还表明可以鉴定代替以前证明是多能干细胞诱导所必需的转录因子的小分子。这可以是特 别令人感兴趣的，其中目的是将诱导的多能干细胞，或随后分化的细胞，诸如源自iPS细胞 的祖细胞引入（或再引入）至患者中。因为这四种iPS转录因子中的数种（例如，0ct4， Myc)具有已知的致癌活性，所以用其他较小致癌性或非致癌性分子代替这些因子可能是有 益的。此外，用不需要转化的小分子代替这四种因子中的一些或每一种（且由此DNA的潜 在致癌作用插入染色体）应该进一步有助于减少涉及iPS的治疗可能的癌症副作用。
[0378] 本发明还提供诱导的多能细胞，其中至少一些iPS转录因子以内源性或更低水平 表达，然而是多能性的。本发明部分地基于这样的发现，即某些内源性表达Sox2的细胞可 以通过仅引入和异源表达0ct4和Klf4来诱导多能性。
[0379] 此外，如本文中所示，不内源或异源表达Sox多肽（例如，Sox2)的非多能细胞可以 利用本发明的方法来诱导多能性。例如，多能性可以通过仅将0ct4和Klf4引入至非多能细 胞（例如，成纤维细胞）来诱导，所述非多能细胞也与抑制H3K9甲基化的试剂相接触，且任 选地也与下述中的至少一种相接触：L-型钙通道激动剂，cAMP途径活化剂，DNA甲基转移酶 (DNMT)抑制剂，核受体激动剂，GSK3抑制剂，或MEK抑制剂。本发明人还已经发现试剂组合 诸如GSK抑制剂和HDAC抑制剂；或GSK抑制剂和cAMP途径活化剂；或GSK抑制剂和ALK5 抑制剂（有或无G9a抑制剂）在异源性表达单独的0ct4,或0ct4/Sox2或Sox2/Klf4的细 胞中有效诱导多能性。因此，本发明提供细胞和试剂的混合物，其中所述细胞最初不是多能 细胞（例如，是非干细胞）且任选地异源或内源性表达0ct4和/或Klf4或否则与0ct4和 /或Klf4接触（in intact with)，且其中所述试剂是下列中的一种或多种试剂：抑制H3K9 甲基化的试剂，L-型Ca通道激动剂；cAMP途径活化剂；DNA甲基转移酶（DNMT)抑制剂；核 受体配体；GSK3抑制剂；MEK抑制剂，TGF 0受体/ALK5抑制剂，HDAC抑制剂；和/或Erk抑 制剂。
[0380] 如下文中进一步讨论地，本发明还提供筛选具有多能干细胞特征的细胞的新方 法，其通过以下步骤实现：用MEK抑制剂，抑制H3K9甲基化的试剂，L-型Ca通道激动剂； cAMP途径活化剂；DNA甲基转移酶（DNMT)抑制剂；核受体配体；GSK3抑制剂；MEK抑制剂， TGF0受体/ALK5抑制剂，HDAC抑制剂；或Erk抑制剂培养待筛选细胞。MEK抑制剂，例如， 抑制非iPS细胞生长，同时促进iPS细胞生长和稳定性重编程，由此富集关于具有多能干细 胞特征的细胞的特定细胞混合物。
[0381] II.多能干细胞的诱导
[0382] A?异源/内源表达
[0383] 在本发明的一些实施方案中，鉴定内源性表达来自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多 肽、和Sox多肽组成的组的至少一种（且任选地，2或3种）蛋白的非多能细胞。然后，来自 该组的其余（非内源性表达的）蛋白可以在所述细胞中异源性表达，且筛选获得重编程和 /或去分化为多能细胞，任选地在存在下列中一种或多种的条件下：MEK抑制剂，抑制H3K9 甲基化的试剂，L-型Ca通道激动剂；cAMP途径活化剂；DNA甲基转移酶（DNMT)抑制剂；核 受体配体；GSK3抑制剂；MEK抑制剂，TGF 0受体/ALK5抑制剂，HDAC抑制剂；和/或Erk抑 制剂。
