方法，其中将Klf4和Oct4引入所述细胞中。
5. -种由哺乳动物非多能细胞生成诱导的多能干细胞的方法，所述方法包括： a) 向所述非多能细胞中引入Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的一种或多 种的表达或修饰Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的一种或多种的表达； b) 使所述细胞与抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂相接触，由此生成诱导 的多能干细胞。
6. 权利要求5的方法，其中所述步骤a)包括使所述非多能细胞与选自Klf多肽、Oct 多肽、Myc多肽、和Sox多肽的一种或多种外源多肽相接触。
7. 权利要求6的方法，其中所述步骤a)包括以下至少2个循环： i.使所述非多能细胞与选自Klf多肽、Oct多肽、Myc多肽、和Sox多肽的一种或多种 外源多肽相接触； ii.随后在缺乏所述外源多肽的条件下培养所述细胞。
8. 权利要求5的方法，其中所述步骤a)包括将一个或多个用于表达Klf多肽、Oct多 肽、Myc多肽、和Sox多肽的表达盒引入至所述非多能细胞中。
9. 权利要求5的方法，其中将用于表达Oct多肽的表达盒和用于表达Sox多肽的表达 盒引入至所述非多能细胞中。
10. 权利要求5的方法，其中所述引入步骤包括向所述非多能细胞中引入一个或多个 用于表达KLF多肽和Oct多肽的表达盒，其中用于Myc多肽和/或Sox多肽的表达盒不引 入至所述细胞中。
11. 权利要求5中的方法，其中所述Klf多肽是Klf4且所述Oct多肽是0ct4。
12. 权利要求5的方法，其中所述非多能细胞是体细胞。
13. 权利要求5的方法，其中所述非多能细胞是成纤维细胞。
14. 权利要求5的方法，其中用于表达Myc多肽的表达盒和用于表达Klf多肽的表达盒 均不引入至所述非多能细胞中。
15. 权利要求5的方法，其中所述引入步骤在体内进行。
16. 权利要求5的方法，其中所述引入步骤在体外进行。
17. 权利要求5的方法，其还包括： c)选择表现出多能干细胞特征的细胞。
18. 权利要求5的方法，其中所述非多能细胞获自动物；且 所述诱导的多能干细胞分化为需要的细胞类型。
19. 权利要求18的方法，其中将所述需要的细胞类型引入至所述动物中。
20. 权利要求19的方法，其中所述动物是人。
21. 权利要求19的方法，其中所述动物是非人动物。
22. 权利要求17的方法，其中所选择的细胞不包括用于表达0ct4的外源表达盒。
23. 权利要求5的方法，其中所述试剂抑制H3K9甲基化。
24. 权利要求23的方法，其中抑制H3K9甲墓化的所述试剂是BIX01294。
25. 权利要求5的方法，其中所述细胞是人细胞。
26. 权利要求5的方法，其中所述细胞是小鼠、狗、牛、猪、大鼠和非人灵长类动物细胞。
27. 权利要求5的方法，其中所述非多能细胞是祖细胞。
28. 权利要求27的方法，其中所述祖细胞是神经祖细胞、皮肤祖细胞或毛囊祖细胞。
29. 权利要求5的方法，其中所述引入步骤包括引入下述： 第一载体，其包含与第一表达盒可操作相连的启动子，所述第一表达盒包括编码Klf4 的多核苷酸； 第二载体，其包含与第二表达盒可操作相连的启动子，所述第二表达盒包括编码Sox2 的多核苷酸；和 第三载体，其包含与第三表达盒可操作相连的启动子，所述第三表达盒包括编码c-Myc的多核苷酸。
30. 权利要求5的方法，其中所述载体是反转录病毒质粒、慢病毒质粒、腺病毒质粒、非 病毒质粒、或附加型表达载体。
31. -种筛选诱导哺乳动物细胞重编程或去分化成为多能干细胞的试剂的方法，所述 方法包括： a) 将Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽中的至少一种，但非全部引入至非多能 细胞中，以产生转染的细胞； b) 使所述转染的细胞与不同试剂的文库相接触； c) 针对多能干细胞特征筛选所接触的细胞；和 d) 使干细胞特征的形成与来自所述文库的特定试剂相关联，由此鉴定刺激细胞去分化 成为多能干细胞的试剂。
32. 权利要求31的方法，其中步骤a)包括将一个或多个用于表达Oct多肽、Klf多肽、 Myc多肽、和Sox多肽中的至少一种，但非全部的表达盒引入至所述非多能细胞中。
33. 权利要求31的方法，其中步骤a)包括将外源Oct多肽、外源Klf多肽、外源Myc多 肽、和外源Sox多肽中的至少一种，但非全部引入至所述非多能细胞中。
34. 权利要求31的方法，其中所述特定试剂在50-1500道尔顿之间。
35. 权利要求31的方法，其中步骤a)包括将两个表达盒引入所述细胞，其中每个表达 盒包括编码不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白选自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox 多肽组成的组，且所述组的其余成员不引入至所述细胞内。
