专利名称：一种鉴定发酵酸面团中细菌菌相组成的方法
技术领域：
本发明涉及微生物菌群构成鉴定领域，尤其涉及一种鉴定发酵酸面团中细菌菌相组成的方法。
背景技术：
传统发酵酸面团，也称为老面、老酵头或面肥，就是上次作馒头留下来的发酵面团，以此作为主要发酵菌种，加入面粉和成面团，过夜发酵，次日在面团中添加面粉和适量碱，和面后成型醒发蒸制馒头。传统发酵酸面团是多种微生物共生的微生态体系，是多种微生物糖化、发酵、酯化的协同作用，组织结构更趋于柔软细腻而富有弹性的口感，而且生成了醇、酯、醛、酚、酸、低分子糖、多肽、氨基酸等多种风味物质。国外面包的酸面团与我国传统发酵剂相似，但国外对于酸面团已经研究了很多年了，而我国传统发酵剂的研究，特别是微生物的研究却非常薄弱。国外对酸面团微生物的研究表明，其菌种组成与地理位置也有着很大的联系，除了起着发酵面团的作用的酵母菌及 霉菌等真菌，另一类主要微生物是乳酸菌，乳酸菌利用可发酵性糖产生乳酸、醋酸、丙酸等有机酸，可与乳酸发酵中产生的醇、醛、酮等物质相互作用，形成多种新的呈味物质；除乳酸菌代谢的主要产物乳酸外，还能形成细菌素和类细菌素等抑菌类物质，可延长产品的货架期；同时还可以产生胞外多糖(EPS)，具有增稠、乳化及胶凝作用，乳酸菌本身对肠道粘膜的吸附，可以起到抗肿瘤，提高免疫的作用。国外研究发现乳酸菌协同酵母发酵生产面包可产生良好的风味、减少抗营养因子、延长产品保质期等。变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术是由Fischer和Lerman在1979年提出并用于检测DNA突变的电泳技术，是利用片段之间GC含量不同，在不同变性浓度梯度下解链程度不同而将不同片段分离开来。DGGE分辨度高于琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，理论上可以检测到单个核苷酸水平的差异，已被广泛的应用于分析环境微生物菌群结构、肠道及口腔中微生物菌群多样性的分析。目前，采用DGGE技术分析我国不同地区发酵酸面团中微生物菌群多样性的研究尚属空白。国外面包的发酵剂即酸面团与我国馒头的老面有相似的制作原理和发酵工艺，但国外研究者已对酸面团中具有代表性的菌种及其特性研究的比较透彻，有些已应用于工业化生产，而我国有丰富的发酵剂资源，但对其认识尚处于初级阶段。因此，迫切需要揭示我国传统发酵酸面团中微生物的菌群结构及其种类，合理开发我国传统发酵食品中微生物资源。本发明中采用α -淀粉酶预处理样品，构建了以DGGE为基础的技术方法，可以针对我国传统发酵酸面团中细菌的菌落组成及微生物鉴定，对开发我国传统发酵食品资源提供参考。
发明内容
本发明提供了一种鉴定发酵酸面团中细菌菌相组成的方法，用于分析发酵酸面团中细菌菌相组成和种类，具有快速简便、特异性好、灵敏度高、准确可靠的特点。一种鉴定发酵酸面团中细菌菌相组成的方法，包括:(I)将发酵酸面团用淀粉酶酶解，得到酶解物；(2)从酶解物中提取细菌总基因组DNA ；(3 )以提取的细菌总基因组DNA为模板，利用带有GC夹子的细菌通用引物341 f-GC与543r进行第一轮PCR扩增；(4)以第一轮PCR扩增后得到的阳性产物为模板，利用细菌通用引物341f与543r进行第二轮PCR扩增；(5 )对第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的产物进行分析，确定发酵酸面团中细菌菌相组成。发酵酸面团可以为传统发酵酸面团，即上次做馒头留下来的发酵面团。传统发酵酸面团中细菌种类多，先对其进行酶解后再进行PCR反应，可有效鉴定出细菌菌相组成。步骤(I)中，所述的酶解可以为:将发酵酸面团加入淀粉酶溶液中，混匀，进行酶解反应。所述的淀粉酶可以为α -淀粉酶。发酵酸面团中淀粉含量较高，在样品热处理时，淀粉易发生溶胀，包裹住发酵酸面团中的微生物，从而影响微生物总基因组DNA的提取，α -淀粉酶能有效酶解发酵酸面团中淀粉α -1, 4糖苷键，生成小分子糊精和其他低聚糖，增加面团的流动性，使酸面团中微生物充分释放于溶液中，以便有效提取全部微生物的总DNA。采用α-淀粉酶的特征是其能引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以葡 萄糖为主，此外，还有少量麦芽三糖及麦芽糖。为了获得更好的酶解效果，所述的发酵酸面团与淀粉酶的重量比优选为