[0384] 认为可以筛选任何类型的哺乳动物非多能细胞，以获得蛋白表达和随后转变为多 能细胞。在一些实施方案中，起始细胞是分离的祖细胞。示例性祖细胞包括，但不仅限于， 内胚层祖细胞、中胚层祖细胞（例如，肌肉祖细胞、骨骼祖细胞、血液祖细胞）、和外胚层祖 细胞（例如，表皮组织祖细胞和神经祖细胞）。有效用于本发明这些方面的细胞可以通过针 对Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽的表达筛选细胞系，或通过鉴定具有减小的启 动子甲基化的细胞（例如，通过DNA亚硫酸氢盐测序法）或通过鉴定具有修饰的组蛋白状 态以确定这些基因降低的沉默状态来容易地鉴定。然后，不内源表达的转录因子可以异源 表达，以在不异源表达已经内源表达的那些因子的条件下诱导多能性。
[0385] 如实施例中所示，一些细胞（例如，神经祖细胞和成纤维细胞（数据未显示））可 以通过仅异源表达0ct4和Klf4来诱导多能性。这证明Sox和Myc蛋白，且可能的Oct和 Klf蛋白，不需要都被过表达（例如，使用高表达病毒载体）来获得多能性。相反，这些蛋 白中的一些可以以内源性或甚至更低的可检测水平来表达，且仍适合通过异源表达该组中 其他成员转变为多能细胞。因此，在本发明的一些实施方案中，鉴定内源性表达Sox多肽和 /或Myc多肽的细胞，且Oct多肽和Klf多肽在该细胞内异源性表达，由此诱导该细胞转变 为多能细胞。在一些实施方案中，鉴定内源性表达Oct多肽和/或Klf多肽和/或Myc多 肽的细胞，且Sox多肽在该细胞内异源性表达，由此诱导该细胞转变为多能细胞。任选地， Sall4(Zhang等，Nat Cell Biol?(自然细胞生物学）8(10) :1114-23(2006))可以替换任一 或全部的Myc、Klf4、和Sox2进行表达。
[0386] 诱导本文中所述的多能性的效率可以通过在非多能细胞内含例如UTF1，SV40， TERT中一种或多种（通过引入编码这些基因产物的表达盒，或通过使所述细胞与蛋白本身 相接触）和/或通过减少P53表达（例如，通过siRNA)来进一步提高。参见，例如，Zhao， 等，Cell Stem Cell (细胞干细胞）3:475-479 (2008)。
[0387] B.转录因子蛋白
[0388] 如本文中详述地，本发明的许多实施方案涉及将一种或多种多肽引入至细胞中， 由此在该细胞中诱导多能性。如上讨论地，将多肽引入至细胞可以包括将包括一个或多个 表达盒的多核苷酸引入至细胞中和诱导表达，由此将所述多肽通过由所述表达盒的转录和 翻译引入至细胞中。备选地，可以通过许多不同的方法将外源多肽（即，由细胞外提供的和 /或不由细胞产生的蛋白）引入至细胞中，所述方法不涉及引入编码所述多肽的多核苷酸。
[0389] 因此，关于本文中所述的提到将多肽引入细胞，或将编码多肽的表达盒引入细胞 的本发明任一实施方案，应该理解本发明还明确地提供将多肽作为蛋白外源引入至细胞 中。因此，在一些实施方案中，哺乳动物非多能细胞通过以下来诱导多能性：a)将Klf多肽、 Oct多肽、Myc多肽、和/或Sox多肽中一种或多种外源性引入至非多能细胞中；和任选地 b)使细胞与MEK抑制剂，抑制H3K9甲基化的试剂，L-型Ca通道激动剂；cAMP途径活化剂； DNA甲基转移酶（DNMT)抑制剂；核受体配体；GSK3抑制剂；MEK抑制剂，TGF0受体/ALK5 抑制剂，HDAC抑制剂；或Erk抑制剂中的一种或多种相接触，由此生成诱导的多能干细胞。
[0390] 在一些实施方案中，在本发明的一些实施方案中，鉴定内源性表达来自由Oct多 肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽组成的组中的至少一种（且任选地，2或3种）蛋白的 非多能细胞。然后来自该组的其余（非内源性表达的）蛋可以外源性引入至该细胞内，并 筛选重编程和/或去分化为多能细胞，任选地，在存在下列中的一种或多种的条件下：MEK 抑制剂，抑制H3K9甲基化的试剂，L-型Ca通道激动剂；cAMP途径活化剂；DNA甲基转移酶 (DNMT)抑制剂；核受体配体；GSK3抑制剂；MEK抑制剂，TGF0受体/ALK5抑制剂，HDAC抑 制剂；或Erk抑制剂。
