专利名称：一种草鱼出血病抗原蛋白及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物蛋白制备技术领域，更具体涉及一种草鱼出血病抗原蛋白，同时还涉及一种草鱼出血病抗原蛋白的制备方法，还涉及一种草鱼出血病抗原蛋白在制备草鱼出血病疫苗中的应用。
背景技术：
草鱼(Grass carp, Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水养殖鱼类之一，在我国淡水养殖中占重要地位。草鱼饲料来源广、生长速度快，肉质鲜美，深受广大养殖者和消费者喜爱。但是，草鱼病害多、养殖成活率低，妨碍了草鱼养殖业的发展。草鱼出血病是一种严重危害草鱼鱼种的病毒性疾病，其流行范围广、传播速度快，死亡率高，每年都 对草鱼养殖业造成巨大的经济损失。长期以来，草鱼出血病的防治技术研究一直是我国水产养殖病害防治技术研究的重要内容，草鱼出血病防治技术的研究不仅具有重要的理论意义，而且具有广阔的应用前景。草鱼出血病的主要病原为草鱼呼肠孤病毒。目前，市场上没有草鱼用草鱼出血病疫苗，但已申请一些相关专利，例如，中国发明专利申请200410060881. 2公开的一种草鱼呼肠孤病毒抗原亚单位疫苗制备，是采用草鱼肾细胞系即CIK细胞增殖草鱼呼肠孤病毒；通过离心法，对感染了草鱼呼肠孤病毒的细胞病毒悬液进行纯化和浓缩；表面活性剂处理纯化的病毒，使完整病毒结构解体，形成病毒核酸与衣壳蛋白亚单位组分；采用核酸酶消化，降解游离的病毒基因组dsRNA ;通过透析处理，得到不含核酸的草鱼呼肠孤病毒蛋白抗原亚单位制剂。又如中国发明专利申请201110189906. 9公开的一种草鱼呼肠孤病毒基因工程疫苗制备方法，是采用sf9昆虫细胞增殖重组草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP5和VP7的重组杆状病毒(vAcGCRV-VP5/VP7);经冻融裂解重组病毒感染的sf9细胞，采用蔗糖层离心法分离重组蛋白组分，由此得到纯化的体外表达VP5和VP7蛋白复合物；通过将纯化的VP5和VP7蛋白进行鱼体保护实验，证实其具有良好的免疫保护作用。但亚单位疫苗由于制备工艺复杂、成本高、难以广泛推广应用。寻找一种工艺简单、成本低，易于广泛推广的草鱼出血病疫苗对维护国家安全，保证食品安全、环境安全，促进草鱼养殖业可持续发展具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒，草鱼呼肠孤病毒GCRV-104，CCTCC N0:V201217，于2012年4月18日提交保藏。草鱼呼肠孤病毒颗粒是呈5 3 :2对称的正二十面体，直径范围在55_80nm，具有双层衣壳，无囊膜，该病毒粒子对酸碱(PH3-10)及高温处理有一定的抗性，对氯仿和乙醚不敏感，56°C处理半小时仍具有毒力，但处理一小时后则病毒感染力明显下降。草鱼呼肠孤病毒粒子在CsCl及蔗糖密度梯度离心中的浮力密度为分别为I. 37g/cm3和I. 305g/cm3，沉降系数为550S。因为该病毒核心可合成RNA聚合酶，且该酶最适温度为28°C，所以草鱼呼肠孤病毒的流行具有季节性。草鱼呼肠孤病毒104株在CIK细胞中病变明显，约接种24h后开始出现病变，接种5-6天时病变达90%。与草鱼呼肠孤其他株不同，草鱼呼肠孤病毒GCRV-104株在CIK中不出现网状卷起等病变，而是细胞变圆、变亮既而脱落。本发明的另一个目的在于提供了一种草鱼出血病抗原蛋白，本发明草鱼出血病抗原蛋白是草鱼呼肠孤病毒VP6重组蛋白，草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白能产生抗原反应，但却并不具有致病性，其使用较现有技术更为安全。本发明还有一个目的是在于提供了一种草鱼出血病抗原蛋白的制备方法，工艺简单、成本低，易于广泛推广的草鱼出血病疫苗，特别是大量工程化生产。