0.5:1-1:1 ;更优选为 1:1。所述的酶解温度优选为60_65°C，时间优选为20_30min。该酶解条件下，淀粉酶对
发酵酸面团的水解程度合适。所述的酶解反应可以在水浴或金属浴中进行，优选在金属浴中进行。金属浴升温速度较快，保温效果好，有利于酶解反应的进行。步骤(2)中，可以采用细菌DNA试剂盒提取酸面团酶解物中的细菌总基因组DNA。细菌DNA试剂盒可以选用细菌DNA OMEGA试剂盒，提取效果较好。提取细菌总基因组DNA后，可以将DNA的浓度调整为45_55ng/uL，再进行第一轮PCR扩增；优选调整为50ng/uL。将DNA浓度调整为统一的固定值，这样可以比较菌种在不同样品内的菌量，通过DGGE指纹图谱中条带的明暗，可以半定量地分析存在于发酵酸面团中优势微生物的种类。步骤(3)中，第一轮PCR所用引物的正向引物341f_GC为引物341f带上GC夹子(GC clamp)，引物341f的碱基序列如SEQ ID N0.1所示，GC夹子的碱基序列如SEQ ID N0.2所示；反向引物543r的碱基序列如SEQ ID N0.3所示。细菌通用引物341f与543r可以扩增细菌16S rDNA V3区域，本发明选用的引物扩增片段约为240bp ;其中，正向引物带有GC夹子，GC夹子是指富含GC的一段DNA序列，一般为40-50个碱基对，含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处，其解链温度比AT的双键要高，可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链。当加了 GC夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。所述的第一轮PCR为降落PCR (Touchdown PCR)。降落PCR是主要用于避免非特异性PCR产物的出现，确保第一个引物一模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即特异行扩增的反应物之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异产物在此时已经有一个几何数的起始优势，在剩余的反应中，特异产物会竞争非特异产物，特异产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。降落PCR的反应体系可以为:25μ I的反应体系组成如下:DNA模版2μ I,引物 341 f-GC 与 543r 的两种引物各 0.5 μ 1，dNTPs2.5 μ 1，10 X buff er2.5 μ 1，Ex Taq 酶
0.125 μ 1，蒸馏水 16.875 μ I。降落PCR的反应条件:94°C预变性4min，然后在94°C变性lmin，65°C引物复性lmin，72°C引物延伸lmin，循环20次，每循环一次，复性温度降低0.5°C ;之后，94°C变性lmin，55°C复性lmin，72°C延伸lmin，循环5次后72°C终延伸lOmin。由于存在于传统发酵酸面团中的细菌种类较多，为了达到每一种细菌的解链温度，采用该降落PCR反应条件，可以最大程度地获得各种细菌的PCR片段，便于DGGE分析。为了增加结果的准确性，可以在第一轮PCR扩增中分别设置阳性对照(已知细菌)和阴性对照(水)，以避免出现PCR的假阳性扩增。第一轮PCR扩增产物可以采用1.8-2%的琼脂糖凝胶电泳检验。步骤(4)中，为了使存在于发酵酸面团中的微量细菌的DNA含量达到DGGE分析的检测限，因此，进行所述的第二轮PCR用来进一步增加细菌基因组DNA的含量。第二轮PCR所用引物为不带GC夹子的细菌通用引物341f与543r。正向引物341f的碱基序列如SEQ ID N0.1所示，反向引物543r的碱基序列如SEQ ID N0.3所示。引物341f/543r 可扩增细菌 16S rDNA V3 区。第二轮PCR的反应条件为:95°C预变性4min，然后在95°C变性lmin，55°C引物复性lmin，72°C引物延伸lmin，循环4次，72°C终延伸lOmin。步骤(5)中，所述的分析可以包括如下步骤:合并第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的产物并纯化，然后进行变性梯度凝胶电泳分离，将得到的扩增条带进行染色、纯化、克隆测序，之后与标准菌序列比对，判定细菌种类。