[0391] 在一些实施方案中，鉴定这样的细胞，即内源性表达Sox多肽和/或Myc多肽，且 作为第二步将Oct多肽和Klf多肽外源性引入至该细胞中，由此诱导该细胞转变为多能细 胞。在一些实施方案中，鉴定这样的细胞，即内源性表达Oct多肽和/或Klf多肽和/或 Myc多肽，且将Sox多肽外源性引入至该细胞中，由此诱导该细胞转变为多能细胞。
[0392] 向细胞中外源性引入多肽可以以许多方式发生。一种或多种蛋白可以简单地在靶 细胞存在下，在容许将该蛋白引入细胞内的条件下进行培养。在一些实施方案中，外源蛋白 包括目的转录因子多肽，其与增强该转录因子进入细胞（且任选地细胞核）的能力的多肽 相连（例如，作为融合蛋白相连或另外共价或非共价相连）.
[0393] 增强跨膜转运的多肽序列的实例包括，但不仅限于，果蝇同源异型蛋白触角 足转录蛋白（AntHD)(Joliot 等，New Biol?(新生物学）3:1121_34，1991;Joliot 等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院学报），88 :1864-8,1991 ;Le Roux 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院学报），90 :9120-4,1993)，单纯疱瘆病毒结构蛋白 VP22 (Elliott 和 O'Hare，Cell (细胞）88 :223-33,1997) ;HIV-1 转录活化 TAT 蛋白（Green 和 Loewenstein，Cell(细胞）55 :1179-1188，1988 ;Frankel 和 Pabo, Cell(细胞）55 : 1289-1193,1988);递送增强转运蛋白诸如美国专利号6, 730, 293中记述的（包括但不仅 限于包括至少7-25个连续的精氨酸的的肽序列）；和可商购的Penetratin? 1肽，和可获 自法国巴黎的Daitos S.A?的VcctOCCll?平台的Diatos肽载体（"DPVs")。还参见， W0/2005/084158和W0/2007/123667和其中记述的其他转运蛋白。不仅这些蛋白可以穿过 质膜，而且其他蛋白，诸如本文中所述的转录因子的附着足以刺激细胞吸收这些复合物。
[0394] 在一些实施方案中，本文中所述的转录因子多肽作为脂质体，或脂质混合物诸如 可商购的Fugene6和Lipofectamine的一部分外源性引入。在另一种备选方案中，转录因 子蛋白可以显微注射或另外直接引入到靶细胞中。
[0395] 如实施例中所讨论地，本发明人已经发现，用本发明的转录因子多肽温育细胞一 段延长的时期对该细胞有毒。因此，本发明用Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和/或Sox多 肽中的一种或多种间歇性温育非多能哺乳动物细胞，介于细胞温育之间的使其缺乏所述一 种或多种多肽。在一些实施方案中，使用和不用所述多肽的温育周期可以重复2,3,4,5,6， 或更多次，且进行足够长时间（即，使用和不用所述蛋白的温育），从而实现多能细胞的发 育。可以包括不同试剂（例如，MEK抑制剂和/或GSK抑制剂和/或TGF 0抑制剂），以提 高本方法的效率。
[0396] C. iPS转录因子的小分子替代
[0397] 在本发明的一些实施方案中，细胞表达（内源或异源表达）选自Oct多肽、Klf?多 肽、Myc多肽、和Sox多肽中的至少一种蛋白（例如，这些中的至少1，2,或3种）并与至少 一种试剂相接触，其中所述试剂足以导致该细胞在不表达其余不表达蛋白中的一种或多种 (即不在该细胞中表达的Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、或Sox多肽中的任一种）的条件下 诱导为多能干细胞。
