专利名称：生物转化法生产β-苯乙醇的方法
技术领域：
本发明涉及香料制备技术领域，具体涉及ー种通过酵母菌发酵制备苯こ醇的方法。
背景技术：
β-苯こ醇又称为苯こ醇、2-苯こ醇、β-苯基こ醇、2-苯基こ醇、苄基甲醇，最早是作为植物鲜花中特征性的香气化合物被发现的，是ー种简单的芳香族伯醇，常温下为无色液体，具有淡雅、细腻而持久的玫瑰花香气。苯こ醇作为香料的使用量在全球范围内仅次于香兰素，是多种植物香型配方中不可缺少的组份，也可用于调配食品香精和烟用香精。目前，全球β_苯こ醇产量达到了万吨级别，绝大部分都是采用化学合成的，化学合成的苯こ醇常常含有一些副产物而导致气味不良，品质完全无法赶及天然苯こ醇。天然苯こ醇广泛自然存在于许多芳香植物的精油中，但多数情况下浓度太低，以至于无法提取或提取成本极高。天然的β-苯こ醇产量少，价格在1000美元/kg以上，是化学合成β-苯こ醇的300倍，且需求量严重不足。申请号为02137575. 5的中国发明专利公开了ー种发酵法生产苯こ醇的方法，该方法是以粉碎的烟草，残次料烟梗、烟末为原料通过发酵制取苯こ醇的，具有一定的可行性，但发酵液苯こ醇浓度较低，提取エ艺复杂且成本高。申请号为200710071513. I的中国发明专利申请公开了ー种天然2_苯こ醇的制备方法，该方法以酿酒酵母为生物催化剂、以L-苯丙氨酸为底物发生酵生产2-苯こ醇。按欧洲立法規定，用生物转化合成的2-苯こ醇可以标称为天然，因为作为其前体的原料L-苯丙氨酸也是采用酶法或微生物发酵法生产，属天然产品。由此可见，采用生物转化法合成的2-苯こ醇，产品具有天然属性，还有气味纯正、生产过程污染小等优点。但是，该制备方法存在着产物的提取分离率较低而使产生2-苯こ醇的生产率较低的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供ー种生物转化法生产β -苯こ醇的方法，用该方法制备β -苯こ醇的生产率高、产品纯度高。为实现上述目的，本发明采用如下技术
生物转化法生产β -苯こ醇的方法，该方法以酿酒酵母经过扩大培养的种子液为生物催化剂，接种于装有以L-苯丙氨酸为反应底物的发酵培养基的发酵罐中；所述发酵罐中悬挂ー个装有大孔树脂的网袋；待发酵结束后，取出网袋；对发酵液进行澄清精滤，得到的澄清发酵液在树脂柱中循环回流，然后排掉吸附剩液；再用无水こ醇洗脱树脂柱，得到含β -苯こ醇的洗脱液；洗脱液先浸泡网袋后导入旋转蒸发仪浓縮，回收こ醇，得到的浓缩液再进行蒸馏获得高纯度的β-苯こ醇。优选地，种子液按如下步骤制备将酿酒酵母接种至斜面培养基，经活化培养得到斜面活化菌种，再将斜面活化菌种接种至种子培养基，经过种子培养得到酿酒酵母的种子液。优选地,所述斜面培养基采用10° Bx的麦芽汁琼脂培养基，斜面活化培养的温度为28°C,时间为4天。优选地，所述种子培养基的组成为葡萄糖10 g/L，10° Bx的麦芽汁3 g/L，蛋白栋5 g/L，酵母膏3 g/L，溶剂为水，并用草酸溶液及草酸盐溶液调节至PH为7. O。优选地，所述发酵培养基的组成为葡萄糖30 g/L，L_苯丙氨酸8 g/L, MgSO4 ·7Η200.5 g/L, KH2PO4 0.5 g/L，豆柏粉6 g/L，溶剂为水，并用草酸溶液及草酸盐溶液调节至PH 为 7. O。优选地，发酵罐接入的种子液按体积百分比计为10%，发酵培养的温度为28°C。优选地，发酵结束后，网袋先用去离子水洗去粘附在网袋和大孔树脂表面的残渣。优选地，发酵液澄清精滤时使用不锈钢板框式过滤器和混合纤维素酷微孔滤膜。优选地，澄清发酵液在树脂柱中循环回流20_30min，无水こ醇洗脱树脂柱的时间为 20_30min。优选地，用旋转蒸发仪浓缩时水浴温度为80°C。与现有技术相比，本发明的有益效果是
