一种重组质粒、构建方法和用于分枝杆菌精准基因组改造与流程

本发明涉及基因组改造技术。

背景技术：

20世纪80年代以来，植物甾醇微生物转化生产前体如4ad、9-oh-ad和add等已逐渐成为大多数类固醇药物(雄激素，类固醇，雌激素和皮质类固醇)的合成原料。分枝杆菌具有复杂的胆固醇代谢途径，可以代谢植物来源的具有复杂成份的甾醇侧链，经过几十年的诱变育种和基因工程改造，已逐渐成为高效经济地生产此类中间体的主要工业菌株。

结核病是困扰全球多年的严重公共健康问题，该病由结核分枝杆菌引起，每年造成约200万人死亡。结核分枝杆菌生长缓慢，可以以胆固醇为唯一碳源生长，对其研究特别是开展基因组操作存在较大的难度。耻垢分枝杆菌mc²155是分枝杆菌特别是结核分枝杆菌使用胆固醇作为唯一碳源和能量源进行生长研究的模式生物，生长快速且无致病性，经过改造后有望成为类固醇合成前体的细胞工厂。beatriz等(2016)研究表明经过简单的敲除msmeg_6039(kshb1)和msmeg_5941(kstd1)，m.smegmatismc²155即可高效地转化植物甾醇生产add和4ad等类固醇激素药物合成原料。

虽然分枝杆菌的基础研究在疾病治疗和工业生产上均具有重要价值，但由于各种原因(如可能对分枝杆菌的重要性认识较晚)，基于分枝杆菌的操作系统相比放线菌目内的其他属如链霉菌属分子操作手段仍显匮乏。2000年，tanya等在结核分枝杆菌(m.tubeiculosis)中开发了基于p2nil和pgoal质粒的基因打靶系统。该系统由pgoal质粒提供筛选标记，p2nil质粒提供多克隆位点以方便克隆重组交换臂及筛选标记。该系统至今仍然是分枝杆菌操作的主要手段。该技术在实际操作过程中仍然相对耗时。如果需要进行基因的插入及精准突变等基因组特定位点的编辑，仍然非常困难且效率不高。

同源重组(homologousrecombination)广泛存在于自然界的生命体中。同源重组的分子过程在生物体内普遍存在，可由dna双链断裂(dsb)诱导自身蛋白参与的修复。i-scei是一个染色体的稀有内切酶，亦被称为归巢核酸内切酶，首先发现于酵母线粒体的内含子中。i-scei识别18bp的非对称序列(attaccctgttatcccta)，在染色体上加入这个序列可以被该酶识别并切割，诱导宿主体内的重组蛋白表达参与dsb的修复，最终导致分子间的重组修复。该系统本质是基于传统的重组臂交换或非同源末端环化等分子机理(nhej)以达到敲除基因组上特定dna片段的技术。

dna在基因组上的敲出、敲入和替换过程传统上均使用交换臂先将带有与染色体对应位置同源的交换臂的目的重组质粒单交换整合至待改造微生物的基因组上，随后使用重组质粒上的抗性基因筛选发生另一个交换臂产生双交换以去除质粒，得到经过改造的突变菌株，敲除臂的长度通常决定了改造效率，交换臂越长，改造效率越高。该方法在实际使用时效率通常较低，难以得到目的dna改造后的菌株。crispr-cas9系统是使用靶向rna(grna)将活性cas9蛋白引导至基因组上的改造位点，在该位点切割后造成染色体双链断裂(dsb)，引发细胞的重组修复系统来完成特定位点的基因组改造工作，该系统由于同样造成dna双链断裂(dsb)诱导细胞的重组修复系统参与，通常改造效率较高。与其工作原理相似，只要在目的微生物基因组上通过质粒引入稀有内切酶的酶切位点，相应的稀有内切酶在微生物细胞内经表达形成活性蛋白后，同样可以酶切染色体造成dsb以引发后期的修复改造过程。该系统无需靶向rna参与，更加方便，适用于基因组较小，染色体上无稀有核酸内切酶酶切位点的微生物。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有分枝杆菌基因组改造手段的不足，提供一种通用于分枝杆菌的较为高效快速的基因组编辑质粒及其方法。

归巢核酸内切酶是一种稀有核酸内切酶，识别序列较普通二型限制性内切酶长，所以很难在基因组内找到相同的序列。来源：i-sceⅰ基因是有酵母21srrna基因的sclsu.1内含子编码的稀有核酸内切酶。识别18bp非对称序列：tagggataacagggtaat。

发明人在对i-scei密码子基础上进行优化改造，得到命名为scem的基因(seqidno:1)，该基因表达酶证明能在耻垢分枝杆菌中有特定位点切割活性。

为此，本发明需要保护以下各技术方案为：

技术方案一

所述经过对已有密码子优化改造后的scem，该酶经本发明实验验证可用于分枝杆菌。

技术方案二(机理)

利用技术方案一中scem在分枝杆菌中有活性可以进行基因组编辑特性，构建分枝杆菌基因敲除系统。质粒在电转化后将借助同源重组交换臂将该系统中构建的带有同源交换臂的重组质粒整合进入分枝杆菌基因组。当使用atc作为诱导剂，四环素启动子将起始scem基因的表达。当诱导表达scem后，该酶将酶切质粒上插入的唯一的酶切位点，造成染色体在此位置特异性双链断裂(dsb)，引发分枝杆菌特异修复此位点，实现基因或基因组dna片段的编辑功能。

