用于产生诱导的多能干细胞的组合化学遗传方法
【专利说明】用于产生诱导的多能干细胞的组合化学遗传方法
[0001] 本申请是国际申请号PCT/US2009/037429,国际申请日2009年3月17日，进入中 国国家阶段日期为2010年11月16日，中国申请号200980117686. X，发明名称为"用于产 生诱导的多能干细胞的组合化学遗传方法"的分案申请。
[0002] 对相关专利申请的交叉参考
[0003] 本申请要求于2008年3月17日提交的美国临时专利申请号61/069, 956和于2008 年10月31日提交的61/197, 986的优先权利益，通过参考将其结合于此。
[0004]发明背景
[0005] 干细胞通常分类为全能的或多能的。全能干细胞具有完全的分化潜力：它产生体 内全部不同类型的细胞。受精卵细胞是全能干细胞的实例。多能干细胞可以在体内产生源 自三个主要生殖细胞层或其胚胎的任一细胞类型。
[0006] 多能干细胞，诸如胚胎干细胞（ESCs)，快速增殖，同时保持多能性，即分化为多种 细胞类型的能力。胚胎干细胞是对于细胞移植治疗有前景的供体来源。然而，人ESC还 与关于人胚胎使用的伦理问题和异源移植后的排斥反应有关。通过直接由患者体细胞产 生多能干细胞来克服这些问题是可能的。体细胞核通过与ESCs融合获得胚胎干样状态， 这提示"多能性诱导"因子的存在。以前的研宄近期已经显示，反转录病毒介导的将在 ESCs中高度表达的四种转录因子（Oct-3/4, Sox2, KLF4和c-Myc)转染进入小鼠成纤维 细胞导致诱导的多能干（iPS)细胞的产生。参见Takahashi，K.&Yamanaka，S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors(通过确定的因子由小鼠胚胎和成熟成纤维细胞培养物中诱导 多能干细胞）? Cell (细胞）126,663-676(2006) ;0kita，K.，Ichisaka，T. &Yamanaka， S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells (产生种系 能性诱导的多能干细胞）.Nature (自然）448, 313-317 (2007) ;Wernig，M.等 In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state (体外重编 程成纤维细胞进入多能ES-细胞样状态）.Nature (自然）448, 318-324 (2007) Waherali， N.等 Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution(直接重编程的成纤维细胞显示整体外遗传重建和普 遍的组织贡献）.Cell Stem Cell (细胞干细胞）1，55-70 (2007) ;Meissner，A.，Wernig， M. &Jaenisch? R. Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent stem cells (将未遗传修饰的成纤维细胞直接重编程为多能干细胞）.Nature Biotechnol(自然生物技术）25,1177-1181 (2007) ;Takahashi，K?等 Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors (通过石角 定的因子由成熟的人成纤维细胞诱导多能干细胞）.Cell (细胞）131,861-872(2007) ;Yu， J.等，Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells (源 自人体细胞的诱导的多能干细胞系）.Science(科学）318,1917-1920(2007) ;Nakagawa， M.等 Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts (在无Myc的条件下由小鼠和人成纤维细胞产生诱导的多能干细 胞）Nature Biotechnol(自然生物技术）26,101-106 (2007);Wernig，M.，Meissner，A.，Cassady,J. P. &Jaenisch,R. c~Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts (c-Myc对于小鼠成纤维细胞直接重编程不是必要的）.Cell Stem Cell(细胞 干细胞）2,10-12 (2008)。iPS细胞在形态学、增殖、和多能性方面类似于ESCs，这通过畸胎 瘤形成和嵌合体贡献来判断。
