专利名称：胚胎干细胞特异性标志物Glut3及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学及免疫学领域，具体地说，涉及胚胎干细胞特异性标志物Glut3及其应用。
背景技术：
胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells)是指从胚胎内细胞团分离获得的，能在体外长期培养并保持自我更新能力和分化为所有三个胚层细胞潜能的正常二倍体细胞。胚胎干细胞的高度自我更新能力和分化全能性是它区别于其它细胞的重要特征，它的特异性分子标志，对于胚胎干细胞的鉴定、分离以及自我更新和分化机制的研究，有着十分重要的意义。目前常用的胚胎干细胞特异性标志包括转录因子0CT4、NAN0G、REX1等；表面标志物SSEA-l、SSEA-3、TRA-l-60、⑶9等；这些胚胎干细胞标志物相应抗体，已被广泛应用于干细胞检测试剂盒，用于干细胞的鉴定与分离。目前大量研究 结果表明，大部分已应用于检测试剂盒的胚胎干细胞特异性标志物抗体并不是直接从胚胎干细胞获得的，例如SSEA-1、SSEA-4、TRA-1-60等抗体是由畸胎瘤细胞免疫获得的；SSEA-3抗体是从小鼠胚胎免疫获得；0CT4、NAN0G这些转录因子的抗体则直接使用蛋白作为免疫原免疫动物所获得的。而且这些标志物的特异性有一定的局限性:它们在一些成体干细胞、正常组织或癌细胞中也有一定表达，胚胎干细胞特异性的膜表面标志数量更是有限。因此，开发更灵敏、特异性更高的胚胎干细胞鉴定试剂意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的胚胎干细胞特异性标志物Glut3及其应用。为了实现本发明目的，本发明的一种胚胎干细胞特异性标志物Glut3 (葡萄糖转运蛋白3)，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明直接以胚胎干细胞作为免疫原，免疫兔子，分离兔子脾脏细胞，与骨髓瘤细胞融合，筛选出产Glut3兔单克隆抗体的杂交瘤细胞，应用于干细胞的鉴定与分离。本发明提供的Glut3可作为胚胎干细胞功能性鉴定标志物。Glut3兔单克隆抗体识别天然构象表位，除鉴定胚胎干细胞全能性以外，可同时用于检测干细胞活性。本发明还提供胚胎干细胞特异性标志物Glut3在鉴定胚胎干细胞中的应用，用Glut3单克隆抗体或Glut3多克隆抗体通过检测抗原抗体相互作用来鉴定胚胎干细胞。所述Glut3单克隆抗体由杂交瘤细胞株ZJUESRMAB39 (保藏号CGMCC N0.7301)产生。检测抗原抗体相互作用的方法，例如免疫细胞化学法ICC、IHC染色或免疫共沉淀等。还可以通过检测细胞中Glut3基因的表达量来鉴定胚胎干细胞。本发明进一步提供一种胚胎干细胞检测试剂盒，所述试剂盒包含Glut3单克隆抗体和/或Glut3多克隆抗体。所述Glut3单克隆抗体由杂交瘤细胞株ZJUESRMAB39 (保藏号 CGMCC N0.7301)产生。
本发明还提供产Glut3单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJUESRMAB39，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCC N0.7301，保藏日期2013年2月5日。本发明还提供由所述杂交瘤细胞株产生的Glut3单克隆抗体在鉴定胚胎干细胞中的应用。本发明以胚胎干细胞直接作为免疫原，制备的兔单克隆抗体Glut3或Glut3多克隆抗体，作为干细胞鉴定试剂，检测的特异性和灵敏度更高，且可用于胚胎干细胞的分离和活性检测。本发明的胚胎干细胞检测试剂盒除了用于鉴定胚胎干细胞全能性以外，还可同时用于检测干细胞活性，拓展了检测试剂盒的功能。
图1为本发明实施例2中流式数据的统计结果；其中，A、C为阴性抗体对照；B为未分化的mES，D为经10 μ mo I/L at RA诱导分化的mES。图2为本发明实施例2中IP实验结果；其中，A表示细胞经条件I处理后，利用Glut3兔单克隆抗体#39，进行IP实验，无法检测到Glut3蛋白；B表示细胞经条件II处理后，利用Glut3兔单克隆抗体#39，进行IP实验，可检测到Glut3蛋白。图3所示为本发明实施例2中经Glut3兔单抗封闭的mES，克隆大小的变化。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1 Glut3兔单克隆抗体的制备以小鼠胚胎(mES)干细胞作为免疫原，用I X IO8个mES免疫3月龄新西兰大白兔，分离兔子脾脏细胞，与骨髓瘤细胞240E-W2 (购自Epitomics公司)融合，筛选出产生Glut3兔单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJUESRMAB39 (保藏号CGMCC N0.7301)，应用于干细胞的鉴定与分离。实施例2 Glut3作为胚胎干细胞标志物的应用1.lGlut3兔单克隆抗体识别天然构象表位，可用于胚胎干细胞的流式筛选流式数据的统计结果表明Glu3的表达随ES细胞分化显著下降。