技术方案三

pmk101质粒及其构建方法

所述由scem基因构成的pmk101质粒，其特征在于，还包括：

一个pbr322的复制起始区；

一个氨苄青霉素的抗性基因amp，用于大肠杆菌构建质粒时筛选重组质粒；

一个控制所述scem基因表达的抑制诱导型启动子teto-tetr(已为现有技术，非本发明首次提出)，该启动子在atc诱导下可开启scem基因的转录和后续的表达；

所述质粒pmk101的基因序列为seqidno:2。

所述的pmk101质粒，其特征在于，其构建方法为：

步骤1，使用bglⅱ和nheⅰ双酶切pen4.1a-t10m质粒，得到pimyc-tetrdna片段；

使用bamhⅰ和xbaⅰ双酶切pbluescriptsk(-)质粒，同时加入所述pimyc-tetrdna片段连接得到pks-pimyc-tetr；

步骤2，使用ndeⅰ和kpnⅰ双酶切plu101质粒,将scem克隆至plu101质粒的ndeⅰ和kpnⅰ位点，得到plu102；随后使用pstⅰ和ecorⅰ双酶切plu102，得到923bp的包含ptipa+scem的dna片段；

使用pstⅰ和ecorⅰ双酶切步骤1获得的所述pks-pimyc-tetr质粒，加入所述ptipa+scem的dna片段后两者连接得到pks-pimyc-tetr-ptipa-scem；

步骤3，

3.1步骤，使用引物(teto_f：tttactgcagattggatcgtcggcaccgtca和teto_r：tttacatatggcggatcgtgctcatttcgg)，以质粒pen12a-p1为模板，得到pmyc-teto启动子，使用pstⅰ和ndeⅰ双酶切，得到pmyc-teto启动子dna片段，备用；

3.2步骤，使用pstⅰ和ndeⅰ双酶切步骤2中重组质粒pks-pimyc-tetr-ptipa-scem用于去除ptipa启动子，并加入步骤3.1备用的所述pmyc-teto启动子dna片段，最终得到pks-pimyc-tetr-pmyc-scem，实现构建质粒pmk101。

技术方案四

精准敲除msmeg_5228质粒及其构建方法

一种pmk5228质粒，包括所述pmk101质粒的元件，其特征在于，还包括：

一个来自于pgoal19质粒的筛选标记；该pgoal19质粒的筛选标记，包括了三个基因：一个潮霉素抗性基因，一个半乳糖苷酶筛选标记lacz和一个基于蔗糖的反筛选标记sacb；

一个来自于链霉菌pij773质粒的阿泊拉霉素抗性筛选标记apra。

所述的pmk5228质粒，其特征在于，其基因序列为seqidno:3。

所述的pmk5228质粒的构建方法，其特征在于，

使用(引物sc_u_f:tttagaattcaacccggtgtgcgatctggt，

sc_u_r:atcgcagatgtcgcccgtg；

sc_d_r1:accctgttatccctagggttctgcgaggacgaca，

sc_d_r:gggttctgcgaggacgaca,

sc_d_r3：attttctagagcgttaattaaactagtagatctaagcttgattaccctgttatccctagggttctgcgaggacgaca)

pcr整合获得msmeg_5228上下游分别为820bp和946bp的敲除重组交换臂，hindⅲ和ecorⅰ酶切后与hindⅲ和ecorⅰ双酶切pmk101连接获得pmk1011质粒；

xbaⅰ酶切获得pij773质粒的apramycin抗性基因，克隆入pmk1011质粒，获得质粒pmk1012；

pacⅰ酶切pgoal19质粒，获得hyg-lacz-sacb片段；同样以pacⅰ酶切质粒pmk1012，将hyg-lacz-sacb片段克隆入pmk1011，获得最终精准敲除msmeg_5228的靶向质粒pmk5228。

技术方案五

精准敲除胆固醇利用基因簇msmeg_5990-msmeg_6043质粒及其构建方法

一种pmk90-43质粒，包括所述pmk101质粒的元件，其特征在于，还包括：

敲除基因簇msmeg_5990-msmeg_6043两侧的重组交换臂；

来自于pgoal19质粒的筛选标记；该筛选标记包括了三个基因：潮霉素抗性基因、半乳糖苷酶筛选标记lacz、基于蔗糖的反筛选标记sacb；

来自于链霉菌pij773质粒的阿泊拉霉素抗性筛选标记。

所述的pmk90-43质粒，其特征在于，其基因序列为seqidno:4。

所述的pmk90-43质粒的构建方法，其特征在于，

使用(引物：

5990_sf:tttagaattctggttggcagtccgtgcaca，

5990_r:ggctcgatgaccggggtg；

90-43f1:caccccggtcatcgagccatcgacatccactcggccga，

6043_r:ggttgctgaggcggtgaatga，

6043_sr:attttctagagcgttaattaaactagtagatctaagcttgattaccctgttatccctaggttgctgaggcggtgaatga)pcr整合获得msmeg_5228上下游分别为865bp和938-bp的敲除重组交换臂，采用hindⅲ和ecorⅰ酶切后与hindⅲ和ecorⅰ双酶切pmk101连接获得pmk1013质粒；

xbaⅰ酶切获得pij773质粒的apramycin抗性基因，克隆入pmk1011质粒，获得质粒pmk1014；

pacⅰ酶切pgoal19质粒，获得hyg-lacz-sacb片段；同样以pacⅰ酶切质粒pmk1014，将hyg-lacz-sacb片段克隆入pmk1011，获得最终精准敲除基因簇msmeg_5990-msmeg_6043的靶向质粒pmk90-43。

