专利名称：一种新型表皮生长因子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人源表皮生长因子的突变体及其用途。
背景技术：
表皮生长因子是1962年Cohen和Montalcini教授在小鼠颌下腺中发现的一种热稳定蛋白，其具有促使新生小鼠眼睑早开、牙齿早萌的作用。将这一活性成分加入培养皮肤表皮的基质中，发现它可直接促进皮肤表皮的生长，因此，将这一活性组分命名为“表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)。人源表皮生长因子(hEGF)是由53个氨基酸残基组成的单链多肽。人源表皮生长因子因其对消化道溃疡、皮肤烧伤、创伤愈合等诸多方面均具有较强的药理学作用而倍受关注。自从1986年阐明了其核苷酸序列以来，分别在大肠杆菌、枯草杆菌和酵母菌中得到了成功表达。但是人源表皮生长因子的表达生产多数以包涵体形式表达，而包涵体形式的表皮生长因子不具有生物学活性，只有通过变性复性等方法获得可溶性蛋白。包涵体的变性复性非常复杂，效率极低，有些又不能完全复性，导致复性后的人表皮生长因子的生物学活性较低，严重制约了生物制药业的发展。
发明内容
包涵体的形成原因有多种，主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的，其中二硫键错配可能是原因之一。正常的人源表皮生长因子(hEGF)分子内含有六个半胱氨酸，形成三个链内二硫键，并且三个二硫键的位 置固定，增加了形成包涵体的几率。为了解决人表皮生长因子主要以包涵体的形式表达这一技术问题，本发明利用将人源表皮生长因子的半胱氨酸进行突变，获得了可溶表达的突变的人源表皮生长因子及其核苷酸序列。本发明一方面提供了突变的人源表皮生长因子，其特征在于人源表皮生长因子的半胱氨酸被丝氨酸取代(命名mu- )，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明另一方面提供了突变的人源表皮生长因子，其特征在于人源表皮生长因子的半胱氨酸被丙氨酸取代(命名mu-2)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。本发明另一方面提供了突变的人源表皮生长因子，其特征在于人源表皮生长因子的半胱氨酸被完全去除(命名mu-3)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。利用生物工程技术，对上述本发明的突变的人源表皮生长因子蛋白进行表达，结果发现，mu- 表达蛋白形成大量的包涵体，但生物活性良好；mu-2和mu-3完全可溶。生物学活性好。本发明的另一方面还提供了编码本发明的人源表皮生长因子的核苷酸序列。优选地，编码本发明的人源表皮生长因子的核苷酸序列包含:a) SEQ ID N0.2、4或6中所示的核苷酸序列；
b)在严紧条件下与由SEQ ID N0.2、4或6的核苷酸序列进行杂交、且编码具有本发明的突变的人源表皮生长因子活性的氨基酸序列的多核苷酸；或c)上述a)或b)的互补序列。本文中，具有本发明的突变的人源表皮生长因子活性是指某一蛋白质或氨基酸序列的活性是SEQ ID N0.1、3或5的10%以上、20%以上、40%以上、60%以上、80%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、或100%或更高。本文所述的“严紧条件”，可以为低严紧条件、中严紧条件、高严紧条件中的任一种，优选为高严紧条件。示例性地，“低严紧条件”可为30°C、5 X SSC、5 X Denhardt液、
0.5%SDS、52% 甲酰胺的条件；“中严紧条件”可为 40°C、5XSSC、5XDenhardt 液、0.5%SDS、52%甲酰胺的条件；“高严紧条件”可为50°C、5XSSC、5XDenhardt液、0.5%SDS、52%甲酰胺的条件。本领域技术人员应当理解温度越高越能得到高同源性的多核苷酸。另外，本领域技术人员可以选择影响杂交的严紧度的温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个因素形成的综合结果来实现相应的的严紧度。
