专利名称：多种抗原免疫高通量制备单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及多种抗原免疫高通量制备单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的方法。
背景技术：
随着蛋白质组学研究的发展，数以千计的蛋白需要用亲和试剂如单克隆抗体进行进一步的功能验证，如蛋白的定性、定量分析、蛋白质的分离纯化、功能验证、蛋白质间的相互作用验证及蛋白翻译后修饰的识别等。单克隆抗体技术是产生具有蛋白质识别功能的高度特异性抗体的基本方法，因此，单克隆抗体在蛋白质的研究中已经成为必不可少的工具。然而传统的单抗制备耗时长、效率低，许多文章报道了在提高单克隆抗体生产速度和通量方面所做的尝试。Ning等人采用组份化的血浆蛋白免疫小鼠，然后用免疫沉淀/质谱法鉴定相应的抗原。一些研究者采用蛋白混合物免疫小鼠然后用蛋白芯片和流式细胞术鉴定相应的抗原，另外也有一些不依赖于细胞融合的方法，如重组抗体及噬菌体展示制备抗体的报道。不同的抗体适用于不同的检测方法(如免疫印迹法、免疫沉淀法，免疫组织化学法、免疫荧光法及流式细胞术等等)，所以需要更多的抗体以适应不同的需求。为满足这种需要，建立高通量快速获得单克隆抗体的方法是十分必要的。在之前的研究中曾用四种已知蛋白免疫小鼠并用ELISA法及蛋白芯片对单克隆抗体进行筛选，但是免疫和筛选的种类还是不够多。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用多种抗原免疫高通量制备分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法。本发明的方法，包括如下步骤:I)用η种目标蛋白的混合物作为免疫抗原免疫小鼠，得到免疫后小鼠；η大于4且小于15 ；所述η种目标蛋白的混合物为将η种目标蛋白混合，得到的混合物；2)收集处死后的步骤I)所得免疫小鼠的离体脾细胞；将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞；3)对所述融合细胞进行第一轮ELISA检测，选取发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞；所述第一轮ELISA检测中，将所述η种目标蛋白混合物包被作为抗原、一抗为所述融合细胞的细胞培养上清液、二抗为抗小鼠IgG的抗体；4)将所述第一轮ELISA检测中发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞进行第二轮ELISA检测，选取针对单一抗原发生免疫阳性的杂交瘤细胞株，即为分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞；所述第二轮ELISA检测中，将η种目标蛋白均单独包被作为抗原、一抗为所述在第一轮ELISA检测中发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞的细胞培养上清液、二抗为抗小鼠IgG的抗体；所述单一抗原为η种目标蛋白中任一种。所述分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞为如下杂交瘤细胞中的一种或几种:分
泌抗蛋白I的单克隆抗体的杂交瘤细胞、分泌抗蛋白2的单克隆抗体的杂交瘤细胞、......、
分泌抗蛋白η的单克隆抗体的杂交瘤细胞。上述方法中，所述η种目标蛋白混合为等质量混合；所述η种目标蛋白之间的同源性小于34%，所述η种目标蛋白之间的同源性为9-34% ；所述目标蛋白为不含标签的目标蛋白或含有标签的目标蛋白；若作为免疫抗原的目标蛋白为不含标签的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为不含标签的目标蛋白或含有标签的目标蛋白；若作为免疫抗原中的目标蛋白为含标签A的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为含标签B的目标蛋白；且所述标签A和所述标签B不同。上述方法中，步骤I)中，所述免疫包括如下步骤:
Α、将所述免疫抗原首次免疫小鼠，得到首免小鼠；B、将所述免疫抗原加强免疫所述首免小鼠，得到免疫小鼠；所述加强免疫的时间为首次免疫第10-20天，所述加强免疫的时间具体为首次免疫第11天，将首次免疫开始记作第I天；步骤I)中，所述首次免疫的免疫抗原的量为每250ul免疫抗原中含有质量均为10 μ g的8种含有HIS标签的重组抗原蛋白；所述加强免疫的免疫抗原的量为每250ul免疫抗原中含有质量均为10 μ g的8种含有HIS标签的重组抗原蛋白；所述免疫抗原中的η种抗原蛋白等质量混合；步骤2)中，所述骨髓瘤细胞为SP2/0细胞骨髓瘤细胞；所述离体脾细胞与所述SP2/0骨髓瘤细胞的个数比为5-10:1，所述离体脾细胞与所述SP2/0骨髓瘤细胞的个数比具体为5:1;所述收集所述免疫小鼠的离体脾细胞为加强免疫第3天，将加强免疫开始记作第I天;所述步骤3)或步骤4)中，所述抗小鼠IgG的抗体均为HRP标记的羊抗鼠IgG。上述方法中，在步骤I)和步骤2)之间，还包括如下步骤:用ELISA检测所述免疫小鼠的离体血清的抗体效价，选取针对η种目标蛋白均有特异性抗体的免疫小鼠；所述ELISA检测中，将η种目标蛋白均单独包被作为抗原、一抗为所述免疫小鼠的离体血清、二抗为抗小鼠IgG的抗体。上述方法中，所述免疫抗原中的目标蛋白为含标签A的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为含标签B的目标蛋白；且所述标签A和所述标签B不同；所述η为8 ;所述免疫抗原中的8种目标蛋白分别为含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-TP53、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-c_myc、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A8、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A9、含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-1、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-2 和含有 HIS 标签的重组蛋白 Trx-HIS - S-PTEN ；所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的8种目标蛋白分别为含有GST标签重组蛋白GST-TP53、含有GST标签重组蛋白GST-c_myc、含有GST标签重组蛋白GST-S100A8、含有GST标签重组蛋白GST-S100A9、含有GST标签重组蛋白GST-pCAF、含有GST标签重组蛋白GST-PCT-1、含有GST标签重组蛋白GST-PCT-2和含有GST标签重组蛋白GST-PTEN。