技术方案六

分枝杆菌scetm基因敲除系统在分枝杆菌中进行连续精准基因敲除的应用。

经本发明验证，在相同敲除臂长度的情况下，使用传统方法在m.smegmatismc²155中均未得到敲除突变株，而使用发明的scetm系统，在实施例中均得到了正确的改造菌株。该方法的建立可为分枝杆菌的基因组改造，进一步了解结核分枝杆菌等病原菌的致病机理以及进一步改造以新金分枝杆菌(mycobacteriumneoaurum)、偶发分枝杆菌(mycobacteriumfortuitum)为代表的工业微生物的基因组以提高激素药物前体的产量提供了更为便捷的操作工具。

附图说明

图1是pmk101构建流程图(实施例1)

图2是pmk101质粒示意图(实施例1)

图3是pmk5228构建流程图(实施例3)

图4是pmk5228质粒示意图(实施例3)

图5是pmk90-43构建流程图(实施例4)

图6是pmk90-43质粒示意图(实施例4)

图7是本发明基因敲除流程图

图8是在加入10％蔗糖的lb固体培养基上划线筛选msmeg_5228敲除dna片段的m.smegmatismc²155(实施例5)

图9是scetm系统敲除msmeg_5228基因的抗性验证图(实施例5)

图10是敲除菌株pcr验证结果(实施例5)

图11是在加入10％蔗糖的lb固体培养基上划线筛选msmeg_5990-msmeg_6043敲除dna片段的m.smegmatismc²155。(实施例6)

图12是scetm系统敲除msmeg_5990-msmeg_6043基因簇的抗性验证图(实施例6)

图13是敲除菌株pcr验证结果(实施例6)

图14是在加入10％蔗糖的lb固体培养基上划线筛选msmeg_5228敲除dna片段的m.smegmatismc²155(实施例7)

图15是scetm系统在敲除msmeg_5990-msmeg_6043基因簇的基础上连续敲除msmeg_5228基因的抗性验证。(实施例7)

图16是随机挑选33株敲除菌株进行pcr敲除结果验证(实施例7)

图17是使用p2nil质粒敲除msmeg_5228基因蔗糖平板筛选图证(实施例8)

图18是使用p2nil质粒敲除msmeg_5990-msmeg_6043基因簇蔗糖平板筛选图证(实施例8)

图19是使用p2nil质粒敲除msmeg_5228基因、敲除msmeg_5990-msmeg_6043基因簇的抗性验证图(实施例8)

图20是传统敲除方法p2nil敲除msmeg_5228的pcr验证电泳跑胶图(实施例8)

图21是传统敲除方法p2nil敲除msmeg_5990-msmeg_6043的pcr验证电泳跑胶图(实施例8)

具体实施方式

本发明涉及一种能在分枝杆菌中进行精准基因组编辑的质粒构建及其在分枝杆菌中进行连续精准基因敲除的应用。使用该方法进行分枝杆菌基因组编辑的目的dna片段长度理论上可从bp-mb级别且在改造后不在基因组上留下任何疤痕。该方法的建立可为高致病分枝杆菌的致病机理研究和重要甾体激素药物前体生产的重要分枝杆菌工业菌株的基因组改造提供极其重要的基因组编辑手段。以下通过若干实施例对本发明技术方案做进一步展开和对比介绍。

实施例1构建基于分枝杆菌的精准基因组编辑基础质粒

如图1所示的方法过程，具体如下：

步骤1，使用bglⅱ和nheⅰ双酶切pen4.1a-t10m质粒(pen4.1a-t10m质粒为现有技术，可通过采购获得)，得到pimyc-tetrdna片段。

使用bamhⅰ和xbaⅰ双酶切pbluescriptsk(-)质粒(pbluescriptsk(-)质粒为现有技术，可通过采购获得)，同时加入所述pimyc-tetrdna片段连接得到pks-pimyc-tetr。

步骤2，以i-scei基因为基础，在综合分析结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和偶发分枝杆菌等分枝杆菌的密码子使用的基础上，使用genedesigner软件优化合成了i-scei基因，命名为scem(702bp,seqidno:1)。使用ndeⅰ和kpnⅰ双酶切plu101质粒(为现有技术，公开于：zhiqunlu,pengfeixie,andzhongjunqin*，promotionofmarkerlessdeletionoftheactinorhodinbiosyntheticgeneclusterinstreptomycesactabiochimbiophyssin2010,42:717–721),将scem克隆至plu101质粒的ndeⅰ和kpnⅰ位点，得到plu102。随后使用pstⅰ和ecorⅰ双酶切plu102，得到923bp的包含ptipa+scem的dna片段；

使用pstⅰ和ecorⅰ双酶切步骤1获得的所述pks-pimyc-tetr质粒，加入所述ptipa+scem的dna片段后两者连接得到pks-pimyc-tetr-ptipa-scem。

