一种重组杆状病毒及制备方法以及在癌症疫苗制备中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种能在哺乳动物细胞内高效表达DLL4 蛋白的一种重组杆状病毒，以及该病毒的制备方法，以及该病毒在癌症疫苗制备中的应用。
【背景技术】
[0002] 近些年，以肿瘤的某些特异性表面抗原为靶标开发的治疗性癌症疫苗的研究取得 了丰硕的成果。目前，在美国已经有一批相关癌症疫苗获得FDA临床试验审批。然而，由于 针对的癌细胞抗原的免疫原性较弱，无法激起较强而有效的免疫反应，以及用于表达抗原 的质粒生产成本高等原因严重影响了该治疗手段的发展。
[0003] DLL4蛋白是Notch信号通路的一个配体，在血管生成过程中起到关键作用。据研 究，在许多肿瘤中如乳腺癌、胃癌等都存在DLL4蛋白过表达现象，而在正常的乳腺或结肠 中并未发现异常。已有实验研究表明：利用DLL4特异性抗体堵塞Notch信号通路，或者利 用DLL4可溶性蛋白FC融合能够附束住Notch受体，阻滞DLL4的激活。这些实验显示了强 有力的抗癌效应。另有研究也表明，Anti-DLL4-Ab表明很好的抗癌功效。
[0004] 张浩、张耀洲等("家蚕杆状病毒表面展示DLL4蛋白的肿瘤疫苗的研究"）利用 Bac-to-Bac系统成功构建了表面展示DLL4蛋白的杆状病毒，将人源DLL4蛋白基因与GP64 蛋白基因的信号肽基因和跨膜区基因连接后，与载体pFastBacl连接成功构建重组病毒。 用该病毒对C57BL/6小鼠进行免疫实验，发现免疫了重组病毒后的小鼠血液中产生了针对 DLL4蛋白的特异性抗体，肿瘤的生长也受到一定抑制。这与BKHaller等人的实验结果是 相符的，对该方向的研究是一个重大鼓舞。但是，该重组病毒也存在上述癌症疫苗的普遍问 题，即产生的免疫原性较弱，无法激起较强而有效的免疫反应，导致免疫效果不明显，免疫 作用低。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种重组杆状病 毒，该重组杆状病毒稳定性好，宿主感染率高，表达能力强，能在哺乳动物细胞内高效表达 DLL4蛋白，从而激起较强而有效的免疫反应。
[0006] 本发明所采用的技术方案为：
[0007] -种重组杆状病毒Bm-CMV-DLL4_DAF，该病毒以杆状病毒表达载体Pfastbacdual 为载体，包含有CMV-IE启动子、DLL4基因、gp64信号肽基因、DAF蛋白基因以及gp64跨膜 区基因，其中gp64信号肽基因、gp64跨膜区基因分别连接在DAF蛋白基因的5'端和3'端。
[0008] 上述重组杆状病毒Bm-CMV-DLL4-DAF的制备方法，包括以下步骤：
[0009] (1)以CMV-N2-F (SEQIDN0 :7所示)、CMV-N2-R (SEQIDN0 :8所示）为引物，以 PEGFP-N2载体为模板，由PCR扩增方法得到CMV-IE启动子序列（SEQIDN0 :14所示)，然后以 EcoRl和Sail为酶切位点连接到Pfastbacdual载体中，得到Pfastbacdual-CMV重组质粒；
[0010] (2)以 DLL4-sall-F (SEQIDN0 :9 所示）、DLL4-notl-R (SEQIDN0 :10 所示）为弓| 物，以pMD 18-T-DLL4载体为模板，由PCR扩增方法得到DLL4蛋白基因（SEQIDN0 :15所 示)，然后在DLL4蛋白基因的起始密码子前加入一段Kozaka序列（SEQIDN0 :16所示)，将 得到的连接片段以Sail和Notl为酶切位点连接到Pfastbacdual-CMV重组质粒中，得到 Pfastbacdual-CMV_DLL4 重组质粒；
[0011] (3)以 gp64-SP-F (SEQIDN0 :1 所示）、gp64-SP-R (SEQIDN0 :2 所示）为引物，以野 生杆状病毒基因组为模板，由PCR扩增方法得到gp64信号肽基因序列（SEQIDN0 :11所示）； 以gp64-TM-F (SEQIDN0 :3所示）、gp64TM-R (SEQIDN0 :4所示）为引物，以野生杆状病毒基 因组为模板，由PCR扩增方法得到gp64跨膜区基因序列（如SEQIDN0 :12所示）；以DAF-F (SEQIDN0 :5所示)、DAF-R (SEQIDN0 :6所示）为引物，以人源cDNA序列为模板，由PCR扩增 方法得到DAF蛋白基因序列（SEQIDN0 :13所示）；
