通过阅读整个本申请将清楚本发明的其他实施方案。
[0350] 附图简述
[0351] 图1.通过0ct4/Klf4病毒转导和BIX01294处理由确定的原代神经祖细胞 (primary neural progenitor cells)产生 iPS 细胞。在有或无 BIX01294 处理的条件下， 通过 0ct4/Klf4/Sox2/c_Myc，0ct4/Klf4/Sox2,或 0ct4/Klf4 的反转录病毒转导由 3. 5xl04 个原代0G2神经祖细胞产生的GFP+iPS细胞集落数量的比较。
[0352] 图2.通过Klf4/Sox2/c_Myc病毒转导和BIX01294处理由原代神经祖细胞产生 iPS细胞。在有或无BIX01294处理的条件下，通过Klf4/Sox2/c-Myc的反转录病毒转导由 3. 5xl04个原代OG2神经祖细胞产生的GFP+iPS细胞集落数量。
[0353] 图3.由原代OG2MEFs产生OK2B iPSCs。柱形图表示在3个独立实验中由OG2-MEFs 诱导的平均GFP+集落数量。该图显示关于用四种因子转导（Oct4，Klf4，Sox2,和cMyc ;4F); 用OK转导（OK);用OK转导并用1 yM处理BIX(OK+BIX);用OK转导并用1 yM BIX+2yM BayK处理（OK+BIX+BayK);用 OK 转导并用 lyM BIX+0.04yM RG108 处理（0K+BIX+RG108) 的0G2MEF细胞的数据，n = 3,误差条表示使用Excel计算的标准偏差。
[0354] 图4. 0K2B iPSC具有与mESCs之一类似的转录特征。（A)0K2B iPSCs的RT-PCR分 析说明它们表达特异于多能mESCs的基因。RlmESCs用作阳性对照，而0G2MEFS用作阴性对 照。GAPDH用作加样对照。（B)亚磷酸氢盐测序法揭示0K2B iPSCs的nanog启动子去甲基 化，进一步提示特异于mESCs的内源基因的再活化。示意性描述为进行该分析扩增的Nanog 启动子区域中存在的胞嘧啶。空心圆表示去甲基化的胞嘧啶，而实心圆/黑色圆表示甲基 化的胞嘧啶。
[0355] 图5.用BIX、BayK或二者的组合处理不增加mES细胞的增殖。散点图表示用 DMS0(对照），2yM BayK，lyM BIX和二者的组合（BayK+BIX)处理后的RlmES细胞数。n =3。误差条表示在Excel中计算的标准偏差。如在Excel中利用t检验计算的，对于各种 处理均没有获得与DMS0相比的显著差异。
[0356] 图6.化合物处理后关于Sox2表达的RT-PCR分析。OG2+/7R〇SA26+a (0G2)MEFs用 DMS0 (对照），1 y M BIX，2 y M BayK和二者的组合处理6天。然后利用Qiagen RNAeasy小 型试剂盒提取RNA。通过半定量PCR评估Sox2表达。0K2B iPSCs p37和R1用作阳性对照， GAPDH作为加样对照。
[0357] 定义
[0358] "Oct多肽"意指Octomer转录因子家族的任一天然存在成员，或其保留与最接近 的相关天然存在家族成员相比类似的转录因子活性（在至少50 %，80 %，或90 %活性之内） 的变体，或至少包括天然存在家族成员的DNA结合结构域，和任选包括转录活化结构域的 多肽。示范性Oct多肽包括，例如，0ct3/4(本文中称为"0ct4")，其包含P0U结构域。参 见 Ryan，A.K. &Rosenfeld，M.G. Genes Dev?(基因发育）11，1207-1225 (1997)。在一些实施 方案中，与天然存在Oct多肽家族成员诸如与以上列出的那些相比，变体在其整个序列上 具有至少90%的氨基酸序列同一性。
[0359] "Klf多肽"意指Krilppel样因子（Klfs)家族的任一天然存在成员，含有与果 幡（Drosophila)胚胎模式调控子KrUppel类似的氨基酸序列的锌指蛋白，或保留与最接 近相关的天然存在家族成员相比类似的转录因子活性（在至少50%，80%，或90%活性 之内）的变体，或至少包括天然存在家族成员的DNA结合结构域，和任选包括转录活化结 构域的多肽。参见，Dang，D.T.，Pevsner，J.&Yang，V.W.. Cell Biol.(细胞生物学）32， 1103-1121(2000)。示范性Klf家族成员包括，例如，Klf l、Klf4、和Klf5,其中每种均显示 能够彼此替换，以产生iPS细胞。参见，Nakagawa，等，Nature Biotechnology (自然生物技 术）26 :101-106 (2007)。在一些实施方案中，与天然存在Klf多肽家族成员诸如与以上列 出的那些相比，变体在其整个序列上具有至少90%的氨基酸序列同一性。就本文中描述的 KLF多肽而言，其可以用Essrb替换。因此，意图是对于本文中所述的各种Klf多肽实施方 案同等地描述Essrb替代Klf4多肽的应用。
