专利名称：重组人γ－干扰素腺病毒以及该产物的制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及通过基因重组获得的重组人γ-干扰素腺病毒的制备及应用。具体说，本发明涉及腺病毒载体，干扰素蛋白、两者通过重组结合的基因工程产物以及该产物的制备方法和在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术：
干扰素是体内产生的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的蛋白，其中，γ-干扰素有以下生物学效应①γ-干扰素是具有促炎作用的细胞因子，由Th1细胞和NK细胞分泌，可诱导机体非特异性的免疫，保护机体免受病毒感染；②γ-干扰素与机体内细胞因子网络相互作用显著，可诱导细胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α、IL-8、MCP-1等细胞因子，并可上调TNF、淋巴毒素(lymphotoxin，LT)和IL-1等细胞因子的受体，从而增强了其促炎作用。
③γ-干扰素可使巨嗜细胞和中性粒细胞上Fc受体表达增加，使多种组织细胞II类MHC表达增加，从而增强这些细胞的吞噬活性和抗原递呈能力。
④γ-干扰素可刺激巨嗜细胞内活性氧和活性氮的产生，增强细胞内杀菌和杀寄生虫活性。
⑤γ-干扰素能够抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞株的分化；诱导细胞膜表达I类和II类MHC抗原，γ-干扰素同时也上调某些肿瘤相关抗原，因此IFN-γ对于抗肿瘤也有一定的作用。
但是目前应用于临床的γ-干扰素是重组技术生产的蛋白产品，性质不稳定，容易失活。
另外，腺病毒是一种无包膜的DNA病毒，共包含49个血清型，并根据其凝血特性分为A-F6个亚类，其中C亚类的2型和5型腺病毒(Ad2和Ad5)在人体内基本不致病，因此适合作为基因转移的载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗病毒作用的基因工程药物-重组人γ-干扰素腺病毒以及其制备方法，并揭示它在制备抗病毒药物中的应用。
重组人γ-干扰素腺病毒(Ad-rhIFNγ)，包含有分泌型人γ-干扰素目的基因和缺陷腺病毒。缺陷型腺病毒为C亚类的5型腺病毒(Ad5)。
Ad-hIFN-γ结构重组人γ-干扰素腺病毒载体缺失了E1区(E1Δ)，也可同时缺失部分E3区(partiteE3Δ)，人γ-干扰素蛋白基因为目的基因，将表达分泌型人γ-干扰素的表达盒插入E1区，目的基因表达盒由巨细胞病毒(CMV)启动子、人γ-干扰素基因和下游polyA信号组成。
其中γ-干扰素的序列为1201 12601261 13201321 13801381 14401441 15001501 15601561 16201621 16801681 1740重组人γ-干扰素腺病毒生产工艺流程包括质粒的构建、转染细菌、感染293细胞、分离纯化等。
本发明物是一种液体制剂，碱性，PH7.5～8.0，无色透明或呈乳白色，可跟水与任何比例混合，无味，可作针剂、喷剂或冻干为干粉。
本发明是利用复制缺陷型腺病毒载体将γ-干扰素引入机体组织细胞，使患者自身变成一个生产γ-干扰素的“工厂”。这种方法能够克服蛋白不稳定、半衰期短、活性低、成本高等缺点，保持蛋白质二级及空间结构的自然特性，使得这一疗法成为大多数患者能够接受并有能力支付的治疗途径。利用缺陷型腺病毒作为载体，具有其它病毒载体不可比的优点
①腺病毒载体转染率高、可操作性好，可制备高效价的病毒颗粒，宿主范围广，安全性好，致病性低的优点；引起的免疫反应弱。外源基因表达稳定持久。
②由CMV启动子控制γ-干扰素高效表达，调节机体的免疫系统。
③由病毒载体将γ-干扰素基因导入靶组织中表达，产物折叠率，磷酸化，糖基化都会明显优于原核细胞表达之产物，具有较高的生物活性，直接在感染局部充分发挥其抗病毒作用。
四
图1是重组人γ-干扰素腺病毒结构图；图2是重组人γ-干扰素腺病毒生产工艺流程图；图3是重组人γ-干扰素腺病毒抗病毒实验(细胞病变抑制实验Ad-IFN)坐标图；图4是重组人γ-干扰素腺病毒抗病毒实验(VCV病毒攻击C6细胞)照片；图5是重组人γ-干扰素腺病毒抗病毒实验(用CVC病毒攻击C6细胞时加入重组人γ-干扰素腺病毒作保护)。
五具体实施例方式
下面结合附图和具体实施例详细描述本发明。
实施例1重组人γ-干扰素腺病毒(Ad-rhIFNγ)，包含有分泌型人γ-干扰素目的基因和缺陷腺病毒。缺陷型腺病毒为C亚类的5型腺病毒(Ad5)。
