲基亚砜(DMSO)，分析纯，Sigma公司产品；(4)人肝癌SMMC-7721细胞株，四川大学基础医学院免疫学教研室惠赠；(5)96孔细胞培养板，Corning Costar公司产品；(6)RPMI1640培养基，Gibco公司产品；(7)小牛血清，杭州四季青公司产品。
2、主要方法(1)细胞的培养同前；(2)，MTT比色分析将SMMC-7721细胞用胰蛋白酶-EDTA消化下来，计数后加入96孔板(5×104/孔)。待细胞贴壁后加入不同浓度CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN复合物，SPA-PLL交联物，SPA，PLL(每个浓度均作4复孔)，于37℃，5％CO2条件下培养不同时间，加入MTT(5mg/ml，12μl/孔)，继续培养4～8h，吸弃上清，加入DMSO(120μl/孔)，混匀后于570nm波长处测吸收光度(A)，按下式计算细胞存活率存活率＝(实验孔A570/对照孔A570)×100％3、结果(1)不同浓度SPA-PLL交联物及CD44/SPA-PLL/AS-ODN复合物对细胞的毒性作用当与SMMC-7721细胞共同孵育72h，SPA-PLL交联物和CD44/SPA-PLL/AS-ODN复合物在低浓度范围内(0～62.5ug/ml)对细胞毒性作用较小(细胞存活率＞85％)，在高浓度时(＞125μg/ml)对细胞毒性作用显著增强(参阅图14所示)；游离PLL对细胞的毒性作用明显，且呈浓度依赖性；而游离SPA细胞无毒性作用，细胞存活良好。
(2)同一浓度SPA-PLL交联物和SPA-PLLCD44/SPA-PLL/AS-ODN复合物处理不同时间对细胞的毒性作用浓度为31.3μg/ml的SPA-PLL交联物或CD44/SPA-PLL/AS-ODN复合物处理的细胞存活率较高(85％以上)，无时间依赖性，游离SPA处理对SMMC-7721细胞无任何毒性作用；然而游离PLL的处理能明显降低细胞存活率，且具有时间依赖性(参阅图15所示)。
结论抗体靶向非病毒型基因导入系统(CD44抗体/SPA-PLL/AS-ODN)及SPA-PLL交联物对人肝癌细胞在常用浓度内无毒性作用。
权利要求
1.一种通用的抗体靶向非病毒型基因导入系统，其特征在于由金黄色葡萄球菌A蛋白与多聚赖氨酸共价结合形成A蛋白-多聚赖氨酸交联物，将该A蛋白-多聚赖氨酸交联物与IgG抗体和质粒或寡核苷酸经混合组装成细胞靶向结合的基因导入系统用于基因转染，该基因导入系统为非病毒导入系统。
全文摘要
本发明公开了一种通用的抗体靶向非病毒型基因导入系统。该基因导入系统由三部分构成IgG抗体，蛋白A－多聚赖氨酸交联物(SPA－PLL)和预导入的核酸片段(包括基因)，其中核心部分为SPA－PLL交联物，SPA－PLL交联物能与多种IgG抗体及多种预导入的核酸片段经过混合即可组装成多种不同的抗体靶向非病毒型基因导入系统，故该系统具有通用性；该基因导入系统具有良好的细胞靶向性或特异性。
文档编号C12N15/87GK1478898SQ03126650
公开日2004年3月3日 申请日期2003年5月23日 优先权日2003年5月23日
发明者刘晓波, 余学清 申请人:中山大学附属第一医院