步骤3，

3.1步骤，使用引物(teto_f：tttactgcagattggatcgtcggcaccgtca和teto_r：tttacatatggcggatcgtgctcatttcgg)，以质粒pen12a-p1(质粒pen12a-p1为现有技术，可通过采购获得)为模板，得到pmyc-teto启动子，使用pstⅰ和ndeⅰ双酶切，得到pmyc-teto启动子dna片段，备用；

3.2步骤，使用pstⅰ和ndeⅰ双酶切步骤2中重组质粒pks-pimyc-tetr-ptipa-scem用于去除ptipa启动子，并加入步骤3.1备用的所述pmyc-teto启动子dna片段，最终得到pks-pimyc-tetr-pmyc-scem(pmk101,如图2所示)。

如图2所示图谱，所述质粒pmk101的结构，主要包括：

一个pbr322的复制起始区；

一个氨苄青霉素的抗性基因amp，用于大肠杆菌构建质粒时筛选重组质粒；

一个经过优化的归巢核酸酶i-scei基因(命名为scem，此酶被证明在分枝杆菌中有期望的定点酶切的功能，用于在分枝杆菌中酶切染色体，诱导宿主菌修复机制形成期望的重组改造进行特定位点的dna编辑)。

一个控制scem基因表达的抑制诱导型启动子teto-tetr(该启动子在atc诱导下可开启scem基因的转录和后续的表达)。

所述质粒pmk101的基因序列，详见seqidno:2。

实施例2

本实施例为实施例1的替换技术方案。区别技术措施仅在于：

以齿垢分枝杆菌染色体dna为模板，使用引物

psmyc_f：tttaagatctggatcgtcggcaccgtca和

psmyc_r：tttaggtaccggatcgtgctcatttcgggc，pcr得到约300bp的psmyc启动子片段，使用bglⅱ和kpnⅰ酶切克隆入pen4.1a-t10m质粒，可替换pimyc启动子。

因为四环素诱导启动子存在本底表达和诱导效率的问题，两者需要一定的平衡，主要目的在于调节scem基因的本底表达效率，但是以上两个启动子替换后均能正常使用。

以实施例1获得的pmk101为基础，分别构建精准敲除msmeg_5228和胆固醇利用基因簇msmeg_5990-msmeg_6043质粒。以下通过实施例3、实施例4作为例子来介绍构建基于分枝杆菌的精准基因组编辑位点质粒。但本发明不限于保护实施例所披露的内容。

实施例3构建精准敲除msmeg_5228的靶向质粒pmk5228

如图3所示，pmk5228质粒构建流程图，构建过程如下：

(1)使用(引物

sc_u_f:tttagaattcaacccggtgtgcgatctggt，

sc_u_r:atcgcagatgtcgcccgtg；

sc_d_r1:accctgttatccctagggttctgcgaggacgaca，

sc_d_r:gggttctgcgaggacgaca,

sc_d_r3：attttctagagcgttaattaaactagtagatctaagcttgattaccctgttatccctagggttctgcgaggacgaca)

pcr整合获得msmeg_5228上下游分别为820bp和946bp的敲除重组交换臂，hindⅲ和ecorⅰ酶切后与hindⅲ和ecorⅰ双酶切pmk101(来自于实施例1构建方法获得)连接获得pmk1011质粒。xbaⅰ酶切获得pij773质粒的apramycin抗性基因，克隆入pmk1011质粒，获得质粒pmk1012。pacⅰ酶切pgoal19质粒(pgoal19质粒为现有技术，可通过采购获得)，获得hyg-lacz-sacb片段。同样以pacⅰ酶切质粒pmk1012，将hyg-lacz-sacb片段克隆入pmk1011，获得最终精准敲除msmeg_5228的靶向质粒pmk5228(图4)。

如图4所示图谱，所述质粒pmk5228的结构：除了包括结构质粒pmk101的元件之外，还包括敲除基因两侧的重组交换臂(上游大小为820bp，下游大小为946bp)：

一个来自于pgoal19质粒的筛选标记(该筛选标记包括了三个基因，一个潮霉素抗性基因，一个半乳糖苷酶筛选标记lacz和一个基于蔗糖的反筛选标记sacb)；

一个来自于链霉菌pij773质粒(链霉菌pij773质粒为现有技术，可通过采购获得)的阿泊拉霉素抗性筛选标记apra。

本实施例最终构建的质粒pmk5228，其基因序列详见seqidno:3。

实施例4构建精准敲除基因簇msmeg_5990-msmeg_6043的靶向质粒pmk90-43

参照实施例3中构建pmk2558流程，本实施例与之相比唯一的区别在于需要敲除的基因在染色体上的位置不同，所以交换臂在染色体上的位置不同，导致敲除臂序列和pmk2558敲除臂是不一样。其余流程都一致。如图5所示，介绍如下：

使用(引物：

5990_sf:tttagaattctggttggcagtccgtgcaca，

5990_r:ggctcgatgaccggggtg；

90-43f1:caccccggtcatcgagccatcgacatccactcggccga，

6043_r:ggttgctgaggcggtgaatga，

6043_sr:attttctagagcgttaattaaactagtagatctaagcttgattaccctgttatccctaggttgctgaggcggtgaatga)pcr整合获得msmeg_5228上下游分别为865bp和938-bp的敲除重组交换臂，采用hindⅲ和ecorⅰ酶切后与hindⅲ和ecorⅰ双酶切pmk101(来自于实施例1构建方法获得)连接获得pmk1013质粒。xbaⅰ酶切获得pij773质粒的apramycin抗性基因，克隆入pmk1011质粒，获得质粒pmk1014。pacⅰ酶切pgoal19质粒，获得hyg-lacz-sacb片段。同样以pacⅰ酶切质粒pmk1014，将hyg-lacz-sacb片段克隆入pmk1011，获得最终精准敲除基因簇msmeg_5990-msmeg_6043的靶向质粒pmk90-43(图6)。