[0007] 近期在将小鼠和人体细胞重编程为诱导的多能干（iPS)细胞中使用确定的遗传 操作，即在小鼠或人胚胎干（ES)细胞中高度和/或特异性表达的少数基因的病毒转导的突 破已经揭示了大量在无常规人ES细胞相关争议的条件下产生用于不同应用（例如，基于 细胞的治疗或药物发现）的患者特异性干细胞，以及研宄外遗传反转过程的机会。iPS-细 胞方法的最终临床应用应该在很大程度上需要定向分化人PS细胞以产生谱系特异性细胞 类型的同源群体以及消除与当前遗传操作的iPS-细胞缺陷和低效率/慢动力学相关的风 险。近期的研宄已经显示以前需要的四种基因之一，cMyc，对于在产生iPS细胞中过表达 不是必须的° 参见，Nakagawa，M.等，Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts (在无 Myc 条件下由小鼠和人成纤维 细胞产生诱导的多能干细胞）Nature Biotechnol(自然生物技术）26，101-106(2007); ffernig, M. , Meissner, A. ,Cassady,J. P. &Jaenisch,R. c~Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts (c_Myc对于小鼠成纤维细胞直接重编程不是必要 的）.Cell Stem Cell (细胞干细胞）2,10-12 (2008)。然而，在缺乏cMyc条件下，重编程效 率随着也慢得多的重编程动力学而充分减小。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明提供用于筛选诱导哺乳动物细胞重编程或去分化成为多能干细胞的试剂 的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：
[0010] a)将Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的至少一种，但非全部引入非多 能细胞中，以产生转染的细胞；
[0011] b)使所述转染的细胞与不同试剂文库相接触；
[0012] C)针对多能干细胞特征筛选所接触的细胞；和
[0013] d)使干细胞特征的形成与来自所述文库的特定试剂相关联，由此鉴定刺激细胞去 分化成为多能干细胞的试剂。
[0014] 在一些实施方案中，步骤a)包括将一个或多个用于表达Oct多肽、Klf多肽、Myc 多肽、和Sox多肽中的至少一种，但非全部的表达盒引入所述非多能细胞。
[0015] 在一些实施方案中，步骤a)包括将外源Oct多肽、外源Klf?多肽、外源Myc多肽、 和外源Sox多肽中的至少一种，但非全部引入所述非多能细胞。
[0016] 在一些实施方案中，所述特定试剂在50-1500道尔顿之间。
[0017] 在一些实施方案中，步骤a)包括将两个表达盒引入所述细胞，其中每个表达盒包 括编码不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白选自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多 肽组成的组，且不将所述组的其余成员引入所述细胞内。
[0018] 在一些实施方案中，步骤a)包括将三个表达盒引入所述细胞，其中每个表达盒包 括编码不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白选自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多 肽组成的组，且不将所述组的其余成员引入所述细胞内。
[0019] 在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是非人哺乳 动物细胞。在一些实施方案中，所述非多能细胞是祖细胞。在一些实施方案中，所述祖细胞 是神经祖细胞、皮肤祖细胞或毛囊祖细胞。
[0020] 在一些实施方案中，所述Oct多肽是0ct4,所述Klf多肽是Klf 4,所述Myc多肽 是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
[0021] 本发明还提供筛选具有多能干细胞特征的哺乳动物细胞的方法。在一些实施方案 中，所述方法包括：
[0022] a)使细胞与MAPK/ERK激酶（MEK)抑制剂相接触，从而抑制非多能细胞生长并促进 多能干细胞生长；和
[0023] b)针对多能干细胞特征筛选所接触的细胞。
[0024] 在一些实施方案中，所述方法包括：
[0025] 在步骤a)之前，使所述细胞与试剂文库相接触；
[0026] 和，在步骤b)之后，基于步骤b)的结果筛选诱导多能干细胞的试剂。
[0027] 在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是小鼠、狗、 牛、猪、大鼠和非人灵长类动物细胞。