[0398] 如实施例中所示，细胞与某些试剂相接触可以"补偿"或替代为了产生多能细胞通 常另外必需表达这些蛋白之一的理解。通过使细胞与在功能上替代以上所列蛋白之一的表 达的试剂相接触，可能产生表达除被该试剂替代或补偿的蛋白以外的全部以上所列蛋白的 多能细胞。其余蛋白可以内源地、异源地、或以二者的一些组合表达（例如，Sox和Myc多 肽可以内源表达，Klf多肽可以异源表达，且相反，Oct多肽可以通过使细胞与补偿试剂诸 如抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂相接触来"替代"）。
[0399] 此外，小分子可以提高用于产生多能细胞（例如，iPS细胞）的方法的效率。例如， 提高的效率可以通过加速产生所述多能细胞的时间来证明（例如，通过与不用所述小分子 的相似或相同方法相比，将发育多能细胞的时间缩短至少一天）。备选地，或组合地，小分子 可以增加由特殊方法产生的多能细胞数量（例如，与不用所述小分子的相似或相同方法相 比，增加给定时期内的数量至少10 %，50 %，100 %，200 %，500 %等）。
[0400] 如实施例中所述，异源性表达Klf4、Sox2、和Myc的细胞可以通过在无0ct4异源 表达的条件下使该细胞与抑制H3K9甲基化的试剂相接触来诱导多能性。实际上，已经发现 多能性可以通过使非多能细胞与抑制H3K9甲基化的试剂相接触和引入单独的Oct 4(例 如，也不引入用于表达Myc多肽、Sox多肽、或Klf多肽的载体）或0ct4与Klf4来诱导。 可以诱导多能性的细胞包括，但不仅限于，神经祖细胞和成纤维细胞。抑制H3K9甲基化的 试剂包括抑制靶向H3K9的甲基化酶（也称为甲基转移酶）的试剂。例如，G9a组蛋白甲 基转移酶使H3K9甲基化，且已知对G9a组蛋白甲基转移酶的抑制减少H3K9的甲基化。参 见，例如，Kubicek，等，Mol. Cell (分子细胞）473-481 (2007)。根据本发明的方法有效使用 的G9a组蛋白甲基转移酶的实例是BIX01294(参见，例如，Kubicek，等，Mol. Cell (分子细 胞）473-481 (2007))，或其盐、水合物、同种型、消旋体、溶剂化物和前体药物形式。Bix01294 显示如下：
【主权项】
1. 一种由哺乳动物非多能细胞生成诱导的多能干细胞的方法，所述方法包括： a)使所述细胞与以下至少一种相接触： 抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂； L-型Ca通道激动剂；cAMP途径活化剂； DNA甲基转移酶（DNMT)抑制剂； 核受体配体； GSK3抑制剂； MEK抑制剂； TGF0受体/ALK5抑制剂； HDAC抑制剂；和erk抑制剂， 由此生成诱导的多能干细胞。
2. 权利要求1的方法，其中所述接触步骤包括： a) 使所述细胞与以下至少两种相接触： i.抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂；和ii选自由以下组成的组的试剂： L-型Ca通道激动剂；cAMP途径活化剂； DNA甲基转移酶（DNMT)抑制剂； 核受体配体； GSK3抑制剂； MEK抑制剂； TGF0受体/ALK5抑制剂； HDAC抑制剂；和erk抑制剂。
3. 权利要求1或2的方法，其还包括： b) 将用于表达Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和/或Sox多肽的一个或多个表达盒引 入所述非多能细胞中。
4. 权利要求3的