如图6所示图谱，所述质粒pmk90-43的结构,除了包括结构质粒pmk101的元件之外，还包括敲除基因簇msmeg_5990-msmeg_6043两侧的重组交换臂(上游大小为865bp，下游大小为938bp):

一个来自于pgoal19质粒的筛选标记(该筛选标记包括了三个基因，一个潮霉素抗性基因；

一个半乳糖苷酶筛选标记lacz和一个基于蔗糖的反筛选标记sacb)；

一个来自于链霉菌pij773质粒的阿泊拉霉素抗性筛选标记。

本实施例最终获得的质粒pmk90-43，其基因序列详见seqidno:4。

实施例5应用例

本发明基因敲除流程，如图7所示。

使用实施例3改造后的scetm系统敲除m.smegmatismc²155的3β-羟基类固醇脱氢酶(msmeg_5228,1071bp)。

挑取在固体培养基上的m.smegmatismc²155单菌落接入lb培养基，30℃培养48h，生长od600值至0.4-0.6，转接f培养基：生长8-9小时至od600值0.3-0.8时，5000r/min离心5min收集菌体，加入15ml10％甘油重悬，5000r/min离心5min(此过程重复3次)后用200μl10％甘油重悬，加入10-100ng质粒后置于冰上10min。将pmk5228质粒与菌体混合物加入预冷电转化杯，2500v/电转后加入1mllb+甘油培养基放于37℃摇床复苏2-3h，随后涂布于含有apramycin(终浓度为50ug/ml)和x-gal(终浓度为20ug/ml)的lb+甘油固体培养基上，37℃培养箱培养3-5d后观察；

待平板上菌落长出蓝色菌落后挑选蓝色菌落划线于含有atc(终浓度为30ng/ml)的lb+甘油固体培养基平板上进行诱导培养，放于37℃培养箱培养3-5d；

待平板上长出单菌落后随机挑选2-3株单菌落划线于含有x-gal(终浓度为20ug/ml)的lb+甘油的蔗糖固体培养基上(其中蔗糖浓度为10％，且该培养基中去掉了nacl成分)放于37℃培养箱培养3-5d；

待平板上长出蓝白分明的单菌落后，随机挑选平板上的白色菌落33株分别划线apramycin(终浓度为50ug/ml)的lb+甘油的抗性平板和不含有抗生素的lb+甘油的固体培养基平板上进行抗性对照，37℃条件下培养2-3d观察；

挑选抗性平板上不长的菌株接种于液体f培养基中提取其基因组dna进行pcr验证其目的区段是否敲除，并挑选目的区段缺失的pcr条带送出测序。

如图8所示：

a为重组质粒电转分枝杆菌(m.smegmatismc²155)后在加有终浓度2％甘油、2％x-gal和50μg/mlapramycin抗生素的lb培养基上涂布长出apramycin抗性菌落(3-5d)。

b为在2％甘油、2％x-gal、50-300ng/mlatc和含有10％蔗糖的lb固体平板上划线a图中得到的蓝色单菌落筛选msmeg_5228基因敲除的m.smegmatismc²155(白色菌落)。

如图9所示，scetm系统敲除msmeg_5228基因的抗性验证图。

a为在加有终浓度2％甘油的lb培养基上划线不同单菌落生长状况(对照)；

b为在加有终浓度2％甘油和50μg/mlapramycin抗生素的lb培养基上同时划线同一菌落，同样的菌落在抗性平板上不生长意味着抗性基因的丢失。

由此证明这些经过图8所示过程诱导后的单菌落基因组上重组质粒可能发生了预期的重组交换丢失。

如图10所示，敲除菌株pcr验证结果：其中共pcr得到21个有结果条带，确认敲除的菌株有9个敲除效率约为42.85％(其中未被敲除菌株pcr得到一条1300bp左右大小的条带，敲除菌株pcr得到条带大小为500bp左右)。

实施例6应用例

本发明基因敲除流程，如图7所示。

使用实施例4改造后的scetm系统敲除m.smegmatismc²155的胆固醇利用基因簇(msmeg_5990-msmeg_6043，总长约48kb)：

挑取在固体培养基上的m.smegmatismc²155单菌落接入lb培养基，30℃培养48h，生长od600值至0.4-0.6，转接f培养基：生长8-9小时至od600值0.3-0.8时，5000r/min离心5min，收集菌体，加入15ml10％甘油重悬，5000r/min离心5min，此过程重复3次，后用200μl10％甘油重悬，加入10-100ng质粒后置于冰上10min。

将pmk90-43质粒与菌体混合物加入预冷电转化杯，2500v/电转后加入1mllb+甘油培养基放于37℃摇床复苏2-3h，随后涂布于含有apramycin(终浓度为50ug/ml)和x-gal(终浓度为20ug/ml)的lb+甘油固体培养基上，37℃培养箱培养3-5d后观察；