[0360] "Myc多肽"意指Myc家族的任一天然存在成员（参见，例如Adhikary，S. &Eilers， M. Nat. Rev. Mol Cell Biol.(自然分子细胞生物学综述）6:635-645 (2005))，或其保留与最 接近相关的天然存在家族成员相比类似的转录因子活性（在至少50 %，80 %，或90 %活性 之内）的变体，或至少包括天然存在家族成员的DNA结合结构域，和任选包括转录活化结构 域的多肽。示范性Myc多肽包括，例如，c-My C，N-Myc和L-Myc。在一些实施方案中，与天然 存在Myc多肽家族成员诸如与以上列出的那些相比，变体在其整个序列上具有至少90 %的 氨基酸序列同一性。
[0361] "Sox多肽"意指SRY-相关的HMG_b〇X(S 〇X)转录因子的任一天然存在成员，其特 征在于存在高运动基团（high-mobility group) (HMG)结构域，或其保留与最接近相关的天 然存在家族成员相比类似的转录因子活性（在至少50%，80%，或90%活性之内）的变体， 或至少包括天然存在家族成员的DNA结合结构域，和任选包括转录活化结构域的多肽。参 见，例如，Dang，D. T.，等Int. J.Biochem. Cell Biol.(国际生物化学细胞生物学杂志）32 : 1103-1121(2000)。示范性 Sox 多肽包括，例如，Soxl，Sox2, Sox3, Soxl5,或 Soxl8,其中每 种均显示能够彼此替换，以产生iPS细胞。参见，Nakagawa，等，Nature Biotechnology (自 然生物技术）26 :101-106 (2007)。在一些实施方案中，与天然存在Sox多肽家族成员诸如 与以上列出的那些相比，变体在其整个序列上具有至少90%的氨基酸序列同一性。
[0362] "H3K9"指组蛋白H3赖氨酸9。H3K9可以在K9处去甲基化（di-methylated)。参 见，例如，Kubicek，等，Mol. Cell (分子细胞）473-481 (2007)。
[0363] 术语"多能"或"多能性"意指具有产生这样的后代的能力的细胞，所述后代能够 在适当条件下经历分化成为共同展示与来自全部三胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的细 胞谱系相关的特征的细胞类型。多能干细胞可以形成出生前、出生后或成年动物的许多或 全部组织。标准的本领域公认测试，诸如在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可以 用于确定细胞群的多能性，然而，不同多能干细胞特征的鉴定也可以用于检测多能细胞。
[0364] "多能干细胞特征"意指将多能干细胞与其他细胞相区别的细胞特征。产生能够 在适当条件下经历分化成为共同展示与来自全部三胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的细 胞谱系相关的特征的细胞类型的后代的能力是多能干细胞特征。表达或不表达某些分子标 记物组合也是多能干细胞特征。例如，人多能干细胞表达至少一些，且任选地全部，来自以 下非限制性列表的标记物：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81，TRA-2-49/6E，ALP，Sox2， 已-钙黏着蛋白，^^-1，0(^4，1?以1，和似11(^。与多能干细胞相关的细胞形态学也是多能干 细胞特征。
[0365] 术语"文库"，根据其在本领域中的一般用法，用于表示分子集合，其任选地以可以 鉴别各成员的方式来组织和/或分类。文库可以包括，但不仅限于，组合化学药品文库，天 然产物文库，和肽文库。
[0366] "重组"多核苷酸是不以其天然状态存在的多核苷酸，例如，所述多核苷酸包括 自然界中不存在的核苷酸序列，或所述多核苷酸处于除其天然存在的背景以外的背景中， 例如，与其在自然界中典型接近的核苷酸序列分开，或与其典型不接近的核苷酸序列相邻 (或相连）。例如，问题序列可以克隆至载体中，或否则与一种或多种另外的核酸重组。
[0367] "表达盒"意指包括启动子或与编码蛋白的序列可操作相连的其他调控序列的多 核苷酸。
[0368] 术语"启动子"和"表达控制序列"在本文中用于意指指导核酸转录的核酸控制序 列阵列。用于本文中时，启动子包括接近转录起始点的必需核酸序列，诸如在聚合酶II型 启动子的情形中，TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或抑制子元件，其可以位于 距转录起始点多至数千碱基对处。启动子包括组成型和诱导型启动子。"组成型"启动子是 在大部分环境和发育条件下处于活性的启动子。"诱导型"启动子是在环境或发育调节下处 于活性的启动子。术语"可操作相连"意指核酸表达控制序列（诸如启动子、或转录因子结 合位点阵列）和第二核酸序列之间的功能性连接，其中所述表达控制序列指导对应于所述 第二序列的核酸转录。