本发明还有一个目的是提供了一种草鱼出血病抗原蛋白在制备草鱼出血病疫苗中的应用。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种草鱼呼肠孤病毒GCRV-104，其制备过程是在湖北省荆州市江陵县文村采集疑似患草鱼出血病草鱼样，取病鱼的肝、脾、肾等内脏组织于无菌的培养皿中，用无菌眼科剪将其剪碎，加入10倍体积(V/W)的PBS，连同组织碎块一并转入玻璃匀浆器中在冰浴的条件下研磨成组织匀浆液。将组织匀浆液于-80°C冷冻，室温下融化，如此反复冻融3次。4°C条件下以5000 X g离心30min，上清液用O. 22 μ m滤器过滤除菌。取ImL的组织勻衆液,10 μ g助感染剂Polybrene接种到生长至汇合单层的CIK细胞中，置于28°C培养箱中吸附lh，期间每20min轻轻往复倾斜培养瓶数次，以利于病毒均匀吸附。吸附完毕后，弃去病毒液，每瓶加人5mL细胞维持液(含2%血清的MEM培养基)，置于25°C培养箱中继续培养，逐日观察细胞病变情况。当细胞单层出现70%-80%CPE时，收获细胞培养物，-80°C -室温条件(20°C-25°C，以下同)下冻融2次，于4°C条件下以4000Xg离心20min，弃去沉淀，病毒液分装于冻存管中-80°C保存备用。申请人已于2012年4月18号将该草鱼呼肠孤病毒GCRV-104送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC N0:V201217。一种草鱼出血病抗原蛋白制备方法，其步骤是本发明草鱼出血病抗原蛋白是草鱼呼肠孤病毒VP6重组蛋白。A.从草鱼呼肠孤病毒提取的病毒总RNA为模板；用草鱼呼肠孤病毒GCRV-104，从中提取病毒总RNA，以该病毒的总RNA为模板逆转录草鱼草鱼呼肠孤病毒VP6基因；根据草鱼呼肠孤病毒VP6基因的核苷酸全序列(GeneBank NO. HM234682)设计一对引物进行逆转录聚合酶链反应，克隆获得VP6蛋白基因；所用的引物序列为Pl :5’ -CGGAATTCATGGCACGTGTGGTTTAT-3，(划线处为 EcoR I 酶切位点)P2 :5’ -TCCCCGCGGGTGTGGTTACGCGGGTCAG-3，(划线处为 Sac II 酶切位点)。反应条件为48°C逆转录45分钟；94°C灭活及预变性5分钟；再经94°C I分钟，60 0C I分钟，72°C I分钟，反应40个循环；72°C延伸10分钟。B.然后转入酵母表达载体，获得重组表达载体；将前述逆转录聚合酶链反应产物和pPICZ B载体分别用EcoR I和Sac II双酶切，然后在连接酶的作用下使两产物连接，从而构建成pPICZ B-VP6表达载体。通过聚合酶链反应鉴定和酶切鉴定予以确认。鉴定肯定阳性质粒pPICZ B-VP6为带有完整草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因的重组质粒。测序结果表明，阳性质粒pPICZ B-VP6含有草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因的阅读框架。C.再将其导入酵母表达细菌中，获得重组毕赤酵母表达菌，增殖并进行诱导表达重组毕赤酵母表达菌；将步骤B中获得的重组子电转入毕赤酵母中，取200 μ I转化物涂布在ZEOCIN浓度梯度为O. 5、I. O、2. O、3. O、4. O和5. Omg/mL的YPDS平板上，置30°C恒温培养2 4天，逐级筛选ZEOCIN高抗性菌株，获得目的基因高拷贝重组菌株。从YPD-ZEOCIN平板上挑取筛选高拷贝菌落接种于IOOml BMGY培养基中，28°C 30°C振荡培养16 18h，当0D600=2 6时，室温1500g离心IOmin收集细胞，将收集的细胞用20ml BMMY培养基悬浮于250ml的三角瓶中，三层无菌纱布扎口，保证良好的通气性， 28°C振荡培养诱导表达,每24h向培养基中补加甲醇浓度至O. 5%,并且24h取样一次,取样量Iml以保证持续诱导表达。由重组毕赤酵母表达菌表达的草鱼出血病抗原蛋白，其序列为SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列。D.经分离纯化得到所用的抗原蛋白收集步骤C中得到的菌液通过冷冻干燥使其变成粉末，用100 μ I ρΗ7. 4的PBS悬浮使粉末尽量溶解，超声波裂解到菌液呈半透明，经SDS-PAGE电泳后得到纯化的目的蛋白，46kDa处即是。