待平板上菌落长出蓝色菌落后挑选蓝色菌落划线于含有atc(终浓度为30ng/ml)的lb+甘油固体培养基平板上进行诱导培养，放于37℃培养箱培养3-5d；

待平板上长出单菌落后随机挑选2-3株单菌落划线于含有x-gal(终浓度为20ug/ml)的lb+甘油的蔗糖固体培养基上(其中蔗糖浓度为10％，且该培养基中去掉了nacl成分)放于37℃培养箱培养3-5d；

待平板上长出蓝白分明的单菌落后，随机挑选平板上的白色菌落33株分别划线apramycin(终浓度为50ug/ml)的lb+甘油的抗性平板和不含有抗生素的lb+甘油的固体培养基平板上进行抗性对照，37℃条件下培养2-3d观察；

挑选抗性平板上不长的菌株接种于液体f培养基中提取其基因组dna进行pcr验证其目的区段是否敲除，并挑选目的区段缺失的pcr条带送出测序。经验证敲除效率约为7.14％。

如图11所示，在加入10％蔗糖的lb固体培养基上划线筛选msmeg_5990-msmeg_6043敲除dna片段的m.smegmatismc²155。

a为重组质粒电转耻垢分枝杆菌(m.smegmatismc²155)后在加有终浓度2％甘油、2％x-gal和50μg/mlapramycin抗生素的lb培养基上涂布长出apramycin抗性菌落(3-5d)。

b为在2％甘油、2％x-gal、50-300ng/mlatc和含有10％蔗糖的lb固体平板上划线a图中得到的蓝色单菌落筛选msmeg_5990-msmeg_6043基因簇敲除的m.smegmatismc²155(白色菌落)。

如图12所示，是对scetm系统敲除msmeg_5990-msmeg_6043基因簇的抗性验证图。

a为在加有终浓度2％甘油的lb培养基上划线不同单菌落生长状况(对照)。

b为在加有终浓度2％甘油和50μg/mlapramycin抗生素的lb培养基上同时划线同一菌落，同样的菌落在抗性平板上不生长意味着抗性基因的丢失。由此证明这些经过图11所示过程诱导后的单菌落基因组上重组质粒可能发生了预期的重组交换丢失。

如图13所示，敲除菌株pcr验证结果:其中共pcr测试31个样品，共pcr得到28个有结果条带，确认敲除的菌株有2个，敲除效率约为7.14％(由于敲除区域较长，基因簇敲除pcr验证若菌株上基因簇未被敲除，则pcr应得不到任何条带，由于本次引物设计特异性问题，结果中有一条大小约为350bp左右的条带，敲除菌株pcr得到一条750bp左右的条带，经测序进一步验证确实为基因簇精准敲除)。

应用例7连续敲除

本实施例连续敲除的基因敲除流程，如图7所示。

使用本发明改造后的scetm系统在敲除msmeg_5990-msmeg_6043基因簇的敲除子中继续敲除msmeg_5228：

挑取在固体培养基上生长的m.smegmatismc²155(已成功敲除msmeg_5990-msmeg_6043，经验证无任何抗性)单菌落接入lb培养基，30℃培养48h，生长od600值至0.4-0.6，转接f培养基：生长8-9小时至od600值0.3-0.8时，5000r/min离心5min收集菌体，加入15ml10％甘油重悬，5000r/min离心5min(此过程重复3次)后用200μl10％甘油重悬，加入10-100ng质粒后置于冰上10min。

将pmk5228质粒与菌体混合物加入预冷电转化杯，2500v/电转后加入1mllb+甘油培养基放于37℃摇床复苏2-3h，随后涂布于含有apramycin(终浓度为50ug/ml)和x-gal(终浓度为20ug/ml)的lb+甘油固体培养基上，37℃培养箱培养3-5d后观察；

待平板上菌落长出蓝色菌落后挑选蓝色菌落划线于含有atc(终浓度为30ng/ml)的lb+甘油固体培养基平板上进行诱导培养，放于37℃培养箱培养3-5d；待平板上长出单菌落后随机挑选2-3株单菌落划线于含有x-gal(终浓度为20ug/ml)的lb+甘油的蔗糖固体培养基上(其中蔗糖浓度为10％，且该培养基中去掉了nacl成分)放于37℃培养箱培养3-5d；

待平板上长出蓝白分明的单菌落后，随机挑选平板上的白色菌落33株分别划线apramycin(终浓度为50ug/ml)的lb+甘油的抗性平板和不含有抗生素的lb+甘油的固体培养基平板上进行抗性对照，37℃条件下培养2-3d观察；

挑选抗性平板上不长的菌株接种于液体f培养基中提取其基因组dna进行pcr验证其目的区段是否敲除，并挑选目的区段缺失的pcr条带送出测序。经验证敲除效率约为3.33％。图14所示，在加入10％蔗糖的lb固体培养基上划线筛选msmeg_5228敲除dna片段的m.smegmatismc²155(已敲除msmeg_5990-msmeg_6043基因簇)。a为重组质粒电转耻垢分枝杆菌(m.smegmatismc²155，已验证敲除msmeg_5990-msmeg_6043基因簇)后在加有终浓度2％甘油、2％x-gal和50μg/mlapramycin抗生素的lb培养基上涂布长出apramycin抗性菌落(3-5d)。b为在2％甘油、2％x-gal、50-300ng/mlatc和含有10％蔗糖的lb固体平板上划线a图中得到的蓝色单菌落筛选msmeg_5990-msmeg_6043基因簇敲除的m.smegmatismc²155(白色菌落)。

