专利名称：一种来源于水稻的受PBZ诱导的OsPBZ1启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种来源于水稻的受PBZ诱导的启动子及其应用。
背景技术：
启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA序列，通常位于基因上游。一个典型的启动子包括CAAT-box和TATA-box，它们分别是依赖DNA的RNA聚合酶的识别和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处。在核心启动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件，转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录。一旦RNA聚合酶定位并结合在启动子上即可启动基因转录，因此启动子是基因表达调控的重 要元件，并与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用。根据启动子启动转录的模式可将其分为3类:组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子[路静等，自然科学进展14 (8) =856-862, 2004] 0与组成型启动子和组织器官特异性启动子相比，诱导型启动子有着独特的优势:它可根据需要在植物特定的发育阶段、组织器官或生长环境下，快速诱导基因转录的开与关。根据来源，可将诱导型启动子分为天然的诱导型启动子和人工构建的诱导型启动子[路静等，自然科学进展14 (8):856-862，2004]。天然诱导型的启动子包括光、温度、激素、干旱、高盐胁迫、病原菌应答启动子等[路静等，自然科学进展14 (8) =856-862,2004 ；Narusaka Y,et al, Plant J,34 (2):137-148, 2003 ;Song FM,et al, Gene,290:115-124,2002]。目前研究最多、最深入的人工可诱导表达系统是化学诱导表达系统，如四环素诱导的TetR系统、地塞米松诱导的GR系统、雌二醇诱导的ER系统、杀虫剂诱导的EcR系统(Gatz C, et al,Proc Nalt Acad Sci USA, 1988,85:1394-1397 ；Aoyama T,et al,Plant J,1999,11:605-612 ；Zuo J,et al,Plant J,2000,24:265-273 ；Unger E, et al,TransgenicRes,2002,11:455_465)。本发明集中在来源于水稻的受PBZ诱导的DNA启动子片段，以及利用这些启动子片段构建一套实用型化学诱导外源基因表达体系，用于作物的转基因改良。该诱导表达体系的主要优势在于其诱导物PBZ对无致病性的微生物和温血动物低毒、安全，是一种环境友好型的农用化学物质。PBZ是日本明治制果公司于1975年开发的用于防治水稻稻瘟病的药剂，是目前东南亚稻区防治稻瘟病使用面积最大的抗病诱导剂。[Yi XH, et al,Chemosphere, 2006,65:639-643]。因此，这一诱导表达系统具有在大田作物转基因改良上的应用潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于水稻的受PBZ诱导的DNA启动子片段及其应用。本发明首先提供一种来源于水稻的受PBZ诱导的DNA启动子，该启动子来源于水稻病程相关基因6(5/ ，其DNA序列为SEQ ID NO:1所示。本发明还提供一种包含有SEQ ID NO:1所示的DNA序列的重组DNA载体，该重组DNA载体含有所述DNA序列作为启动子、与该启动子相连的是编码目的基因的DNA序列。本发明还提供所述包含有SEQ ID NO:1所示的DNA序列的重组DNA载体的细胞系O将编码目的产物基因的核酸序列与上述启动子片段融合得到重组DNA，用该种重组DNA转化获得的转基因植物中目的基因的表达受化学物质PBZ的诱导调控。即本发明还提供所述启动子的应用，包括将所述的重组DNA载体转化植物材料，获得转基因植物，该转基因植物在化学信号PBZ的作用下诱导目的产物基因的表达，特定基因产物水平上升。具体来说，本发明提供一种在植物中引起所选择的基因产物表达增高的方法，具体步骤如下:
a)用所述的重组DNA载体转化植物；
b)化学物质PBZ诱导转基因植物；
c)使转基因植物在期望的时候增加所选择的基因产物的表达。本发明还提供所述的水稻病程相关基因OsPBZl的启动子在提高作物抗逆性和改良作物品质等方面的应用。
图1 OsPBZl启动子与⑶S基因构建的融合表达载体示意图。图2在化学物质PBZ的诱导下，启动子活性的烟草瞬时转化验证。图3转基因水稻各株系的基因表达量(16、19、20为水处理；3、
8、9、13、14 为 PBZ 处理 15 天)。图4转基因水稻各株系的内源表达量(16、19、20为水处理；
3、8、9、13、14 为 PBZ 处理 15 天)。
具体实施例方式实施例1:水稻OsPBZl基因上游启动子片段的获得 1.1水稻叶片的PBZ处理
取在16h L/8h D光照，28°C条件下培养40天的水稻叶片，分别在PBZ处理后0、5、10、15天取样。1.2 RNA 提取
取水稻材料约0.lg。液氮充分研磨后，转移到1.5ml离心管，加Iml TRIzol (invitrogen公司),混勻后,室温放置15分钟,加0.2ml氯仿:异戍醇(24:1),剧烈摇动15秒后室温放置5分钟，13000rpm，4°C离心15分钟。取上清液并加入等体积异丙醇，小心混匀，室温放置15分钟，13000rpm，4°C离心15分钟。70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥15分钟。溶解于适量的经0.1% DEPC处理过的ddH20水中，贮存于_80°C备用。1.3 cDNA第一链合成和反转录PCR 采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为:2Pg制备的总RNA，0.5μ1 Rnaseinhibitor,加 DEPC 处理过的去离子水至 8.5M-1, 2M-1 的 Oligo (dT) 18 primer, 65°C，5min,室温放置 IOmin, 13000rpm 简短离心 5s。再依次加入 4μ1 5 XFirst-Strand buffer, 0.5M-1RNase Inhibitor, 2μ1 IOOmM DTT, 2M-1 dNTP, IM-1 MMLV Reverse Transcriptase。小心混匀；37°C反转录I小时，90°C 5分钟；冰上冷却；13000rpm短暂离心5秒钟，存放于-200C0获得的cDNA可用于相关基因表达量的检测。1.4 OsPBZl基因启动子的载体构建
设计引物:0sPBZl S 5’ GCGAGGTAACAAAAAAGATTTCAAA 3’( SEQ ID NO:2),OsPBZl AS5’ CACTGAAGATATAATCTAACTAGCT 3’(SEQ ID NO:3)，以水稻野生型的基因组DNA为模板，扩增对应长度片段的启动子，将PCR产物接入T载体，测序正确后，用PstI和NcoI将其从T载体上切下，与同样经过PstI和NcoI双酶切的pCAMBIA1301双元载体进行连接并转化大肠杆菌(图1)，挑选阳性克隆，抽提质粒后，用电击法将阳性克隆质粒转化农杆菌(GV3101)，并鉴定阳性转化子，挑选阳性转化子在三抗(Rif+Gent+Kan)的YEB液体培养基中摇菌，用30%的甘油以体积比1:1进行保菌，存放于_80°C备用。1.5载体构建中常用实验方法
1.5.1 DNA限制性内切酶酶切
(1)20μ I酶切体系，2 μ I DNA，适量的酶切缓冲液(参见Takara目录)，酶量(0.2 μ I酶用于酶切鉴定，0.5μ I酶用于酶切克隆)。体系扩大，按比例增大各成分体积；