变性梯度凝胶电泳分辨率高，可以有效鉴定出发酵酸面团中细菌菌相组成。优选地，所述的变性梯度凝胶电泳的变性梯度为30%_60%，电泳电压为48-52V，电泳时间为12_13h ;更优选地，电泳电压为50V，电泳时间为13h。通过试验发现，低压长时间电泳，可使不同DNA片段有效解链，达到更好的分离效果。所述的染色可以采用SYBR Green I染色。本发明采用α -淀粉酶酶解后的样品进行总基因组DNA提取，采用细菌通用引物16S rDNA V3区341f与543r进行两次PCR扩增，再进行DGGE凝胶电泳分离鉴定，从分子水平对传统发酵酸面团中细菌菌相组成进行了鉴定，同时能实现半定量分析，具有稳定、高效、成本低的特点，为开发我国传统发酵食品资源提供参考。
图1为本发明的技术流程图。
图2为五个不同地区发酵酸面团中细菌PCR-DGGE指纹图谱。
具体实施例方式本实施例在本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂盒厂商所建议的条件。实施例1按照如图1所示的技术流程进行操作，具体为:(I)取五个来自我国不同地区的传统发酵酸面团，编号为Hn-87、Sx_91、Gs_107、Hf-112和Hr-122，分别取发酵酸面团200mg于1.5mL离心管中，加入lmL20%a-淀粉酶溶液，震荡混匀。(2)将混合液置于65°C金属浴中加热酶解20min，在12000Xg条件下离心5min，
弃沉淀，取上清，得到酶解物。(3)采用细菌DNA OMEGA试剂盒·提取酶解物中细菌总基因组DNA。(4) Nandrop2000检测提取的DNA的浓度，并调整DNA浓度为50ng/uL。(5)将调整后的DNA溶液进行降落PCR (Touchdown PCR,第一轮PCR)扩增；引物为带有GC夹子的细菌通用引物16S rDNA V3区341f与543r ；341f:5，-CCTACGGGAGGCAGCAG-3，, 543r:5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，，GC 夹子:5，-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCC CCGCCCG-3，。25 μ I的反应体系组成如下:DNA模板2 μ 1，引物341f_GC和542r的两种引物各
0.5 μ 1，dNTPs2.5 μ 1，10Xbuffer2.5 μ 1，Ex Taq 酶 0.125 μ 1，双蒸水 16.875 μ I。反应条件为:94°C预变性4min，然后在94°C变性lmin，65 °C引物复性lmin，72°C引物延伸lmin，循环20次，每循环一次，复性温度降低0.5 °C ;之后，94°C变性lmin，55°C复性lmin，72°C延伸lmin，循环5次后72°C终延伸IOmin0(6)将PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检验后，将阳性结果再次进行Reconditioning PCR 反应(第二轮 PCR 扩增)，引物为不带GC夹子的细菌通用引物341f: 5’ -CCTACGGGAGGCAGCAG-3’，543r:5’ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3’，反应条件为:95°C预变性 4min，然后在 95°C变性 lmin，55°C 引物复性lmin，72°C引物延伸lmin，循环4次，72°C终延伸lOmin。(7)合并步骤(5)和步骤(6)的PCR产物，并进行纯化。PCR产物纯化后，进行DGGE凝胶电泳，上样量为15μ 1，加入7μ I loading buffer，变性梯度为30%_60% (胶浓度)，50V条件下电泳13h ;电泳结束后用SYBR Green I染色lh。(8)将DGGE胶在紫外灯下进行切割条带，并用超纯水浸没，4°C条件下过夜。(9)用不带GC夹子的引物对上述浸液进行PCR反应，进行片段验证后，进行克隆测序。(10)测序结果在NCBI上进行验证，鉴定目的微生物的种类。图2为五个不同地区发酵酸面团中细菌PCR-DGGE指纹图谱。根据克隆测序、NCBI比对结果五种样品的细菌菌相组成结果见表I和表2，表明本实施例方法可以快速鉴别出发酵酸面团中的细菌菌相组成。