[0369] "异源序列"或"异源核酸"，用于本文中时，是来源于与特定宿主细胞异源的来源 的序列或核酸，或如果来自相同来源，则由其初始形式进行修饰。因此，细胞中的异源表达 盒不是特定宿主细胞内源的表达盒，例如通过与来自表达载体的核酸序列而非染色体DNA 相连，与异源启动子相连，或与报道基因相连等。
[0370] 术语"试剂"或"测试化合物"意指用于本文中所述的筛选测定中的任一化合物。 试剂可以是，例如，有机化合物（例如，小分子诸如药物），多肽（例如，肽或抗体），核酸（例 如，DNA、RNA、双链、单链、寡核苷酸、反义RNA、小抑制RNA、微小RNA、核糖核酸酶等），寡糖， 脂质。通常，本发明筛选方法中使用的试剂具有小于10, 〇〇〇道尔顿，例如，小于8000,6000， 4000, 2000 道尔顿，例如，50-1500, 500-1500, 200-2000, 500-5000 道尔顿的分子量。测试化 合物可以采用测试化合物文库的形式，诸如提供充足多样性范围的组合文库或随机文库。 测试化合物任选地与融合配偶体，例如靶向化合物，拯救化合物，二聚化合物，稳定化合物， 可寻址化合物（addressable compounds)，和其他功能结构部分相连。常规地，具有有用特 性的新化学个体通过下述来产生：鉴定具有一些理想特性或活性，例如在某些条件下诸如 本文中所述的条件下诱导多能性的能力的测试化合物（称为"前导化合物"），产生所述前 导化合物的变体，和评估那些变体化合物的特性和活性。通常，将高通量筛选（HTS)方法用 于所述分析。
[0371] 术语"核酸"和"多核苷酸"在本文中可互换地用于意指采用单链或双链形式的脱 氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括包含已知的核苷酸类似物或修饰的主 链残基或连锁的核酸，其是合成的、天然存在的、和非天然存在的，其具有与参考核酸类似 的结合特性，且其以与参考核苷酸类似的方式代谢。所述类似物的实例包括，但不仅限于， 硫代磷酸酯，磷酰胺，甲基膦酸酯（methyl phosphonates)，手性-甲基膦酸酯，2-0-甲基核 糖核酸，肽-核酸（PNAs)。
[0372]除非另外指出，特定核酸序列还包括其保守修饰变体（例如，简并密码子置换） 和互补序列，以及明确指出的序列。特别地，简并密码子置换可以通过产生这样的序列来 获得，在所述序列中，一个或多个所选（或全部）密码子的第三个位置被混合碱基和/或 脱氧肌苷残基取代（Batzer 等，Nucleic Acid Res?(核酸研宄）19:5081 (1991) ;0htsuka 等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志）260 :2605-2608(1985) ;Rossolini 等，Mol.Cell-probes ( 分子细胞探针 ） 8 :91-98 (1994)) 。
[0373] 表达或活性的"抑制剂"、"活化剂"和"调节剂"分别用来指利用关于所述靶蛋白 (或编码多核苷酸）表达或活性的体外和体内测定所鉴定的抑制分子、活化分子或调节分 子，例如，配体、激动剂、拮抗剂、及其同系物和模拟物。术语"调节剂"包括抑制剂和活化剂。 抑制剂是，例如，抑制表达或结合，部分或全部阻断刺激或蛋白酶抑制剂活性，降低、防止、 延迟活化，失活，去稳定化，或下调所述靶蛋白活性的试剂，例如拮抗剂。活化剂是例如，诱 导或活化所述靶蛋白表达或结合，刺激、增加、开放、活化、促进、增强活化或蛋白酶抑制剂 活性，致敏或上调所述靶蛋白（或编码多核苷酸）的活性，例如，激动剂。调节剂包括天然 存在的和合成的配体，诘抗剂和激动剂（例如，起激动剂或诘抗剂功能的小化学分子、抗体 等）。所述关于抑制剂和活化剂的测定包括，例如，将推定的调节剂化合物应用到表达所述 靶蛋白的细胞，然后确定对所述靶蛋白活性的功能性作用，如上所述。将用潜在的活化剂、 抑制剂、或调节剂处理的包括所述靶蛋白的样品或测定与无抑制剂、活化剂、或调节剂的对 照样品进行比较，以检验作用程度。对照样品（未用调节剂处理）被赋予100%的相对活 性值。当活性值相对于对照为约80 %，任选50%或25,10 %，5%或1%时，实现所述靶蛋 白的抑制。当活性值相对于对照为约110%，任选150%，任选200, 300%，400%，500%，或 1000-3000%或更高时，实现所述靶蛋白的活化。
[0374] 发明详述
[0375] I?介绍
[0376] 本发明部分地基于意外的发现，即小分子可以用于模拟参与引发诱导的多能干细 胞（iPS)的转录因子的作用。例如，如本文中详细描述地，0ct4可以用减少组蛋白3赖氨酸 9(H3K9)甲基化的小分子"代替"。因此，例如，BIX01294,一种特异性抑制G9a(关于H3K9 的组蛋白甲基转移酶）的小分子，在与其中已经表达Klf4、c-Myc和Sox2的哺乳动物细胞 相接触时，引起多能干细胞的诱导。
[0377] 这些结果不仅关于H3K9的甲基化作用及其参与细胞编程方面令人感兴趣，而且