36. 权利要求31的方法，其中步骤a)包括将三个表达盒引入所述细胞，其中每个表达 盒包括编码不同蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白选自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox 多肽组成的组，且所述组的其余成员不引入至所述细胞内。
37. 权利要求31的方法，其中所述细胞是人细胞。
38. 权利要求31的方法，其中所述细胞是非人哺乳动物细胞。
39. 权利要求31的方法，其中所述非多能细胞是祖细胞。
40. 权利要求40的方法，其中所述祖细胞是神经祖细胞、皮肤祖细胞或毛囊祖细胞。
41. 权利要求31的方法，其中所述Oct多肽是0ct4,所述Klf多肽是Klf4,所述Myc多 肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
42. -种筛选具有多能干细胞特征的哺乳动物细胞的方法，所述方法包括： a) 使细胞与MAPK/ERK激酶（MEK)抑制剂相接触，从而抑制非多能细胞生长并促进多能 干细胞生长；和 b) 针对多能干细胞特征筛选所接触的细胞。
43. 权利要求42的方法，其包括： 在步骤a)之前，使所述细胞与试剂文库相接触； 和，在步骤b)之后，基于步骤b)的结果筛选诱导多能干细胞的试剂。
44. 权利要求42的方法，其中所述细胞是人细胞。
45. 权利要求42的方法，其中所述细胞是小鼠、狗、牛、猪、大鼠和非人灵长类动物细 胞。
46. 权利要求42的方法，其中所述MEK抑制剂是H)0325901。
47. 哺乳动物细胞和抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂的混合物，其中所述 细胞： 表达Oct多肽、Klf多肽、Sox多肽、和Myc多肽中的至少一种或多种；和/或 与外源Oct多肽、外源Klf多肽、外源Sox多肽、和外源Myc多肽中的至少一种或多种 相接触。
48. 权利要求47的混合物，其中所述细胞包括第一、第二和第三重组表达盒， 所述第一表达盒包括与编码Klf?多肽的多核苷酸可操作相连的启动子， 所述第二表达盒包括与编码Sox多肽的多核苷酸可操作相连的启动子；和 所述第三表达盒包括与编码Myc多肽的多核苷酸可操作相连的启动子。
49. 权利要求47的混合物，其中所述试剂抑制H3K9甲基化。
50. 权利要求49的方法，其中抑制H3K9甲基化的试剂是BIX01294。
51. 权利要求47的混合物，其中所述细胞包括一种或多种反转录病毒质粒、慢病毒质 粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体，所述一种或多种反转录病毒质粒、慢病毒 质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体包括所述第一、第二和第三表达盒。
52. 权利要求51的混合物，所述混合物包括第一、第二和第三反转录病毒质粒、慢病毒 质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体， 所述第一反转录病毒质粒、慢病毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体 包括所述第一表达盒； 所述第二反转录病毒质粒、慢病毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体 包括所述第二表达盒；和 所述第三反转录病毒质粒、慢病毒质粒、腺病毒质粒、非病毒质粒、或附加型表达载体 包括所述第三表达盒。
53. 权利要求47的混合物，其中所述细胞是人细胞。
54. 权利要求47的混合物，其中所述细胞是小鼠、狗、牛、猪、大鼠和非人灵长类动物细 胞。
55. 权利要求47的混合物，其中所述细胞包括祖细胞。
56. 权利要求55的混合物，其中所述祖细胞是神经祖细胞、皮肤祖细胞或毛囊祖细胞。
57. 权利要求47的混合物，其中所述Klf多肽是Klf4,所述Myc多肽是c-Myc，且所述 Sox多肽是Sox2。
58. -种内源性表达选自由Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽组成的组的至少 一种蛋白的哺乳动物细胞， 其中： 所述细胞不内源性表达所述组中的至少一种蛋白，其中不内源性表达的蛋白由所述细 胞内存在的异源重组表达盒编码的RNA来表达， 所述细胞内源性或异源性表达Oct多肽、Klf多肽、Myc多肽、和Sox多肽的每一种；和 经由所述异源表达盒的蛋白表达导致所述细胞由非多能细胞重编程或去分化成为多 能干细胞。
59. 权利要求58的细胞，其中所述Oct多肽是Oct4,所述Klf多肽是Klf4,所述Myc 多肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
