br>[0032] SEQIDNO :2 :gp64 信号肽基因下游引物 gp64-SP-R;
[0033] SEQIDNO:3 :gp64 跨膜区基因上游引物 gp64-TM-F;
[0034] SEQIDNO :4 :gp64 跨膜区基因下游引物 gp64TM-R;
[0035] SEQIDNO :5 :DAF 蛋白基因上游引物 DAF-F ;
[0036] SEQIDNO :6 :DAF 蛋白基因下游引物 DAF-R ;
[0037] SEQIDNO :7 :CMV-IE 启动子序列上游引物 CMV-N2-F ;
[0038] SEQIDNO :8 :CMV-IE 启动子序列下游引物 CMV-N2-R ;
[0039] SEQIDNO :9 :DLL4 基因上游引物 DLL4-sall_F ;
[0040] SEQIDNO : 10 :DLL4 基因下游引物 DLL4-notl-R ;
[0041] SEQIDNO:11 :gp64 信号肽（SP)基因序列；
[0042] SEQIDNO:12 :gp64 跨膜区（TM)基因序列；
[0043] SEQIDNO:13 :DAF 蛋白基因序列；
[0044] SEQIDNO:14 :CMV_IE 启动子序列；
[0045] SEQIDNO:15 :DLL4 基因序列；
[0046] SEQIDNO : 16 :Kozaka 序列。
【具体实施方式】
[0047] 以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本 发明所使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
[0048] 本发明利用重叠PCR技术将DAF蛋白和gp64蛋白的信号肽与跨膜区结构域连接 在一起，以及CMV-IE启动子和DLL4蛋白连接在一起，构建一个表面展示DAF蛋白的杆状病 毒载体，能在哺乳动物细胞内高效表达DLL4蛋白。
[0049] 以下结合实施例详细阐述本发明的具体内容。
[0050]1、本实施例涉及的引物及Kozaka序列，均根据NCBI数据库获得基因序列信息，用 PremerPrimer5. 0软件设计引物，然后由北京华大基因有限公司合成。
[0051] 2、材料：
[0052] 载体Pfastbacdual购自Invitrogen公司，载体PEGFP_N 2购自天津耀宇生物技术 有限公司，载体PMD18-T-DLL4购自北京义翘神州生物技术有限公司，野生杆状病毒基因组 购自Invitrogen公司，人源cDNA序列（HG10171-M)购自北京义翅神州生物技术有限公司， DHlOBac细胞、TG1细胞由浙江理工大学舒特俊老师提供，BmN细胞由中国科学院上海生物 化学研究所吴祥甫研究员提供，C57BL/6小鼠由中国军事医学科学院动物研究中心提供。
[0053] 3、主要试剂：
[0054] Phusicn 高保真 DNA 聚合酶、各类内切酶、LigationHighDNA 连接酶、TurboFectTM 体外转染试剂购自Fermentas公司，实时突光定量PCR试剂盒购自Roche公司，病毒基因组 提取试剂盒购自Sigma公司，DLL4蛋白购自北京亿翘神舟科技有限公司，其它使用到的试 剂均属于普通市售生物实验试剂。
[0055] 实施例1:杆状病毒pFastBacDual-CMV-DLL4_DAF的构建及获得
[0056] 1. 1从野生杆状病毒基因组中PCR扩增gp64信号肽（SP)和跨膜区（TM)
[0057]以 gp64-SP-F (SEQIDN0 :1 所示）、gp64-SP-R (SEQIDN0 :2 所示)为引物，以野生杆 状病毒基因组为模板，进行PCR扩增，得到gp64信号肽（SP)的基因序列如SEQIDN0 :11所 示。其中：
[0058] gp64-SP-F:5' 一 AGTAGGATCCATGGTAGGCGCTATTG - 3'
[0059] gp64-SP-R:5,一CTCGGCCGCGCGACGGTCGCCGCAAAGGCA - 3，
[0060] PCR反应体系：
【主权项】