如图1所示:70%完整的mES可被实施例中制备的Glut3兔单克隆抗体阳性染色，而经10 μ mo I/L at RA (维甲酸)诱导分化的mES细胞只有3%被阳性染色。流式细胞术(FC):无饲养层未分化和经10 μ mo I/L at RA诱导分化的mES细胞被分离成单个细胞；分别与Glut3兔单克隆抗体和阴性对照抗体混合孵育；加入FITC-羊抗兔二抗孵育；PBS洗涤；流式读数观测。IP实验结果如图2所示。其中，A表示细胞经条件I处理后，利用Glut3兔单克隆抗体，进行IP实验，无法检测到Glut3蛋白。B表示细胞经条件II处理后，利用Glut3兔单克隆抗体，进行IP实验，可检测到Glut3蛋白。条件1:Glut3 兔单抗 I μ g 和 50%(w/v)蛋白 A 纤维素凝胶(Protein A-Sepharosebead slurry, GE, USA) 20 μ L 于 4°C过夜孵育；将 2X IO7 个 mES 用细胞裂解液(l%TritonX-100, 50mmol/L Tris-HCl ρΗ7.4，300mmol/L NaCl, 5mmol/L EDTA, lmmol/L PMSF)处理；离心后，上清分成两等分；一份与ProA-Glut3兔单抗凝胶混合,一份与ProA-阴性抗体混合；蛋白 A 凝胶颗粒用洗脱液(0.l%Triton X-100, 50mmoI /T, Tris-HCl pH7.4, 300mmol/LNaCl, 5mmol/L EDTA)清洗，SDS-PAGE 电泳，银染显色。条件I1:向2X107个mES中加入0.05mmol/L EDTA，将其分离成单个细胞，用含有
1μ g Glut3兔单克隆抗体的细胞培养液Iml重悬细胞，于37°C反应lh，细胞用PBS清洗3次，再用细胞裂解液裂解；细胞裂解液经离心后，上清与蛋白A凝胶混合，显色步骤与条件I相同。1.2经Glut3兔单抗封闭的mES，克隆大小和细胞形成率均明显降低向细胞培养液中加入Glut3兔单抗，终浓度为5μ g/mL，37°C，5%C02培养3天，克隆明显减小，如图3.a所示。而向细胞培养液中加入阴性抗体，则不影响细胞增殖，见图3.b，图3.c为正常mES细胞培养，未加入任何抗体。虽然，上文中已经用一·般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.胚胎干细胞特异性标志物Glut3，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.胚胎干细胞特异性标志物Glut3在鉴定胚胎干细胞中的应用，其特征在于，用Glut3单克隆抗体或Glut3多克隆抗体通过检测抗原抗体相互作用来鉴定胚胎干细胞。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述Glut3单克隆抗体的制备方法为:直接以胚胎干细胞作为免疫原，免疫实验动物，分离动物脾脏细胞，与骨髓瘤细胞融合，筛选出产Glut3单克隆抗体的杂交瘤细胞。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，产Glut3单克隆抗体的杂交瘤细胞株为ZJUESRMAB39,保藏号 CGMCC N0.7301
5.根据权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，检测抗原抗体相互作用的方法为免疫细胞化学法ICC、IHC染色或免疫共沉淀。
6.胚胎干细胞特异性标志物Glut3在鉴定胚胎干细胞中的应用，其特征在于，通过检测细胞中Glut3基因的表达量来鉴定胚胎干细胞。
7.胚胎干细胞检测试剂盒，其特征在于，包含Glut3单克隆抗体和/或Glut3多克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述Glut3单克隆抗体由保藏号为CGMCC N0.7301的杂交瘤细胞株ZJUESRMAB39产生。
9.产Glut3单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJUESRMAB39，其保藏号为CGMCCN0.7301。
10.由权利要求9所述杂交瘤细胞株产生的Glut3单克隆抗体在鉴定胚胎干细胞中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种新型的胚胎干细胞特异性标志物Glut3(葡萄糖转运蛋白3)及其应用。本发明以胚胎干细胞直接作为免疫原，制备的Glut3多克隆抗体或兔单克隆抗体Glut3，作为干细胞鉴定试剂，检测的特异性和灵敏度更高，且可用于胚胎干细胞的分离和活性检测。包含Glut3多克隆抗体或兔单克隆抗体Glut3的胚胎干细胞检测试剂盒除了用于鉴定胚胎干细胞全能性以外，还可同时用于检测干细胞活性，拓展了检测试剂盒的功能。
文档编号C12N5/20GK103204918SQ201310153458
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月26日 优先权日2013年3月29日
发明者张铭, 侯倩女, 宋秀丽, 顾斌, 张佳蓉, 谭舟 申请人:杭州华安生物技术有限公司