上述方法中，所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-TP53为由序列I所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-c-myc为由序列2所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A8为由序列3所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A9为由序列4所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF为由序列5所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有HIS 标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-1为由序列6所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S_PCT_2为由序列7所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PTEN为由序列8所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有GST标签重组蛋白GST-TP53为由序列9所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有GST标签重组蛋白GST-c-myc为由序列10所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有GST标签重组蛋白GST-S100A8为由序列11所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有GST标签重组蛋白GST-S100A9为由序列12所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有GST标签重组蛋白GST-pCAF为由序列13所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有GST标签重组蛋白GST-PCT-1为由序列14所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有GST标签重组蛋白GST-PCT-2为由序列15所示的核苷酸编码的蛋白；所述含有GST标签重组蛋白GST-PTEN为由序列16所示的核苷酸编码的蛋白。上述方法中，所述η为8 ;8种不含标签的目标蛋白为蛋白ΤΡ53、蛋白c_myc、蛋白S100A8、蛋白 S100A9、蛋白 pCAF、蛋白 PCT-1、蛋白 PCT-2、蛋白 PTEN ；所述蛋白TP53为由序列表中序列I自5’末端第502-1329位核苷酸编码的蛋白；所述蛋白c-myc为由序列表中序列2自5’末端第502-1392位核苷酸编码的蛋白；
所述蛋白S100A8为由序列表中序列3自5’末端第496-777位核苷酸编码的蛋白；所述蛋白S100A9为由序列表中序列4自5’末端第496-843位核苷酸编码的蛋白；所述蛋白pCAF为由序列表中序列5自5’末端第109-699位核苷酸编码的蛋白；所述蛋白PCT-1为由序列表中序列6自5’末端第502-852位核苷酸编码的蛋白；所述蛋白PCT-2为由序列表中序列7自5’末端第502-774位核苷酸编码的蛋白；所述蛋白PTEN基因为由序列表中序列8自5’末端第496-1122位核苷酸编码的蛋白。由上述方法制备的杂交瘤细胞也是本发明保护的范围。由上述杂 交瘤细胞分泌的单克隆抗体也是本发明保护的范围。本发明的另一个目的是提供一种用于免疫的蛋白组合物。本发明提供的用于免疫的蛋白组合物，为如下I)或2):I)所示的蛋白组合物由8种不带标签的目标蛋白组成，所述8种不带标签的目标蛋白为所述蛋白TP53、所述蛋白c-myc、所述蛋白S100A8、所述蛋白S100A9、所述蛋白pCAF、所述蛋白PCT-1、所述蛋白PCT-2和所述蛋白PTEN ；2)所示的蛋白组合物由8种含标签A的目标蛋白组成，所述8种含标签A的目标蛋白为所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-TP53、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-c-myc、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A8、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A9、所述含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-1、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-2和所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PTEN0本发明的实验证明，本发明选取在人类生理或病理过程中起重要作用，且相互之间具有较低相似性的8种蛋白质，将它们混合后免疫同一只小鼠，免疫10天并加强免疫3天后，通过细胞融合获得杂交瘤细胞，通过筛选，最终获得了分别针对8种蛋白在ELISA水平阳性的分泌单抗的杂交瘤细胞株，并且分别针对多种抗原的单抗在ELISA和免疫印迹检测中均呈现阳性。因此，本发明建立了一种通过一次细胞融合获得多种蛋白的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的高通量方法，为单抗制备节省了时间和人力成本，并为提高单克隆抗体的生产效率做出了贡献。
图1为8种His标签重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果图2为8种GST标签重组蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳结果图3为两轮ELISA筛选后，针对不同抗原的阳性杂交瘤细胞株数图4为在第二轮ELISA筛选中部分单特异性细胞株的ELISA结果图5为两轮ELISA筛选后，部分单特异性细胞株在免疫印迹中进一步验证其特异性