[0028] 在一些实施方案中，所述MEK抑制剂是ro〇325901。
[0029] 本发明还提供用由哺乳动物非多能细胞生成诱导的多能干细胞的方法。在一些实 施方案中，所述方法包括：
[0030] a)将Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的一种或多种引入至所述非多 能细胞中；
[0031] b)使所述细胞与抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂相接触，由此生成 诱导的多能干细胞。
[0032] 在一些实施方案中，步骤a)包括使所述非多能细胞与一种或多种选自Klf多肽、 Oct多肽、Myc多肽、和Sox多肽的外源多肽相接触。在一些实施方案中，步骤a)包括以下 的至少两个（例如，2, 3,4, 5,或更多个）循环：
[0033] i.使所述非多能细胞与一种或多种选自Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox多 肽的外源多肽相接触；
[0034]ii.随后在缺乏所述外源多肽的条件下培养所述细胞。
[0035] 在一些实施方案中，步骤a)包括将用于表达Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox 多肽的一个或多个表达盒引入至所述非多能细胞中。
[0036] 在一些实施方案中，所述方法还包括针对多能干细胞特征筛选相接触的细胞。
[0037] 在一些实施方案中，将用于表达Oct多肽的表达盒和用于表达Sox多肽的表达盒 引入至所述非多能细胞中。
[0038] 在一些实施方案中，所述引入步骤包括向所述非多能细胞中引入一个或多个用于 表达KLF多肽和Oct多肽的表达盒，其中用于Myc多肽和/或Sox多肽的表达盒不引入至 所述细胞中。
[0039] 在一些实施方案中，所述Klf多肽是Klf4且所述Oct多肽是0ct4。
[0040] 在一些实施方案中，所述非多能细胞是体细胞。
[0041] 在一些实施方案中，所述非多能细胞是成纤维细胞。
[0042] 在一些实施方案中，用于表达Myc多肽的表达盒或用于表达Klf多肽的表达盒均 不引入所述非多能细胞。
[0043] 在一些实施方案中，所述引入步骤在体内进行。在一些实施方案中，所述引入步骤 在体外进行。
[0044] 在一些实施方案中，所述方法还包括，
[0045] c)选择表现出多能干细胞特征的细胞。
[0046] 在一些实施方案中，所述非多能细胞获自动物；且所述诱导的多能干细胞分化为 所需的细胞类型。
[0047] 在一些实施方案中，将所述所需的细胞类型引入至动物中。在一些实施方案中，所 述动物是人。在一些实施方案中，所述动物是非人动物。
[0048] 在一些实施方案中，所选择的细胞不包括用于表达0ct4的外源表达盒。
[0049] 在一些实施方案中，所述试剂抑制H3K9甲基化。在一些实施方案中，抑制H3K9甲 基化的试剂是BIX01294。
[0050] 在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是小鼠细 胞。在一些实施方案中，所述非多能细胞是祖细胞。在一些实施方案中，所述祖细胞是神经 祖细胞。
[0051] 在一些实施方案中，所述引入步骤包括引入下述：
[0052] 第一载体，其包含与第一表达盒可操作相连的启动子，所述第一表达盒包括编码 Klf4的多核苷酸；
[0053] 第二载体，其包含与第二表达盒可操作相连的启动子，所述第二表达盒包括编码 Sox2的多核苷酸；和
[0054] 第三载体，其包含与第三表达盒可操作相连的启动子，所述第三表达盒包括编码 c-Myc的多核苷酸。
[0055] 在一些实施方案中，所述载体是反转录病毒载体、慢病毒（lentiviral)载体、腺 病毒载体、标准非病毒质粒、或附加型表达载体。
[0056] 本发明还包括哺乳动物细胞和抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂的混 合物，其中所述细胞表达Oct多肽、Klf多肽、Sox多肽、和Myc多肽中的至少一种或多种； 和/或与外源Oct多肽、外源Klf多肽、外源Sox多肽、和外源Myc多肽中的至少一种或多 种相接触。
[0057] 在一些实施方案中，所述细胞包括第一、第二和第三重组表达盒，所述第一表达盒 包括与编码Klf?多肽的多核苷酸可操作相连的启动子，所述第二表达盒包括与编码Sox多 肽的多核苷酸可操作相连的启动子；且所述第三表达盒包括与编码Myc多肽的多核苷酸可 操作相连的启动子。
[0058] 在一些实施方案中，所述试剂抑制H3K9甲基化。在一些实施方案中，抑制H3K9甲 基化的试剂是BIX01294。
[0059] 在一些实施方案中，所述细胞包括一种或多种反转录病毒质粒、慢病毒质粒、腺病