如图15所示，scetm系统在敲除msmeg_5990-msmeg_6043基因簇的基础上连续敲除msmeg_5228基因的抗性验证。a为在加有终浓度2％甘油的lb培养基上划线不同单菌落生长状况(对照)；b为在加有终浓度2％甘油和50μg/mlapramycin抗生素的lb培养基上同时划线同一菌落，同样的菌落在抗性平板上不生长意味着抗性基因的丢失。该图证明这些经过诱导后的单菌落基因组上重组质粒可能发生了预期的重组交换丢失。

图16所示:随机挑选33株敲除菌株进行pcr敲除结果验证，其中共pcr得到有结果的条带30个。与对照耻垢分枝杆菌mc²155基因组pcr结果1300bp相比，敲除菌株得到pcr条带大小为500bp左右。由图可以看出有一个条带大小为500bp左右，随后挑选该条带送出测序，得到的测序结果确认为目的片段缺失，最终本发明应用scetm系统成功实现了对于耻垢分枝杆菌基因的连续敲除。

实施例8验证及对比

使用传统的p2nil质粒构建重组质粒pmkc101(敲除msmeg_5228)和pmkc102(敲除msmeg_5990-msmeg_6043)进行dna片段的敲除。

一、使用(引物ct_u_f:tttaaagcttgagcagcaccatctcgacca,

ct_u_r:tttagaattcatcgcagatgtcgcccgtg,

ct_d_f:tttagaattcccgctgctggaaccgctt,

ct_d_r:tttaagatctgggttctgcgaggacgaca)pcr分别获得msmeg_5228上下游分别为820bp和946bp的敲除重组交换臂，顺序克隆入p2nil质粒的hindⅲ、ecorⅰ酶和ecorⅰ、bglⅱ位点，得到质粒pmk1015。pacⅰ酶切pgoal19质粒，获得hyg-lacz-sacb片段。同样以pacⅰ酶切质粒pmk1014，将hyg-lacz-sacb片段克隆入pmk1011，获得最终敲除基因msmeg_5228的靶向质粒pmkc101。

使用p2nil质粒敲除msmeg_5228基因，蔗糖平板筛选图，见图17。a为基于p2nil构建的重组质粒pmkc101电转耻垢分枝杆菌(m.smegmatismc²155)后在加有终浓度2％甘油、2％x-gal和50μg/mlkanamycin抗生素的lb培养基上涂布长出kanamycin抗性菌落(3-5d)。b为在2％甘油、2％x-gal和含有10％蔗糖的lb固体平板上划线a图中得到的蓝色单菌落筛选msmeg_5228基因敲除的m.smegmatismc²155(白色菌落)。

使用p2nil质粒敲除msmeg_5228基因的抗性验证图，如图19所示。p2nil系统(传统方法)在敲除msmeg_5228基因簇的基础上连续敲除msmeg_5228基因的抗性验证图。a为在加有终浓度2％甘油的lb培养基上划线不同单菌落生长状况(对照)；b为在加有终浓度2％甘油和50μg/mlkanamycin抗生素的lb培养基上同时划线同一菌落，同样的菌落在抗性平板上不生长意味着抗性基因的丢失。该图证明这些经过诱导后的单菌落基因组上重组质粒可能发生了预期的重组交换丢失。

二、使用(引物

5990_cf:tttaaagctttggttggcagtccgtgcaca,

5990_cr:tttagaattcggctcgatgaccggggtg；

6043_cf:tttagaattcatcgacatccactcggccga,

6043_cr:tttaagatctggttgctgaggcggtgaatga)pcr整合获得msmeg_5228上下游分别为820bp和946bp的敲除重组交换臂，顺序克隆入p2nil质粒的hindⅲ、ecorⅰ酶和ecorⅰ、bglⅱ位点，得到质粒pmk1015。pacⅰ酶切pgoal19质粒，获得hyg-lacz-sacb片段。同样以pacⅰ酶切质粒pmk1014，将hyg-lacz-sacb片段克隆入pmk1015，获得最终敲除基因簇msmeg_5990-msmeg_6043的靶向质粒pmkc102。

图18所示的蔗糖平板筛选图(培养基中蔗糖浓度为10％)：

a质粒电转结果(培养基加入kan和x-gal)：基于p2nil构建的重组质粒pmkc102电转耻垢分枝杆菌(m.smegmatismc²155)后在加有终浓度2％甘油、2％x-gal和50μg/mlkanamycin抗生素的lb培养基上涂布长出kanamycin抗性菌落(3-5d)。

b二次重组交换蓝白斑筛选图：在2％甘油、2％x-gal和含有10％蔗糖的lb固体平板上划线a图中得到的蓝色单菌落筛选msmeg_5990-msmeg_6043基因簇敲除的m.smegmatismc²155(白色菌落)。

使用p2nil质粒敲除msmeg_5990-msmeg_6043基因的抗性验证图，也参见如图19所示。

对比及验证：

挑取在固体培养基上的m.smegmatismc²155单菌落接入lb培养基，30℃培养48h，生长od600值至0.4-0.6，转接f培养基：生长8-9小时至od600值0.3-0.8时，5000r/min离心5min收集菌体，加入15ml10％甘油重悬，5000r/min离心5min，此过程重复3次，后用200μl10％甘油重悬，加入10-100ng质粒后置于冰上10min。