(2)按以下次序添加水、^^€61"、0嫩、酶，混匀，371:反应1.5-3h。(最后添加内切酶)。1.5.2玻璃粉制作以及玻璃粉回收DNA片断 玻璃粉制作
(1)用干净的研钵将石英砂磨到足够细，用筛子筛取大小合适的玻璃粉颗粒；
(2)用一倍体积的无菌水悬浮玻璃粉，静置片刻；
(3)当出现分层时，吸取上层混浊液到新的离心管，下层沉淀重复2、3操作；
(4)2000-3000rpm, lmin 离心，去掉上清；
(5)无菌水清洗除菌后，以1:1比例用无菌水悬浮玻璃粉。玻璃粉回收DNA片断
(1)称空离心管重量，切胶后，再称重，计算胶的重量；
(2)以Img胶中加入3ul体积6mol/LNaI比例加入Nal，55°C烘箱或者水浴中充分溶
解；(3)加入5-10ul玻璃粉，充分悬浮混匀；
(4)冰浴15min，中间每隔5min轻弹离心管，使沉淀的玻璃粉悬浮起来；
(5)7000rpm, lmin 离心，弃上清；
(6)50倍玻璃粉体积加入Rincebuffer充分吹打洗涤；
(7)5000rpm, lmin离心，再重复6、7两次；
(8)去尽buffer，55°C水浴或者烘箱中挥发乙醇5_10min；
(9)10-20ulMil1-Q水吹打悬浮，Votex充分振荡； (10)55度烘箱或者水浴中溶解DNA15min，每隔5min轻轻混匀；
(11)13000rpm, 2min 离心后,取上清。New wash stock solution: 20Xrince buffer:H20:无水乙醇=1:9:1020Xrince buffer: 0.2mol/L Tris-Cl (pH7.5)，lmol/L NaCl, 20mmol/L EDTA乙醇沉淀回收DNA片断
(1)加入1/10体积的3MNaAc (酶切体系先用等体积酚:氯仿抽提蛋白)；
(2)加入2V-20°C预冷乙醇，置于冰上30 min ；
(3)12000 rpm,离心 10 min ；
(4)1ml 70%乙醇洗涤沉淀，55°C烘干，溶于TE。1.5.3载体与基因片段连接 连接缓冲液5.5μ1
插入片段3.Ομ
Τ4连接酶1.Ομ
酶切后载体0.5μ1
16°C连接过夜。1.5.4感受态·细胞制备以及转化 大管制备感受态细胞
(1)以1:100的比例转接前晚活化的菌种，在37°C摇床中280rpm培养到OD值0.3，本实验采用的是大肠杆菌ToplO株系；
(2)将培养液倒入50ml离心管，冰上稍微预冷，4000rpm，IOmin离心；
(3)倒掉上清，加入IOml0.lmol/L CaCl2的氯化钙，轻轻打散菌块；
(4)冰上放置30min,2500rpm, IOmin离心(离心后沉淀出现环状为佳)；
(5)倒掉上清，快速放置到冰上，加入2ml0.lmol/L CaC12，轻轻悬浮菌体；
(6)放置在冰上,2小时后即可用来转化。转化
(1)准备42°C水浴；
(2)将200ul感受态细胞和连接液(5-10ul)或者质粒(Iul)加入到离心管中，混匀；
(3)冰浴30min后，42°C热激90s，放置在冰上5min；
(4)转化质粒直接涂板；
(5)转化连接液加入2倍细胞体积的SOC培养液，37°C摇床50-100rpm预培养(Amp抗性I小时，Kan、Cm抗性2小时),本实验采用的是Kan抗性平板；
(6)取200ul混合物涂在含一定量抗生素的LB平板上，37°C倒置培养过夜；
(7)次日早上通过抗性筛选获得阳性克隆。1.5.5质粒抽提
(O挑单菌落到含一定量抗生素的LB液体培养基中37°C摇菌过夜；
(2)取Iml菌液，12000rpm30秒收集菌体，收集两次；
(3)加IOOul冰预冷的溶液I悬浮菌体，加入200ul溶液II，上下颠倒混匀，再加入150ul预冷的溶液III,上下颠倒混匀，置于冰上5分钟；
(4)12000rpm离心3分钟，转移上清到新的1.5ml离心管中；
(5)加等体积酹:氯仿抽提一次，12000rpm,3分钟,取上相；
(6)加2倍体积冰预冷的无水乙醇,混匀后置于冰上30分钟；