除此之外可杂交的多核苷酸还可以为，通过FASTA、BLAST等同源性检索软件用系统设定的默认参数进行计算时，与编码序列号6的多核苷酸具有约60%或以上、约70%或以上、71%或以上、72%或以上、73%或以上、74%或以上、75%或以上、76%或以上、77%或以上、78%或以上、79%或以上、80%或以上、81%或以上、82%或以上、83%或以上、84%或以上、85%或以上、86%或以上、87%或以上、88%或以上、89%或以上、90%或以上、91%或以上、92%或以上、93%或以上、94%或以上、95%或以上、96%或以上、97%或以上、98%或以上、99%或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3%或以上、99.4%或以上、99.5%或以上、99.6%或以上、99.7%或以上、99.8%或以上、或99.9%或以上同一性的多核苷酸。本发明还提供了包含本发明的核苷酸序列的载体，例如质粒载体。本发明还提供了导入本发明所述的载体的微生物，例如大肠杆菌和酵母。本发明还提供了制备本发明所述的突变的人源表皮生长因子的方法，其包括培养本发明所述的微生物。本发明的再一方面提供了一种药物组合物或药物制剂，其包含本发明的突变的人源表皮生长因子或其核苷酸序列。优选地，其进一步含有选自如下的辅料:粘合剂、崩解齐IJ、稀释剂、润滑剂、助流剂、乳化-增溶剂、甜味剂、包衣材料和抗菌防腐剂，例如磺丁基-β-环糊精和聚乙二醇。对于本发明的药物组合物或药物制剂，其可用于治疗神经退行性疾病，如阿尔兹海默病、帕金森氏综合症及黑质退行性病变等。另外，本发明的药物组合物或药物制剂可用于促进细胞增殖。本发明的又一方面提供了本发明的人源表皮生长因子及其核苷酸序列在制备用于神经退行性疾病(如阿尔兹海默病、帕金森氏综合症、黑质退行性病变)的药物组合物或药物制剂中的用途。另外，本发明的人源表皮生长因子及其核苷酸序可用于制备促进细胞增殖的药物组合物或药物制剂。对于本发明的药物组合物或药物制剂，其可通过注射、舌下含服、肺吸入、鼻粘膜及肛栓或皮肤吸收、滴眼液等多种方式进行施用。其施用剂量优选地为30mg本发明突变的人源表皮生长因子/kg体重-35mg本发明突变的人源表皮生长因子/kg体重。
图1.hEGF及其突变体(mu-1、mu-2和mu_3)载体构建图。图2.hEGF及其突变体诱导表达的SDS-PAGE图，其中:1.空菌全菌蛋白对照；2、3分别是hEGF沉淀和上清；4、5分别是mu- 沉淀和上清；6、7分别是mu_2沉淀和上清；8、9分别是mu_3沉淀和上清；M为蛋白标记(Protein Marker)。图3.hEGF及其突变体的蛋白质印迹检测，其中:1是阴性对照；2、3是hEGF沉淀和上清；4、5是mu- 沉淀和上清；6、7是mu_2沉淀和上清；8、9是mu_3沉淀和上清。下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受下述实施例的限制。实施例1:载体构建
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各突变体基因由上海生工公司合成，具体序列如SEQ ID NO:2、4和6所示。将人工合成的突变体基因构建于PET28 Ca)+载体的NcoI和XhoI限制性内切酶位点之间，构建如图1。为了大量和可溶性表达，SEQ ID NO:2、4和6所示的核苷酸序列是根据大肠杆菌偏爱性密码子而优化的基因序列，且其中的半胱氨酸密码子分别用丝氨酸密码子和丙氨酸密码子取代。另外去掉半胱氨酸的突变体构建在PET28 Ca)+载体的NcoI和XhoI之间，起始端利用NcoI酶切位点的ATG起始密码子序列，为了不移码在其切点后加入GT碱基，后面是目的基因序列，目的基因序列后加终止密码子TAA。实施例2:表达条件将构建好的质粒转化DH5a宿主菌进行扩增，提取质粒并转化BL21 (ED3)Escherichia coli,测序正确后进行诱导表达。