I、在发酵罐中悬挂装有大孔树脂的网袋吸附发酵罐中生成的β-苯こ醇，増加了大孔树脂吸附发酵液中β-苯こ醇的含量，提高了 β-苯こ醇提取量，使得产品的产量高、纯度高、气味纯正。2、适合エ业化大規模生产，生产周期短。
图I为本发明的方法エ艺流程图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例子对本发明作进ー步详细介绍。实施例I
I.培养基的配制
(I)斜面培养基10° Bx的麦芽汁琼脂培养基，120°c高压蒸汽灭菌20min。(2)种子培养基葡萄糖10 g/L，10° Bx的麦芽汁3 g/L，蛋白栋5 g/L，酵母膏3g/L，溶剂为水，并用草酸溶液及草酸盐溶液调节至PH为7. 0,120°C高压蒸汽灭菌20min。(3)发酵培养基葡萄糖 30 g/L，L-苯丙氨酸 8 g/L，MgSO4 ·7Η20 0.5 g/L, KH2PO4
0.5 g/L，豆柏粉6 g/L，溶剂为水，并用草酸溶液及草酸盐溶液调节至PH为7.0。2.生产エ艺流程(I)斜面活化菌种温度为28°C，时间为4天。(2)种子液的制备挑取活化的酿酒酵母菌体到装有种子培养基的三角瓶中，在温度为28°C、搅拌转速为220r/min、通气量为I. 5L/min的条件下振荡培养48h。(3)发酵培养先往50L发酵罐中装入发酵培养基，同时，在发酵罐中悬挂ー装有500g大孔树脂的网袋，然后120°C高压蒸汽灭菌20min，再将种子液装至发酵罐中，种子液的接入量按体积百分比计为10%，发酵罐装液量为60%，发酵的条件为温度28°C、搅拌转速为200r/min、通气量为I. 5L/min，连续发酵48h。(4)取出发酵罐中的网袋，用过量的去离子水洗去粘附在网袋和大孔树脂表面的残渣；同吋，使用不锈钢板框式过滤器和混合纤维素酯微孔滤膜对发酵液进行澄清精滤，除去大分子化合物和酿酒酵母菌体，得到发酵澄清液，经检测发酵澄清液的β -苯こ醇的含量为 3. 10g/L。(5)泵将发酵澄清液导入填充了树脂的树脂柱中循环回流20min，使得β -苯こ醇被树脂充分吸附，排掉吸附剩液。(6)用泵将无水こ醇导入步骤(5)的树脂柱中循环回流20min，使得树脂所吸附的β-苯こ醇被洗脱出来，无水こ醇的使用量为30L。(7)将步骤(6)所得的洗脱液用于浸泡网袋，浸泡洗脱的时间为2. 5h,经检测浸泡液中β -苯こ醇含量为4. 87g/L。(8)将步骤(7)所得的浸泡液导入旋转蒸发仪，在水浴温度为80°C的条件下浓缩至浸泡液为I. 5L，同时回收こ醇，浓缩液再转入蒸馏装置蒸馏，获得含量约为98%的β -苯こ醇146g，L-苯丙氨酸的转化率为80%。
实施例2
I.培养基的配制
(I)斜面培养基10° Bx的麦芽汁琼脂培养基，120°c高压蒸汽灭菌20min。(2)种子培养基葡萄糖10 g/L，10° Bx的麦芽汁3 g/L，蛋白栋5 g/L，酵母膏3g/L，溶剂为水，并用草酸溶液及草酸盐溶液调节至PH为7. O。(3)发酵培养基葡萄糖 30 g/L，L-苯丙氨酸 8 g/L，MgSO4 ·7Η20 0.5 g/L, KH2PO4
0.5 g/L，豆柏粉6 g/L，溶剂为水，并用草酸溶液及草酸盐溶液调节至PH为7.0，120°C高压蒸汽灭菌20min。2.生产エ艺流程