(7)12000rpm离心5分钟，去上清，用70%乙醇洗涤沉淀；(8)55°C烘干 5 分钟，溶解于 50ul TECpH 8.0)，加 0.5ugRNase，37°C消化30 分钟。_20°C保存。溶液1: 50 mmol /I,葡萄糖，25 mmol /T, Tris-Cl, pH 8.0 ； 10 mmol/L EDTA, pH8.0，闻压灭囷。溶液I1: 0.2 mo I/L NaOH, 1%SDS (现配现用，不可置于冰上)。溶液II1:每 100 ml, 60 ml 5 mol/L 乙酸钟，11.5 ml 冰乙酸,28.5 ml 去离子水。实施例2:启动子活性的瞬时转化验证
以相同生长期的烟草为对照，对烟草进行PBZ诱导处理5天，而后进行注射，2天后取样染色。实验结果显示，转有鸯/#P0sPBZl-pCAMBIA1301的烟草材料在PBZ诱导后⑶S染色均较深，而转入同样载体但未经PBZ诱导的对照均未见有明显的⑶S染色(图2)。 实施例3 ,OsPBZl启动子诱导活性在水稻中的稳定转化分析
我们将构建好的融合基因POsPBZ1::通过稳定转化转入水稻愈伤，并获得TO代株系。为了确认OsPBZl启动子是否有效地响应PBZ诱导，我们检测了部分转基因株系的GUS基因和内源/ 基因的诱导表达量。结果显示，PBZ处理15天后的各株系基因表达量较水处理各株系有较高幅度的增加(图3); PBZ处理15天后，各株系内源的表达量较水处理的表现出了更大幅度的增加(图4)。实施例4..0sPBZl化学诱导型启动子的应用
本发明的化学诱导启动子可用本领域熟知的方法构建到植物表达载体中。为了便于对转诱导启动子的细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(似基因、基因、荧光素酶基因等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，如水稻、玉米、小麦和草坪草等，也可以是双子叶植物，如大豆、棉花和杨树等，但不局限于上述物种。携带有本发明的诱导型启动子的表达载体可以借助于Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电导和农杆菌等方法介导转化植物细胞或组织，并将转化受体培育成植株，以获得抗逆性和产量与品质性状得到显著改良的育种资源材料。
权利要求
1.一种来源于水稻的受PBZ诱导的OsPBZl启动子，其特征在于核苷酸序列为SEQ IDNO:1。
2.一种包含有权利要求1所述启动子的重组DNA载体，其特征在于该重组DNA载体含有权利要求1所述的启动子、与该启动子相连的是编码目的基因的DNA序列。
3.一种包含权利要求2所述重组DNA载体的细胞系。
4.一种如权利要求2所述的重组DNA载体的应用，其特征在于所述的重组DNA载体转化的植物材料，转化有该重组DNA载体的植物在化学物质PBZ的作用下，目的基因产物水平上升。
5.一种在植物中引起所选择的基因产物表达增高的方法，其特征在于具体步骤如下: a)用权利要求 2所述的重组DNA载体转化植物； b)化学物质PBZ诱导转基因植物； c)使转基因植物在期望的时候增加所选择的基因产物的表达。
6.如权利要求1所述的启动子在提高作物抗逆性和改良作物品质方面的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种来源于水稻的受PBZ诱导的OsPBZ1启动子及其应用。本发明的启动子来源于水稻病程相关基因OsPBZ1，其DNA序列为SEQIDNO1所示。将编码目的产物基因的核酸序列与上述启动子片段融合得到重组DNA，用该种重组DNA转化获得的转基因植物中目的基因的表达受化学物质PBZ的诱导调控。本发明的启动子可应用于在化学物质PBZ诱导下启动下游基因的表达，为提高作物抗逆性和改良产量与品质性状提供新的思路和方法。
文档编号C12N15/113GK103233008SQ201310151868
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月27日 优先权日2013年4月27日
发明者蒯本科, 高炯, 朱政, 梁宁菁 申请人:复旦大学