表IDGGE指纹图谱中条带鉴定结果
权利要求
1.一种鉴定发酵酸面团中细菌菌相组成的方法，包括: (1)将发酵酸面团用淀粉酶酶解，得到酶解物； (2)从酶解物中提取细菌总基因组DNA； (3)以提取的细菌总基因组DNA为模板，利用带有GC夹子的细菌通用引物341f-GC与543r进行第一轮PCR扩增； (4)以第一轮PCR扩增后得到的阳性产物为模板，利用细菌通用引物341f与5431■进行第二轮PCR扩增； (5 )对第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的产物进行分析，确定发酵酸面团中细菌菌相组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的淀粉酶为α-淀粉酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的发酵酸面团与淀粉酶的重量比为0.5:1-1:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的酶解温度为60-65°C，时间为20-30min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，提取细菌总基因组DNA后，将DNA的浓度调整为45-55ng/uL，再进行第一轮PCR扩增。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的第一轮PCR为降落PCR。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，降落PCR的反应条件:94°C预变性4min，然后在94°C变性lmin，65°C引物复性lmin，72°C引物延伸lmin，循环20次，每循环一次，复性温度降低0.5 0C ;之后，94°C变性Imin，55 O复性lmin，72°C延伸Imin，循环5次后72 °C终延伸IOmin0
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，第二轮PCR的反应条件为:95°C预变性4min，然后在95°C变性lmin，55°C引物复性lmin，72°C引物延伸lmin，循环4次，72°C终延伸lOmin。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的分析包括如下步骤:合并第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的产物并纯化，然后进行变性梯度凝胶电泳分离，将得到的扩增条带进行染色、纯化、克隆测序，之后与标准菌序列比对，判定细菌种类。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的变性梯度凝胶电泳的变性梯度为30%-60%，电泳电压为48-52V，电泳时间为12_13h。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定发酵酸面团中细菌菌相组成的方法，包括将发酵酸面团用淀粉酶酶解，得到酶解物；从酶解物中提取细菌总基因组DNA；以提取的细菌总基因组DNA为模板，利用带有GC夹子的细菌通用引物341f-GC与543r进行第一轮PCR扩增；以第一轮PCR扩增后得到的阳性产物为模板，利用细菌通用引物341f与543r进行第二轮PCR扩增；对第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增的产物进行分析，确定发酵酸面团中细菌菌相组成。本发明对发酵酸面团先进行酶解后再进行PCR扩增，然后通过变性梯度凝胶电泳分离，从分子水平对传统发酵酸面团中细菌菌相组成进行了鉴定，具有稳定、高效、成本低的特点，为开发我国传统发酵食品中微生物资源提供参考。
文档编号C12Q1/68GK103224985SQ201310152558
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月27日 优先权日2013年4月27日
发明者何国庆, 张国华, 柯乐芹, 何捷, 朱永胜, 朱立颖, 王欣 申请人:浙江大学