研究表明，草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白分子量是46kDa，是一个中和抗原，研究表明该蛋白具有免疫作用，能诱发免疫反应，由于草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白能产生抗原反应，但却并不具有致病性。而且酵母表达系统是一种简单的真核表达系统，能稳定高效表达外源蛋白，并能对表达产物进行翻译后加工和修饰，同时，其成熟的高密度发酵技术为目的蛋白的工业化生产提供了保障，因此采用草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白为亚单位疫苗可以完全克服现有技术的不足，其使用较现有技术更为安全。本发明的蛋白采用逆转录聚合酶链反应进行克隆，再经酵母重组菌的表达，使其具备大规模工业生产的条件。一种草鱼出血病抗原蛋白在制备草鱼出血病疫苗中的应用，其步骤是重组表达蛋白的Westen-blot分析(I).转印剪8块滤纸与I块硝酸纤维素膜(NC)，大小与凝胶相等，在转移缓冲液中浸泡3min，在正极板上按四层滤纸、NC膜、SDS-PAGE电泳凝胶、四层滤纸的顺序叠放整齐，确定无气泡后盖上负极板，IlOmA转移I小时。(2).封闭转移完成后，取下NC膜，切下标准分子量Marker，置氨基黑染色液中浸染5min，取出后用漂洗脱色，直至背景蓝色脱尽。其余NC膜用PBS冲洗，加入IOmL封闭液，室温轻轻振摇l_2hr。(3).与抗体的结合封闭结束后，用PBS冲冼NC膜4-5次，加入PBST 1:200倍稀释的鼠抗草鱼呼肠孤病毒104株VP6蛋白的多克隆抗体10mL，37°C结合I. 5小时，用PBST冲洗4-5次，每次在摇床缓慢摇动。加入1:2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(二抗)，室温下轻摇孵育I小时，取出用PBST冲洗3-4次，每次lOmin。(4).底物显色将NC膜转移到IOmL底物溶液中，室温避光轻摇3min观察显色情况，等出现条带时，立即转入PBST缓冲液中，室温保存。
(5).重组表达蛋白免疫鉴定结果重组pPICZ B-VP6表达产物经SDS-PAGE后转移至NC膜上进行免疫印迹试验，表达的VP6蛋白可与鼠抗草鱼呼肠孤病毒104株VP6蛋白的多克隆抗体发生很好的抗原一抗体反应，VP6蛋白具有免疫活性，完全可以作为草鱼出血病疫苗抗原蛋白。与现有技术相比，本发明还有如下优点I.本发明生产的疫苗抗原是中和性抗原蛋白，而不是灭活或者减毒的草鱼呼肠孤病毒，因此该蛋白作为疫苗安全可靠。2.本发明涉及的疫苗用抗原是蛋白质，与其他新型疫苗(如活载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗)相比不会发生可能出现的基因重组问题，因此本发明不存在生物安全性问题。3.本发明以酵母作为目的蛋白的表达载体，培养简单，可以用发酵罐规模化生产，可以实现质量控制，保证所生产的疫苗安全有效。4.本发明以酵母作为目的蛋白的表达载体，与大肠杆菌原核表达相比，表达量要高，其活性要远高于包涵体蛋白。5.本发明所表达的目的蛋白，可直接用于制备草鱼呼肠孤病毒VP6单克隆抗体的抗原。6.本发明的方法相对现有的疫苗技术而言要简单。
图I为一种pPICZ B-VP6酵母表达产物的电泳和Western-blot示意图。图IA为一种pPICZ B-VP6酵母表达产物的电泳示意图。其中M是蛋白分子量标准；1是pPICZB-VP6/KM71裂解沉淀；2是pPICZB_VP6/KM71裂解上清；3是pPICZB/KM71裂解上清。图IB为一种pPICZ B-VP6酵母表达产物Western-blot分析示意图。其中M是蛋白分子量标准；1是pPICZB-VP6/KM71裂解沉淀；2是pPICZB_VP6/KM71裂解上清；3是pPICZB/KM71裂解上清。