(I)斜面活化菌种 .温度为28°C，时间为4天。(2)种子液的制备挑取活化的酿酒酵母菌体到装有种子培养基的三角瓶中，在温度为28°C、搅拌转速为220r/min、通气量为I. 5L/min的条件下振荡培养48h。(3)发酵培养先往50L发酵罐中装入发酵培养基，同时，在发酵罐中悬挂ー装有500g大孔树脂的网袋，然后120°C高压蒸汽灭菌20min，再将种子液装至发酵罐中，种子液的接入量按体积百分比计为10%，发酵罐装液量为70%，发酵的条件为温度28°C、搅拌转速为200r/min、通气量为I. 5L/min，连续发酵48h。 (4)取出发酵罐中的网袋，用过量的去离子水洗去粘附在网袋和大孔树脂表面的残渣；同吋，使用不锈钢板框式过滤器和混合纤维素酯微孔滤膜对发酵液进行澄清精滤，除去大分子化合物和酿酒酵母菌体，得到发酵澄清液，经检测发酵澄清液的β -苯こ醇的含量为 3. 12g/L。(5)用泵将发酵澄清液导入填充了树脂的树脂柱中循环回流20min，使得β -苯こ醇被树脂充分吸附，排掉吸附剩液。(6)用泵将无水こ醇导入步骤(5)的树脂柱中循环回流20min，使得树脂所吸附的β-苯こ醇被洗脱出来，无水こ醇的使用量为35L。(7)将步骤(6)所得的洗脱液用于浸泡网袋，浸泡洗脱的时间为2. 5h，经检测浸泡液中β -苯こ醇含量为4. 43g/L。 (8)将步骤(7)所得的浸泡液导入旋转蒸发仪，在水浴温度为80°C的条件下浓缩至浸泡液为1L，同时回收こ醇，浓缩液再转入蒸馏装置蒸馏，获得含量约为98%的β -苯こ醇155g，L-苯丙氨酸的转化率为82%。实施例3
I.培养基的配制
(I)斜面培养基10° Bx的麦芽汁琼脂培养基，120°c高压蒸汽灭菌20min。(2)种子培养基葡萄糖10 g/L，10° Bx的麦芽汁3 g/L，蛋白栋5 g/L，酵母膏3g/L，溶剂为水，并用草酸溶液及草酸盐溶液调节至PH为7. 0,120°C高压蒸汽灭菌20min。(3)发酵培养基葡萄糖 30 g/L，L-苯丙氨酸 8 g/L，MgSO4 ·7Η20 0.5 g/L, KH2PO40.5 g/L，豆柏粉6 g/L，溶剂为水，并用草酸溶液及草酸盐溶液调节至PH为7.0。2.生产エ艺流程
(I)斜面活化菌种 .温度为28°C，时间为4天。(2)种子液的制备挑取活化的酿酒酵母菌体到装有种子培养基的三角瓶中，在温度为28°C、搅拌转速为220r/min、通气量为I. 5L/min的条件下振荡培养48h。(3)发酵培养先往发酵罐中装入发酵培养基，同时，在发酵罐中悬挂ー装有大孔树脂的网袋，然后120°C高压蒸汽灭菌20min，再将种子液装至发酵罐中，种子液的接入量按体积百分比计为10%，发酵罐的装液量为70%，发酵的条件为温度28°C、搅拌转速为200r/min、通气量为I. 5L/min,连续发酵48h。(4)取出发酵罐中的网袋，用过量的去离子水洗去粘附在网袋和大孔树脂表面的残渣；同吋，使用不锈钢板框式过滤器和混合纤维素酯微孔滤膜对发酵液进行澄清精滤，除去大分子化合物和酿酒酵母菌体，得到发酵澄清液，经检测发酵澄清液的β -苯こ醇的含量为 3. 07g/L。(5)用泵将发酵澄清液导入填充了树脂的树脂柱中循环回流20min，使得β -苯こ醇被树脂充分吸附，排掉吸附剩液。(6)用泵将无水こ醇导入步骤(5)的树脂柱中循环回流20min，使得树脂所吸附的β -苯こ醇被洗脱出来。(7)将步骤(6)所得的洗脱液用于浸泡网袋，浸泡洗脱的时间为2. 5h，经检测浸泡液中β -苯こ醇含量为4. 35g/L。(8)将步骤(7)所得的浸泡液导入旋转蒸发仪，在水浴温度为80°C的条件下浓缩至浸泡液为2L，同时回收こ醇，浓缩液再转入蒸馏装置蒸馏，获得含量约为98%的β -苯こ醇131g，L-苯丙氨酸的转化率为77%。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明的保护范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所 做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明的保护范围。