将构建好的pmkc101(敲除msmeg_5228)和pmkc102(敲除msmeg_5990-msmeg_6043)质粒通过电转导入m.smegmatismc²155中。电转完成后加入1mllb+甘油培养基放于37℃摇床复苏2-3h，随后涂布于含有有kanamycin(终浓度为50ug/ml)和x-gal(终浓度为20ug/ml)的lb+甘油固体培养基上，放于37℃培养箱培养3-5d后观察；

待平板上菌落长出蓝色菌落后挑选蓝色菌落划线于lb+甘油固体培养基平板上，放于37℃培养箱培养3-5d；

待平板上长出单菌落后随机挑选2-3株单菌落划线于含有x-gal(终浓度为20ug/ml)的lb+甘油的蔗糖固体培养基上(其中蔗糖浓度为10％，且该培养基中去掉了nacl成分)放于37℃培养箱培养3-5d；

待平板上长出蓝白分明的单菌落后，随机挑选平板上的白色菌落33株分别画于含有卡那霉素的lb+甘油的抗性平板和不含有抗生素的lb+甘油的固体培养基平板上进行抗性对照，37℃条件下培养2-3天观察；

挑选抗性平板上不长的菌株接种于液体f培养基中提取其基因组dna进行pcr验证其目的区段是否敲除，并挑选目的区段缺失的pcr条带送出测序。使用pmkc101及pmkc102均未能得到成功敲除msmeg_5228及大片段msmeg_5990-msmeg_6043的敲除缺失菌株。

如图20所示的传统敲除方法p2nil敲除msmeg_5228的pcr验证电泳跑胶图。随机挑选33株敲除菌株进行pcr敲除结果验证，其中共pcr得到有结果的条带28个，其pcr得到的条带大小均与对照株原始耻垢分枝杆菌mc²155的条带大小相一致均为1.3kb左右，结果表明使用传统方法在敲除臂同样长度的情况下未能得到成功敲除msmeg_5228基因的菌株。

如图21所示的传统敲除方法p2nil敲除msmeg_5990-msmeg_6043的pcr验证电泳跑胶图。随机挑选33株敲除菌株进行pcr敲除结果验证，由于msmeg_5990-msmeg_6043较大(约46kb)，以未成功敲除基因簇菌株的基因组为模板pcr无法得到条带。以成功敲除msmeg_5990-msmeg_6043基因簇的菌株基因组为模板应得到目的条带大小为750bp，结果表明使用传统方法在敲除臂同样长度的情况下未能得到成功敲除msmeg_5990-msmeg_6043基因簇的菌株。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

实施例附图解释：

一个蔗糖平板筛选图(表明使用蔗糖平板强行去除质粒在染色体上的拷贝)；

一个抗性平板筛选图(代表基因组可能发生重组去除了质粒，因为抗性基因是和质粒共存亡的)；

一个pcr验证图(这个图代表成功敲除片段的效率)。

综上，

本发明设计的实施例里包括精准敲除了一个基因(代表dna小片段的操作)和敲除了一个大基因簇(代表了一个dna大片的的操作)，最后还设计了上述两个操作均用p2nil系统(也就是使用最多的传统方法)进行了效率比较的实施例，如此代表本发明操作方法在效率和时间上是有优势的。除此之外，本发明还在敲除5228基因的基础上继续使用pmk90-43质粒在此敲除菌的基础上继续敲除90-43基因簇，也获得了成功，表明本发明方法可用于基因组的连续dna操作。

本发明scetm系统机理解释：由本申请的发明人发现，scem在耻垢分枝杆菌中有活性，可以进行基因组编辑，由于各分枝杆菌进化上非常接近，基因组相似度较高，必然scem适用于所有分枝杆菌均能实现基因组层面的dna编辑过程。由于pbr322的复制起始区不能在分枝杆菌中复制，该质粒在电转化后将借助同源重组交换臂整合进入分枝杆菌基因组。当使用atc作为诱导剂，四环素启动子将起始scem基因的表达。当诱导表达scem后，该酶将酶切质粒上插入的唯一的酶切位点，造成染色体在此位置特异性双链断裂(dsb)，引发分枝杆菌特异修复此位点，实现基因或基因组dna片段的编辑功能。本发明基因编辑原理和过程与现有的crispr-cas9有一定的相似之处，但在质粒构建过程中更为方便，对于分枝杆菌基因组的单个位点编辑也更为便捷。

所述scem基因表达能识别18个核苷酸特定序列(attaccctgttatcccta)的归巢核酸酶。该酶经全基因组分析，在耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、新金分枝杆菌(mycobacteriumneoaurum)、偶发分枝杆菌(mycobacteriumfortuitum)、牝牛分枝杆菌(mycobacteriumvaccae)、牛型结核菌(mycobacteriumbovis)、鸟分枝杆菌(mycobacteriumavium)、麻风分枝杆菌(mycobacteriumleprae)、海鱼分枝杆菌(mycobacteriummarinum)中均不存在。这些分枝杆菌基因组中均没有scem的酶切位点，所有以上分枝杆菌理论上均可以使用本发明设计的scetm系统进行基因组编辑。

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seqidno:4

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