具体实施例方式本发明使用的主要材料病毒草鱼呼肠孤病毒GCRV-104保藏编号CCTCC NO :V201217。表达菌KM71为目的基因表达的酵母菌，用于质粒转化时须经山梨醇处理使其具有感受性，成为感受态细胞，该菌株可以从Invitrogen公司购买得到。pPICZ B载体为酵母表达载体,购自Invitrogen公司。引物所有基因扩增和改造用的引物均由大连宝生物有限公司合成。酶和试剂各种限制性内切酶和DNA连接酶购自Promega公司；Taq DNA聚合酶、10XPCR Buffer、dNTPs、DNA marker为TaKaRa公司产品；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒及酵母DNA提取试剂盒为OMEGA Bio-Tek公司产品；TRIzol LSReagent、胎牛血清、逆转录试剂盒和Zeocin 购自Invitrogen公司；蛋白质分子量标准购自Fermentas公司；鼠抗草鱼呼肠孤病毒104株VP6蛋白的多克隆抗体购自北京康碧泉生、物科技有限公司、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体为AB CLONAL公司产品；山梨醇、甲醇等生化试剂均为国产分析纯。实施例I :草鱼呼肠孤病毒GCRV-104的分离在湖北省荆州市江陵县文村采集疑似患草鱼出血病草鱼样，取病鱼的肝、脾、肾等内脏组织于无菌的培养皿中，用无菌眼科剪将其剪碎，加入10倍体积(V/W)的PBS，连同组织碎块一并转入玻璃匀浆器中在冰浴的条件下研磨成组织匀浆液。将组织匀浆液于-80°C冷冻，室温下融化，如此反复冻融3次。4°C条件下以5000 X g离心30min，上清液用O. 22 μ m滤器过滤除菌。取ImL的组织勻衆液,10 μ g助感染剂Polybrene接种到生长至汇合单层的CIK细胞中，置于28°C培养箱中吸附lh，期间每20min轻轻往复倾斜培养瓶数次，以利于病毒均匀吸附。吸附完毕后，弃去病毒液，每瓶加人5mL细胞维持液(含2%血清的MEM培养基)，置于25°C培养箱中继续培养，逐日观察细胞病变情况。当细胞单层出现70%-80%CPE时，收获细胞培养物，-80°C—室温条件下冻融2次，于4°C条件下以4000Xg离心20min，弃去沉淀，病毒液分装于冻存管中-80°C保存备用。该病毒于2012年4月18日提交保藏， 草鱼呼肠孤病毒 GCRV-104，CCTCC N0:V201217。实施例2 :提取草鱼呼肠孤病毒总RNA草鱼呼肠孤病毒104株是我国保存的标准株草鱼呼肠孤病毒GCRV-104保藏编号CCTCC NO V201217o培养草鱼肾脏细胞至汇合单层，吸出培养液，以感染复数为O. I的剂量，接种ImL经4000r/min离心5min除去细胞碎片的草鱼呼肠孤病毒细胞毒材料，添加10 μ L的Polybrene (终浓度10μ g/ml)，置于28°C培养箱中吸附lh，使病毒吸附细胞，吸附过程中每20min轻轻晃动培养瓶一次，使病毒液与细胞单层充分均匀接触，吸附Ih后，吸弃病毒液，加入5mL 2%胎牛血清(V/V)的培养液，置28°C培养，直至细胞出现明显的致细胞病变效应，收集细胞病变材料，置_80°C冰箱保存备用。细胞培养病毒_80°C至室温冻融3次，4000r/min离心30min，取上清20000r/min离心2h，弃上清，用250 μ L无核水悬浮，用Trizol LS提取草鱼呼肠孤病毒的RNA。(I)病毒悬液和TRIzol LS Reagent按I :3比例混合,在室温条件下放置5min。(2)每0.75mL TRIzol LS Reagent加入O. 2mL氯仿，盖紧盖子，用手剧烈摇晃15s,然后在室温条件下放置2 15min。(3)在2 8°C，12000g，离心15min，取上层液相移入一新管中。(4)每 0.75mL TRIzol LS Reagent 加入 O. 5mL 异丙醇，在室温下放置 lOmin。(5)在 2 8°C，12000g，离心 15min。(6)去除上清，加入无核水配制的75%乙醇(V/V)清洗RNA (每O. 75mL TRIzol LSReagent至少加ImL乙醇)，润旋混勻。(7)在2 8°C，lOOOOg，离心lOmin，在超净台中或真空干燥5 lOmin，得到草鱼呼肠