权利要求
1.生物转化法生产β-苯こ醇的方法，其特征在干以酿酒酵母经过扩大培养的种子液为生物催化剂，接种于装有以L-苯丙氨酸为反应底物的发酵培养基的发酵罐中；所述发酵罐中悬挂ー个装有大孔树脂的网袋；待发酵结束后，取出网袋；对发酵液进行澄清精滤，得到的澄清发酵液在树脂柱中循环回流，然后排掉吸附剩液；再用无水こ醇洗脱树脂柱，得到含β -苯こ醇的洗脱液；洗脱液先浸泡网袋后导入旋转蒸发仪浓縮，回收こ醇，得到的浓缩液再进行蒸馏获得高纯度的苯こ醇。
2.如权利要求I所述的生物转化法生产苯こ醇的方法，其特征在于种子液按如下步骤制备将酿酒酵母接种至斜面培养基，经活化培养得到斜面活化菌种，再将斜面活化菌种接种至种子培养基，经过种子培养得到酿酒酵母的种子液。
3.如权利要求2所述的生物转化法生产β-苯こ醇的方法，其特征在于所述斜面培养基采用10° Bx的麦芽汁琼脂培养基，斜面活化培养的温度为28°C，时间为4天。
4.如权利要求2所述的生物转化法生产β-苯こ醇的方法，其特征在于所述种子培养基的组成为葡萄糖10 g/L，10° Bx的麦芽汁3 g/L，蛋白栋5 g/L，酵母膏3 g/L，溶剂为水，并用草酸溶液及草酸盐溶液调节至PH为7. O。
5.如权利要求I所述的生物转化法生产苯こ醇的方法，其特征在于所述发酵培养基的组成为葡萄糖 30 g/L, L-苯丙氨酸 8 g/L, MgSO4 · 7H20 O. 5 g/L, KH2PO4 O. 5 g/L，豆柏粉6 g/L，溶剂为水，并用草酸溶液及草酸盐溶液调节至PH为7. O。
6.如权利要求I所述的生物转化法生产苯こ醇的方法，其特征在于发酵罐接入的种子液按体积百分比计为10%，发酵培养的温度为28°C。
7.如权利要求I所述的生物转化法生产苯こ醇的方法，其特征在干发酵结束后，网袋先用去离子水洗去粘附在网袋和大孔树脂表面的残渣。
8.如权利要求I所述的生物转化法生产苯こ醇的方法，其特征在干发酵液澄清精滤时使用不锈钢板框式过滤器和混合纤维素酷微孔滤膜。
9.如权利要求I所述的生物转化法生产苯こ醇的方法，其特征在干澄清发酵液在树脂柱中循环回流20-30min，无水こ醇洗脱树脂柱的时间为20_30min。
10.如权利要求I所述的生物转化法生产β_苯こ醇的方法，其特征在干用旋转蒸发仪浓缩时水浴温度为80°C。
全文摘要
本发明涉及一种生物转化法生产β-苯乙醇的方法，以酿酒酵母经过扩大培养的种子液为生物催化剂，接种于装有以L-苯丙氨酸为反应底物的发酵培养基的发酵罐中；发酵罐中悬挂一个装有大孔树脂的网袋；发酵结束后，取出网袋；对发酵液进行澄清精滤，得到的澄清发酵液在树脂柱中循环回流，然后排掉吸附剩液；用无水乙醇洗脱树脂柱，得到含苯乙醇的洗脱液；洗脱液先浸泡网袋后导入旋转蒸发仪浓缩，回收乙醇，得到的浓缩液再进行蒸馏获得高纯度的β-苯乙醇。本发明在发酵罐中悬挂装有大孔树脂的网袋吸附发酵罐中生成的β-苯乙醇，增加了大孔树脂吸附发酵液中β-苯乙醇的含量，提高了β-苯乙醇提取量，产品产量高、纯度高。
文档编号C12R1/865GK102660591SQ20121016138
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月22日 优先权日2012年5月22日
发明者卢健, 卢少明, 马集锋 申请人:丽华(广州)香精有限公司