Ad-hIFN-γ结构重组人γ-干扰素腺病毒载体缺失了E1区(E1Δ)，也可同时缺失部分E3区(partiteE3Δ)，人γ-干扰素蛋白基因为目的基因，将表达分泌型人γ-干扰素的表达盒插入E1区，目的基因表达盒由据悉胞病毒(CMV)启动子、人γ-干扰素基因和下游polyA信号组成(见图1)。
实施例2重组人γ-干扰素腺病毒的制备重组人γ-干扰素腺病毒生产工艺流程包括质粒的构建、转染细菌、感染293细胞、分离纯化等。具体见其生产工艺流程图(见图2)。
实施例3重组人γ-干扰素腺病毒目的基因的表达检测1.接种C6细胞到96孔板，2×104/孔。
2.24小时后，接种Ad-hIFN-γ，方法用1640培养液按4倍稀释病毒原液，接种时先将96孔板中培养液吸出弃去，PBS清洗孔一遍后，加入不同稀释度的病毒液，每一个稀释度加6个孔，50μL/孔。同时以1640培养液(不含病毒)为阴性对照。37℃，5％CO2，饱和湿度条件下孵育1小时后，加入含5％新生牛血清的1640培养液，200μL/孔，37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养。
3.此后每隔24小时收集每个稀释度的2个孔中的细胞上清液，-80℃保存，连续搜集3次。
4.按照人IFN-γELISA试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)说明书操作，测定各稀释度细胞上清液中人IFN-γ浓度。
实施例4重组人γ-干扰素腺病毒抗病毒试验1.接种C6细胞到96孔板，2×104/孔。
2.24小时后，接种Ad-hIFN-γ，方法用1640培养液按4倍稀释病毒原液，接种时先将96孔板中培养液吸出弃去，PBS清洗孔一遍后，加入不同稀释度的病毒液，每一个稀释度加5个孔，50μL/孔。同时以1640培养液(不含病毒)为阴性对照。37℃，5％CO2，饱和湿度条件下孵育1小时后，加入含5％新生牛血清的1640培养液，200μL/孔，37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养。
3.24小时后，接种滤泡性口炎病毒(VSV)，方法1640培养液稀释VSV至100TCID50，接种时先将96孔板中培养液吸出弃去，PBS清洗孔一遍后，加入不同稀释度的病毒液，每一个稀释度加5个孔，50μL/孔。同时以1640培养液(不含病毒)为阴性对照。37℃，5％CO2，饱和湿度条件下孵育1小时后，加入含5％新生牛血清的1640培养液，200μL/孔，37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养。
4.此后每隔12到24小时观察并记录细胞病变情况，将细胞病变程度评分，“0”表示无明显细胞病变，“1”表示约25％的细胞发生病变，“2”表示细胞病变在50％左右，“3”表示细胞病变在75％左右，“4”表示100％细胞病变。
计算结果时各稀释度的每孔细胞病变评分相加，得出细胞病变指数，并以4倍稀释的指数(log4)为横座标，细胞病变指数为纵坐标。作图(见图3)。
附实验结果照片(见图4、图5)。
权利要求
1.一种重组人γ-干扰素腺病毒(Ad-rhIFNγ)，包含有分泌型人γ-干扰素目的基因和缺陷腺病毒。
2.根据权利要求1所述重组人γ-干扰素腺病毒，其特征在于分泌型人γ-干扰素目的基因表达盒由据悉胞病毒(CMV)启动子、人γ-干扰素基因和下游polyA信号组成。
3.根据权利要求1或2所述重组人γ-干扰素腺病毒，其特征在于缺陷型腺病毒为C亚类的5型腺病毒(Ad5)。
4.根据权利要求1或2所述重组人γ-干扰素腺病毒，其特征在于腺病毒载体缺失了E1区(E1Δ)。
5.根据权利要求1或2所述重组人γ-干扰素腺病毒，其特征在于腺病毒载体缺失了E1区(E1Δ)和部分E3区(partiteE3Δ)。
6.重组人γ-干扰素腺病毒的制备方法，包括(1)质粒的构建；(2)转染细菌；(3)感染293细胞；(4)分离纯化。
7.重组人γ-干扰素腺病毒在制备抗病毒药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种通过基因重组技术获得的带有人γ－干扰素基因的重组腺病毒、其制备方法以及用作抗病毒药物和肿瘤治疗药物的作用。本发明是以腺病毒作为载体，通过基因重组技术使γ－干扰素蛋白片段与腺病毒发生重组，形成稳定的重组人γ－干扰素腺病毒，利用复制缺陷型腺病毒载体将γ－干扰素引入机体组织细胞使人γ－干扰素蛋白能在体内较稳定地表达。初步研究结果表明，重组人γ－干扰素腺病毒具有明显的抗病毒作用。
文档编号C12N7/01GK1552850SQ0312670
公开日2004年12月8日 申请日期2003年5月29日 优先权日2003年5月29日
发明者黄文林 申请人:黄文林