[0012] (4)用重置PCR的方法将gp64 f目号肤基因序列和DAF蛋白基因序列进打重置拼 接，得到SP-DAF片段，用重叠PCR的方法将SP-DAF片段与gp64跨膜区基因序列进行重叠 拼接，得到SP-DAF-TM片段；
[0013] (5)以SamI和Xholl为酶切位点，将SP-DAF-TM片段连接至IJ Pfastbacdual-CMV_DLL4 重组质粒中，得到 Pfastbacdual-CMV-DLL4_DAF 重组质粒；
[0014] (6)将？€&8让&〇(1皿1-01^-01^4-04?重组质粒转化0111(? &(3感受态细胞，经蓝白斑 筛选获得 Bacmid-CMV-DLL4-DAF ;
[0015] (7)将Bacmid-CMV-DLL4-DAF转染BmN细胞，使72小时发病，提取病毒基因组，获 得一种重组杆状病毒Bm-CMV-DLL4-DAF。
[0016] 本发明进一步提供上述重组杆状病毒Bm-CMV-DLL4-DAF在癌症疫苗制备中的应 用。
[0017] 利用本发明纯化的重组杆状病毒Bm-CMV-DLL4-DAF免疫C57BL/6小鼠，分三次进 行免疫，间接法Elisa检测小鼠血液中有DLL4抗体存在，效价为6400。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
[0019] (1)本发明利用杆状病毒表面展示技术将DLL4蛋白成功展示于重组杆状病毒表 面，通过CMV-IE强启动子的引入、促衰变因子DAF蛋白基因的引入、Kozaka序列的引入、以 及将gp64信号肽基因和跨膜区基因分别连接在DAF蛋白基因的5'端和3'端，使得到的 Bm-CMV-DLL4-DAF病毒稳定性好，宿主感染率高，表达能力强，能够在哺乳动物体内高效表 达DLL4蛋白，并诱导产生DLL4抗体。
[0020](2)本发明利用杆状病毒作为基因治疗的优点在于其：更安全，较目前利用较多的 腺病毒，逆转录病毒等载体风险低，杆状病毒在哺乳动物中无法复制和表达，免疫反应小， 不会长期潜伏；更经济，比起质粒载体，我们的杆状病毒更易于纯化，成本低，这与目前成本 高昂的DNA质粒疫苗相比更有利于推广。
[0021] (3 )本方法适用于大规模纯化病毒，成本低，具有一定应用价值。
[0022] (4)本发明直接选取DLL4蛋白作为靶标，通过抑制血管生成来控制肿瘤的发展。 目前DLL4蛋白的信号转导的研究已较深入，但直接作为靶标进行疫苗开发还不多。
[0023] (5)本发明针对DLL4蛋白的疫苗主要是激活体液免疫，产生中和抗体，更容易产 生持续有效的免疫应答，并可针对多种DLL4过表达的肿瘤；而且，杆状病毒还是一种极好 的免疫佐剂，可促使诱导更强烈的免疫反应。而常规癌症疫苗主要是通过激活细胞免疫，通 过杀伤细胞，攻击癌细胞以达到治疗目的，但体内免疫系统错综复杂，通常这些疫苗很难激 起强而有效的免疫应答。
[0024] (6)以本发明重组杆状病毒作为癌症疫苗对实验小鼠进行免疫实验，发现安全有 效，无毒副作用；疫苗接种人体能够产生针对DLL4蛋白的特异性抗体，能有效封闭DLL4通 路，来控制肿瘤血管生长从而抑制肿瘤生长，是一种新的治疗方式。
【附图说明】
[0025] 图1所示的是重组质粒pFastBacDual-CMV的CMV基因酶切及PCR鉴定图；
[0026] 图2所示的是重组质粒pFastBacDual-CMV_DLL4的DLL4基因酶切及PCR鉴定图；
[0027] 图3所示的是重组质粒Pfastbacdual-CMV-DLL4_DAF的DAF蛋白基因酶切鉴定 图；
[0028] 图4所示的是重组质粒Bacmid-CMV-DLL4-DAF的鉴定图；
[0029] 图5所示的是重组杆状病毒Bm-CMV-DLL4-DAF的鉴定图。
[0030] 序列表信息：
[0031] SEQIDN0 :1 :gp64 信号肽基因上游引物 gp64-SP-F;<