1. 一种重组杆状病毒Bm-CMV-DLL4_DAF，其特征在于：以杆状病毒表达载体 Pfastbacdual为载体，包含有CMV-IE启动子、DLL4基因、gp64信号肽基因、DAF蛋白基因 以及gp64跨膜区基因，其中gp64信号肽基因、gp64跨膜区基因分别连接在DAF蛋白基因 的5'端和3'端。
2. 权利要求1所述的一种重组杆状病毒Bm-CMV-DLL4-DAF的制备方法，其特征在于包 括以下步骤： (1) 以CMV-N2-F(SEQIDNO:7 所示)、CMV-N2-R(SEQIDNO:8 所示）为引物，以PEGFP-N2 载体为模板，由PCR扩增方法得到CMV-IE启动子序列（SEQIDNO:14所示)，然后以EcoRl和 Sail为酶切位点连接到Pfastbacdual载体中，得到Pfastbacdual-CMV重组质粒； (2) 以DLL4-sall-F(SEQIDNO:9 所示）、DLL4-notl-R(SEQIDNO:10 所示）为引物， 以PMD18-T-DLL4载体为模板，由PCR扩增方法得到DLL4蛋白基因（SEQIDNO:15所示)， 然后在DLL4蛋白基因的起始密码子前加入一段Kozaka序列（SEQIDNO: 16所示)，将得 到的连接片段以Sail和Notl为酶切位点连接到Pfastbacdual-CMV重组质粒中，得到 Pfastbacdual-CMV_DLL4 重组质粒； (3) 以gp64-SP-F(SEQIDNO:1 所示）、gp64-SP-R(SEQIDNO:2 所示）为引物，以野生 杆状病毒基因组为模板，由PCR扩增方法得到gp64信号肽基因序列（SEQIDNO:11所示）； 以gp64-TM-F(SEQIDNO:3所示）、gp64TM-R(SEQIDNO:4所示）为引物，以野生杆状病毒基 因组为模板，由PCR扩增方法得到gp64跨膜区基因序列（如SEQIDNO:12所示）；以DAF-F (SEQIDNO:5所示)、DAF-R(SEQIDNO:6所示）为引物，以人源cDNA序列为模板，由PCR扩增 方法得到DAF蛋白基因序列（SEQIDNO: 13所示）； (4) 用重叠PCR的方法将gp64信号肽基因序列和DAF蛋白基因序列进行重叠拼接，得 到SP-DAF片段，用重叠PCR的方法将SP-DAF片段与gp64跨膜区基因序列进行重叠拼接， 得到SP-DAF-TM片段； (5) 以SamI和Xholl为酶切位点，将SP-DAF-TM片段连接到Pfastbacdual-CMV-DLL4 重组质粒中，得到Pfastbacdual-CMV-DLL4_DAF重组质粒； (6) 将？€&8让&〇(1皿1-01^-01^4-04?重组质粒转化011108 &(3感受态细胞，经蓝白斑筛选 获得Bacmid-CMV-DLL4-DAF; (7) 将Bacmid-CMV-DLL4-DAF转染BmN细胞，使72小时发病，提取病毒基因组，获得重 组杆状病毒Bm-CMV-DLL4-DAF。
3. 权利要求1所述的一种重组杆状病毒Bm-CMV-DLL4-DAF在癌症疫苗制备中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种家蚕重组杆状病毒Bm-CMV-DLL4-DAF，它以杆状病毒表达载体Pfastbacdual为载体，包含有CMV-IE启动子、DLL4基因、gp64信号肽基因、DAF蛋白基因以及gp64跨膜区基因。制备步骤包括：PCR扩增CMV-IE启动子序列、DLL4蛋白基、gp64信号肽基因序列、gp64跨膜区基因序列、DAF基因序列，构建Pfastbacdual-CMV-DLL4-DAF重组质粒，提取病毒基因组。该家蚕重组杆状病毒稳定性好，宿主感染率高，表达能力强，能在哺乳动物细胞内高效表达DLL4蛋白，从而激起较强而有效的免疫反应，适用于应用在癌症疫苗制备中。
【IPC分类】A61K48-00, A61P35-00, C12N15-66, C12N15-866
【公开号】CN104694574
【申请号】CN201310656615
【发明人】张耀洲, 张皓, 陈剑清, 舒特俊
【申请人】特菲(天津)生物医药科技有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年12月5日