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中免疫用蛋白和检测用蛋白的氨基酸及对应的基因的核苷酸序列如下:序列I为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-TP53的基因的核苷酸序列，其中，序列I自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列I自5’末端第1-327位核苷酸为Trx (硫氧环蛋白)标签，序列I自5’末端第400-444位核苷酸为S标签，序列I自5’末端第502-1329位核苷酸为TP53基因；序列I所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-TP53。序列2为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-c-myc的基因的核苷酸序列，其中，序列2自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列2自5’末端第1-327位核苷酸为Trx (硫氧环蛋白)标签，序列2自5’末端第400-444位核苷酸为S标签，序列2自5’末端第502-1392位核苷酸为c-myc基因；序列2所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-c-myc ο
序列3为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A8的基因的核苷酸序列，其中，序列3自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列3自5’末端第1-327位核苷酸为Trx (硫氧环蛋白)标签，序列3自5’末端第400-444位核苷酸为S标签，序列3自5’末端第496-777位核苷酸为S100A8基因；序列3所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A8。序列4为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A9的基因的核苷酸序列，其中，序列4自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列4自5’末端第1-327位核苷酸为Trx (硫氧环蛋白)标签，序列4自5’末端第400-444位核苷酸为S标签，序列4自5’末端第496-843位核苷酸为S100A9基因；序列4所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A9。序列5为免疫用含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF的基因的核苷酸序列，其中，序列5自5’末端第13-30位核苷酸为HIS标签，序列5自5’末端第109-699位核苷酸为pCAF基因；序列5所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF。序列6为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-1的基因的核苷酸序列，其中，序列6自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列6自5’末端第1-327位核苷酸为Trx (硫氧环蛋白)标签，序列6自5’末端第400-444位核苷酸为S标签，序列6自5’末端第502-852位核苷酸为PCT-1基因；序列6所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-1。序列7为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-2基因的核苷酸序列，其中，序列7自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列7自5’末端第1-327位核苷酸为Trx (硫氧环蛋白)标签，序列7自5’末端400-444位核苷酸为S标签，序列7自5’末端第502-774位核苷酸为PCT-2基因；序列7所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白 Trx-HIS - S-PCT-2。注:PCT_1为PCT全长序列，PCT-2为PCT从5’端第52位核苷酸到3’末端。序列8为免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PTEN的基因的核苷酸序列，其中，序列8自5’末端第346-366位核苷酸为HIS标签，序列8自5’末端第1-327位核苷酸为Trx (硫氧环蛋白)标签，序列8自5’末端第400-444位核苷酸为S标签，序列8自5’末端第496-1122位核苷酸为PTEN基因；序列8所示的DNA分子编码免疫用含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PTEN0序列9为检测用含有GST标签重组蛋白GST-TP53的基因的核苷酸序列，其中，序列9自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列9自5’末端第688-1515位核苷酸为TP53基因；序列表中序列9所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-TP53。序列10为检测用含有GST标签重组蛋白GST-c-myc的基因的核苷酸序列，其中，序列10自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列10自5’末端第688-1578位核苷酸为c-myc基因；序列表中序列10所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-c-mycο序列11为检测用含有GST标签重组蛋白GST-S100A8的基因的核苷酸序列，其中，序列11自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列11自5’末端第679-960位核昔酸为S100A8基因；序列表中序列11所不的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-S100A8。序列12为检测用含有GST标签重组蛋白GST-S100A9的基因的核苷酸序列，其中，序列12自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列12自5’末端第679-1026位核昔酸为S100A9基因；序列表中序列12所不的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-S100A9。序列13为检测用含有GST标签重组蛋白GST-pCAF的基因的核苷酸序列，其中，序列13自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列13自5’末端第688-1278位核苷酸为pCAF基因；序列表中序列13所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-pCAF。序列14为检测用含有GST标签重组蛋白GST-PCT-1的基因的核苷酸序列，其中，序列14自5’末端第1-660位·核苷酸为GST标签，序列14自5’末端第688-1038位核苷酸为PCT-1基因；序列表中序列14所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-PCT-1。