60. 权利要求58的细胞，其中所述细胞内源性表达Sox多肽和Myc多肽且异源性表达 Oct多肽和Klf多肽。
61. 权利要求60的细胞，其中所述Oct多肽是0ct4,所述Klf多肽是Klf4,所述Myc多 肽是c-Myc，且所述Sox多肽是Sox2。
62. -种诱导细胞中0ct4表达的方法，所述方法 使所述细胞与抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂相接触，由此诱导细胞中 的0ct4表达。
63. 权利要求62的方法，其中所述细胞在即将进行所述接触步骤前不表达0ct4。
64. 权利要求62的方法，其中相接触的细胞不是多能细胞。
65. 权利要求64的方法，其中所述细胞在所述接触步骤后诱导为多能性。
66. -种将非多能细胞诱导为多能细胞的方法，所述方法包括： 使所述非多能细胞与一种或多种诱导多能性的试剂相接触和/或将表达盒引入所述 细胞以表达诱导多能性的蛋白，其中所述细胞不在饲养细胞上培养且所述细胞附着于7体 培养物表面。
67. 权利要求66的方法，其中所述细胞通过分子粘连附着于固体培养物表面，所述分 子粘连选自由基质胶、细胞外基质（ECM)或ECM类似物、层粘连蛋白、纤连蛋白、和胶原蛋白 组成的组。
68. 权利要求66的方法，其中所述接触步骤包括权利要求5或引用权利要求5的权利 要求的步骤。
69. 哺乳动物细胞和以下至少两种的混合物： 抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂； L-型Ca通道激动剂； cAMP途径活化剂； DNA甲基转移酶（DNMT)抑制剂； 核受体配体； GSK3抑制剂； MEK抑制剂； TGF0受体/ALK5抑制剂； HDAC抑制剂；和erk抑制剂。
70. 权利要求69的混合物，其中所述混合物包括： i.抑制H3K9甲基化或促进H3K9去甲基化的试剂，和ii选自由以下组成的组的试剂： L-型Ca通道激动剂；cAMP途径活化剂； DNA甲基转移酶（DNMT)抑制剂； 核受体配体； GSK3抑制剂； MEK抑制剂， TGF0受体/ALK5抑制剂， HDAC抑制剂；和erk抑制剂。
71. 权利要求69的混合物，其中所述细胞包括用于表达Oct多肽的异源表达盒和用于 表达Sox多肽的异源表达盒。
72. 权利要求69的混合物，其中所述细胞是非多能细胞。
73. 权利要求69的混合物，其中所述细胞是成纤维细胞。
74. 权利要求71的混合物，其中用于表达Myc多肽的表达盒和用于表达Klf多肽的表 达盒均不引入至所述非多能细胞中。
75. -种组合物，其包括以下至少两种： 抑制H3K9甲基化的试剂； L-型Ca通道激动剂；cAMP途径活化剂； DNA甲基转移酶（DNMT)抑制剂； 核受体配体； GSK3抑制剂； MEK抑制剂， TGF0受体/ALK5抑制剂， HDAC抑制剂；和erk抑制剂。
76. 权利要求75的组合物，其包括： i.抑制H3K9甲基化的试剂，和 ii选自由以下组成的组的试剂： L-型Ca通道激动剂；cAMP途径活化剂； DNA甲基转移酶（DNMT)抑制剂； 核受体配体； GSK3抑制剂； MEK抑制剂， TGF0受体/ALK5抑制剂， HDAC抑制剂；和erk抑制剂。
77. 试剂盒，其包括以下至少两种： 抑制H3K9甲基化的试剂； L-型Ca通道激动剂；cAMP途径活化剂； DNA甲基转移酶（DNMT)抑制剂； 核受体配体； GSK3抑制剂； MEK抑制剂， TGF0受体/ALK5抑制剂， HDAC抑制剂；和 erk抑制剂。
78. 权利要求77的试剂盒，其包括： i.抑制H3K9甲基化的试剂，和 ii选自由以下组成的组的试剂： L-型Ca通道激动剂；cAMP途径活化剂； DNA甲基转移酶（DNMT)抑制剂； 核受体配体； GSK3抑制剂； MEK抑制剂， TGF0受体/ALK5抑制剂， HDAC抑制剂；和erk抑制剂。
79. 权利要求77的试剂盒，其还包括哺乳动物细胞。
【专利摘要】本发明提供在哺乳动物细胞内诱导多能性的小分子的鉴定和应用，以及诱导多能性的其他方法。
【IPC分类】C12N5-0797, C12N5-0789, C12N5-074, C12N5-10, C12N15-85, C12N5-0735, C12N5-071
【公开号】CN104694570
【申请号】CN201510084514
【发明人】师岩, 卡罗琳·德蓬, 丁生, 周宏彦, 林通翔, 李文林, 朱赛勇
【申请人】斯克里普斯研究所
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2009年3月17日
【公告号】CA2718904A1, CN102027105A, CN102027105B, EP2279243A2, EP2279243A4, US9068170, US20100233804, US20100267141, US20110110899, US20130273536, WO2009117439A2, WO2009117439A3