表达条件:(I)转数200r/min ; (2)温度，25、30、37°C ；(3) IPTG 浓度，0.1,0.2,0.5、lmmol/L ；在各种诱导条件下表达，丝氨酸取代半胱氨酸的蛋白形成大量的包涵体，与hEGF阳性对照相似；而丙氨酸取代半胱氨酸的在任何条件下都可溶表达(不形成包涵体)；去除半胱氨酸的蛋白在任何条件下也可溶表达(不形成包涵体)，见图2。由图可见，空菌全菌蛋白没有相同大小的蛋白带，而hEGF和mu- 在沉淀中都出现了目的带，并且上清中也有目的带(可溶性表达)，而mu-2及mu-3都是可溶性表达，而沉淀中没有目的蛋白。实施例3:表达产物的蛋白质印迹检测为了验证实施例2的表达产物是否是目的蛋白，利用兔抗人hEGF抗体对表达产物进行蛋白质印迹检测。检测结果见图3。由图可见，hEGF和mu- 上清和沉淀中都有目的蛋白表达，并且沉淀中表达量高，而上清中只有极少量表达；而mu_2、mu_3均是上清表达。实施例4:促细胞增殖活性对数生长期的Balb/c3T3细胞用胰蛋白酶消化，加入6孔板，每孔2万细胞，加入
2.5ml培养液，培养24小时，换成含hEGF及其突变体浓度为1.65nM培养液继续培养24小时，吸弃上清，用胰蛋白酶消化，加入培养液冲洗，放入离心管，1000转离心5分钟，弃上清，加入含10%胎牛血清的PBS悬浮细胞，移入1.5111把？管中，再加入70(^1的_20°C的无水乙醇，-20°C冷冻24小时以上，3000rpm离心细胞30秒，吸弃上清，用Iml PBS重新悬浮细胞，再离心洗涤细胞一次，吸弃上清，沉淀细胞用lOOullmg/ml RNase A悬浮，37°C孵育30分钟，再加入400ul50ug/ml PI，置暗处10分钟后上机检测。结果显示各样品与对照组都有显著性促细胞增殖活性(P〈0.05)。表1.hEGF及其突变体的促细胞增殖活性检测(Mean土 SEM，t test, n=3)
权利要求
1.突变的人源表皮生长因子，其包含如下的序列: SEQ ID N0.1、3或5中所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的突变的人源表皮生长因子，其为: SEQ ID N0.1、3或5中所示的氨基酸序列。
3.编码权利要求1或2所述的突变的人源表皮生长因子的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其包含: a)SEQ ID N0.2、4或6中所示的核苷酸序列； b)在严紧条件下与SEQID N0.2、4或6的核苷酸序列进行杂交、且编码具有突变的人源表皮生长因子活性的氨基酸序列的多核苷酸；或 c)上述a)或b)的互补序列。
5.根据权利要求4所述的核苷酸序列，其为: a)SEQ ID N0.2、4或6中所示的核苷酸序列； b)在严紧条件下与SEQID N0.2、4或6的核苷酸序列进行杂交、且编码具有突变的人源表皮生长因子活性的氨基酸序列的多核苷酸；或 c)上述a)或b)的互补序列。
6.表达载体,其包含权利要求3、4或5所述的核苷酸序列，例如质粒载体。
7.导入权利要求6中所述表达载体的微生物(例如大肠杆菌)。
8.制备权利要求1或2中所述的突变的人源表皮生长因子的方法，其包括培养权利要求7所述的微生物。
9.一种药物组合物或药物制剂，其包含权利要求1或2所述的突变的人源表皮生长因子，或包含权利要求3或4所述的核苷酸序列。
10.权利要求1或2所述的突变的人源表皮生长因子在制备用于神经退行性疾病(如阿尔兹海默病、帕金森氏综合症、黑质退行性病变)或促进细胞增殖的药物组合物或药物制剂中的用途。
全文摘要
本发明涉及突变的人源表皮生长因子及其应用。具体而言，本发明涉及三种突变的人源表皮生长因子的蛋白以及含有编码所述蛋白的核苷酸序列的核酸分子。本发明涉及含有上述核酸分子的表达载体。本发明的突变的人源表皮生长因子可治疗病毒感染、特异性杀伤肿瘤细胞以及神经退行性疾病或促进细胞增殖等。
文档编号C12N1/21GK103204920SQ201310154148
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月28日 优先权日2013年4月28日
发明者赵宝全, 李前, 孙曼霁 申请人:中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所