序列15为检测用含有GST标签重组蛋白GST-PCT-2的基因的核苷酸序列，其中，序列15自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列15自5’末端第688-960位核苷酸为PCT-2基因；序列表中序列15所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-PCT-2。序列16为检测用含有GST标签重组蛋白GST-PTEN的基因的核苷酸序列，其中，序列16自5’末端第1-660位核苷酸为GST标签，序列16自5’末端第679-1305位核苷酸为PTEN基因；序列表中序列16所示的DNA分子编码检测用含有GST标签重组蛋白GST-PTEN。实施例1、多种抗原免疫高通量制备分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞一、多种免疫抗原和检测蛋白的获得1、多种目标蛋白的选取选取如下8种蛋白作为目标蛋白:肿瘤蛋白p53 (TP53, NP_000537.3)、c-myc(NP_002458.2)、SlOO 钙结合蛋白 A8 (S100A8, ΝΡ_002955.2)、SlOO 钙结合蛋白 A9(S100A9，NP_002956.1)、组蛋白乙酰化酶 pCAF (NP_003875.3)、降钙素PCT-1 (ΝΡ_001732.I)、降钙素截短体PCT-2 (NP_001732.1上部分片段，PCT-2蛋白)、蛋白酪氨酸磷酸酶 PTEN (PTEN, NP_000305.3)。上述各种蛋白的编码基因的核苷酸序列如上文所示。任何两个目标蛋白的氨基酸序列相似性列在表1，PCT-1和PCT2由于具有一段相同的氨基酸序列，而具有较高的同源性(64%)，其它蛋白两两之间的氨基酸序列相似性均(34%ο表1为8种目标蛋白中任何两个蛋白的氨基酸序列相似性
权利要求
1.一种利用多种抗原高通量制备分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，包括如下步骤 1)用η种目标蛋白的混合物作为免疫抗原免疫小鼠，得到免疫后小鼠； η大于4且小于15 ； 所述η种目标蛋白的混合物为将η种目标蛋白混合，得到的混合物； 2)收集处死后的步骤I)所得免疫小鼠的脾细胞；将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞； 3)对所述融合细胞进行第一轮ELISA检测，选取发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞； 所述第一轮ELISA检测中，将所述η种目标蛋白混合物包被作为抗原、一抗为所述融合细胞的细胞培养上清液、二抗为抗小鼠IgG的抗体； 4)将所述发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞进行第二轮ELISA检测，选取针对单一抗原发生免疫阳性的杂交瘤细胞株,即为分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞； 所述第二轮ELISA检测中，将η种目标蛋白单独包被作为抗原、一抗为所述发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞的细胞培养上清液、二抗为抗小鼠IgG的抗体； 所述单一抗原为η种目标蛋白中任一种。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述η种目标蛋白混合为等质量混合； 所述η种目标蛋白之间的同源性小于34%，所述η种目标蛋白之间的同源性为9-34% ； 所述目标蛋白为不含标签的目标蛋白或含有标签的目标蛋白； 若作为免疫抗原的目标蛋白为不含标签的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为不含标签的目标蛋白或含有标签的目标蛋白； 若作为免疫抗原中的目标蛋白为含标签A的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第_■轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为含标签B的目标蛋白；且所述标签A和所述标签B不同。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述免疫包括如下步骤 Α、将所述免疫抗原首次免疫小鼠，得到首免小鼠； B、将所述免疫抗原加强免疫所述首免小鼠，得到免疫小鼠； 所述加强免疫的时间为首次免疫第10-20天，所述加强免疫的时间具体为首次免疫第11天，将首次免疫开始记作第I天；步骤2)中，所述骨髓瘤细胞为SP2/0骨髓瘤细胞；所述离体脾细胞与所述SP2/0骨髓瘤细胞的个数比为5-10:1,所述离体脾细胞与所述SP20骨髓瘤细胞的个数比具体为5:1 ；所述收集所述免疫小鼠的离体脾细胞为加强免疫第3天，将加强免疫开始记作第I天; 所述步骤3)或步骤4)中，所述抗小鼠IgG的抗体均为HRP标记的羊抗鼠IgG。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 在步骤I)和步骤2)之间，还包括如下步骤用ELISA检测所述免疫小鼠的离体血清的抗体效价，选取针对η种目标蛋白均有特异性抗体的免疫小鼠； 所述ELISA检测中，将η种目标蛋白单独包被作为抗原、一抗为所述免疫小鼠的离体血清、二抗为抗小鼠IgG的抗体。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 所述免疫抗原中的目标蛋白为含标签A的目标蛋白，则所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的目标蛋白为含标签B的目标蛋白；且所述标签A和所述标签B不同； 所述η为8 ;所述免疫抗原中的8种目标蛋白分别为含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-TP53、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-c_myc、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A8、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A9、含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-I、含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-2 和含有 HIS 标签的重组蛋白 Trx-HIS - S-PTEN ； 所述第一轮ELISA检测和第二轮ELISA检测中作为抗原的8种目标蛋白分别为含有GST标签重组蛋白GST-TP53、含有GST标签重组蛋白GST-c_myc、含有GST标签重组蛋白GST-S100A8、含有GST标签重组蛋白GST-S100A9、含有GST标签重组蛋白GST-pCAF、含有GST标签重组蛋白GST-PCT-I、含有GST标签重组蛋白GST-PCT-2和含有GST标签重组蛋白GST-PTEN。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于 所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS-S-TP53为由序列I所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-c-myc为由序列2所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A8为由序列3所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A9为由序列4所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF为由序列5所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-I为由序列6所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-2为由序列7所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PTEN为由序列8所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有GST标签重组蛋白GST-TP53为由序列9所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有GST标签重组蛋白GST-c-myc为由序列10所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有GST标签重组蛋白GST-S100A8为由序列11所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有GST标签重组蛋白GST-S100A9为由序列12所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有GST标签重组蛋白GST-pCAF为由序列13所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有GST标签重组蛋白GST-PCT-I为由序列14所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有GST标签重组蛋白GST-PCT-2为由序列15所示的核苷酸编码的蛋白； 所述含有GST标签重组蛋白GST-PTEN为由序列16所示的核苷酸编码的蛋白。
7.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于所述η为8 ;8种不含标签的目标蛋白为蛋白ΤΡ53、蛋白c-myc、蛋白S100A8、蛋白S100A9、蛋白 pCAF、蛋白 PCT-1、蛋白 PCT-2、蛋白 PTEN ； 所述蛋白TP53为由序列表中序列I自5’末端第502-1329位核苷酸编码的蛋白； 所述蛋白c-myc为由序列表中序列2自5’末端第502-1392位核苷酸编码的蛋白； 所述蛋白S100A8为由序列表中序列3自5’末端第496-777位核苷酸编码的蛋白； 所述蛋白S100A9为由序列表中序列4自5’末端第496-843位核苷酸编码的蛋白； 所述蛋白PCAF为由序列表中序列5自5’末端第109-699位核苷酸编码的蛋白； 所述蛋白PCT-I为由序列表中序列6自5’末端第502-852位核苷酸编码的蛋白； 所述蛋白PCT-2为由序列表中序列7自5’末端第502-774位核苷酸编码的蛋白； 所述蛋白PTEN基因为由序列表中序列8自5’末端第496-1122位核苷酸编码的蛋白。
8.由权利要求1-7所述方法制备的杂交瘤细胞。
9.由权利要求8所述杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
10.一种用于免疫的蛋白组合物，为如下I)或2): I)所示的蛋白组合物由8种不带标签的目标蛋白组成，所述8种不带标签的目标蛋白为所述蛋白TP53、所述蛋白c-myc、所述蛋白S100A8、所述蛋白S100A9、所述蛋白pCAF、所述蛋白PCT-I、所述蛋白PCT-2和所述蛋白PTEN ； 2)所示的蛋白组合物由8种含标签A的目标蛋白组成，所述8种含标签A的目标蛋白为所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-TP53、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS -S-c-myc、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A8、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-S100A9、所述含有HIS标签的重组蛋白HIS-pCAF、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-I、所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PCT-2和所述含有HIS标签的重组蛋白Trx-HIS - S-PTEN0
全文摘要
本发明公开了一种多种抗原免疫高通量制备单克隆抗体及其杂交瘤细胞株的方法。本发明提供利用多种抗原免疫高通量制备分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，包括如下步骤1)用n种抗原蛋白混合作为免疫抗原免疫小鼠，得到免疫后小鼠；2)所述免疫后小鼠的离体脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，得到融合细胞；3)将融合细胞进行第一轮ELISA筛选，选取发生免疫阳性的杂交瘤细胞；4)将所述发生免疫阳性反应的杂交瘤细胞进行第二轮ELISA筛选，选取针对单一抗原免疫阳性反应的杂交瘤细胞；本发明建立了一种通过一次细胞融合获得多种蛋白单克隆抗体的高通量技术方法，为单抗制备节省了时间和人力成本，并为提高单克隆抗体的生产效率做出了贡献。
文档编号C12N15/06GK103255128SQ20131015289
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月27日 优先权日2013年4月27日
发明者刘莹, 刘静, 左威, 郝露, 张莉莉, 甄蓓 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所