孤病毒总RNA。(8)用适量无核水(20 μ L)悬浮草鱼呼肠孤病毒总RNA，可用枪头轻轻吹吸，55 60°C水浴IOmin助溶，放入_80°C冰箱保存备用。本实施例中选用草鱼呼肠孤病毒104株，从中提取病毒总RNA，以该总RNA为模板，进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),所用弓I物对为
Pl :5’ -CGGAATTCATGGCACGTGTGGTTTAT-3’ (含 EcoR T 酶切位点)P2 :5’ -TCCCCGCGGGTGTGGTTACGCGGGTCAG-3 ’(含 Sac II 酶切位点)。反应条件为48°C逆转录45分钟；94°C灭活及预变性5分钟；再经94°C I分钟，60 0C I分钟，72°C I分钟，反应40个循环；72°C延伸10分钟。扩增片段包括草鱼呼肠孤病毒VP6基因的阅读框。实施例3 :构建重组质粒pPICZ B-VP6及转化酵母菌I.目的基因的克隆首先将前述逆转录聚合酶链反应产物和pPICZ B载体分别用EcoR I和Sac II双酶切，然后在连接酶的作用下使两产物连接，从而构建成pPICZ B-VP6表达载体。通过聚合酶链反应鉴定和酶切鉴定予以确认。鉴定肯定阳性质粒pPICZ B-VP6为带有完整草鱼呼肠 孤病毒VP6蛋白基因的重组质粒。测序结果表明，阳性质粒pPICZ B-VP6含有草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因的阅读框架。2. I试剂的配制10XYNB :称取13. 4g YNB (YNB为无氨基酸酵母氮源，酵母培养基组成成分)溶于IOOml去离子水，加热至YNB完全溶解，过滤除菌，4°C保存，可放I年。500XB 20mg生物素溶于IOOml去离子水，过滤除菌，4°C保存，可放I年。10XD:200g葡萄糖溶于IOOOml去离子水，高压(121 °C,O. 105PKa) 15min或过滤除菌，4°C保存，可放I年。IOXM 5ml甲醇溶于IOOml去离子水,过滤除菌,4°C保存,可保存2月。10XGY :10ml 甘油溶于 90ml 去离子水，高压(121°C，O. 105PKa) 20min 灭菌，4°C保存，可放I年以上。IM 磷酸盐缓冲液(pH6.0) 1M K2HP04132ml, IM KH2P04868ml, H3PO4 调至 ρΗ6· 0，高压灭菌(121。。，O. 105PKa)，4°C保存。Yro和Yro平板lg酵母提取物，2g蛋白胨，溶于90ml去离子水，高压灭菌(121°C，O. 105PKa)，冷却后加入IOml 10 XD，制板加I. 5g琼脂粉。BMGY=Ig酵母提取物，2g蛋白胨，溶于70ml去离子水，高压灭菌(121 °C，O. 105PKa)，冷却后加入 IOml IM 磷酸盐缓冲液，IOml 10 X YNB, O. 2ml 500 XB，IOml10XGY。BMMY:lg酵母提取物，2g蛋白胨，溶于70ml去离子水，高压灭菌(121 °C，O. 105PKa)，冷却后加入 IOml IM 磷酸盐缓冲液，IOml 10 X YNB, O. 2ml 500 XB, IOml10XM。2. 2将pPICZ B-VP6表达载体碱裂解法小量提取质粒。2. 3对重组质粒pPICZ B-VP6的鉴定鉴定包括以下方面(I)重组质粒pPICZ B-VP6琼脂糖凝胶电泳鉴定；(2)重组质粒pPICZ B-VP6的PCR扩增；即用含有如下两个酶切位点的P1、P2引物对重组质粒进行PCR扩增鉴定；Pl :5’ -CGGAATTCATGGCACGTGTGGTTTAT-3’，划线处为 EcoR I 酶切位点；P2 :5’ -TCCCCGCGGGTGTGGTTACGCGGGTCAG-3’，划线处为 Sac II 酶切位点；
(3)重组质粒pPICZ B-VP6的酶切鉴定；即用EcoRI和Sac II双酶切鉴定；(4)重组质粒pPICZ B-VP6的测序确证；(5)用DNAstar软件对序列进行分析，并与已发表的序列进行同源性比较。经以上的鉴定证明获得的正确目的基因已准确的连接到表达载体上，并成功的构建了 P PICZ B-VP6重组表达载体。2. 4毕赤酵母感受态细胞的制备、转化和筛选(I)将划线培养的毕赤酵母KM71单菌落接种于3ml YB)培养基中，2 8°C，250r/min摇荡培养24 28h。(2)取培养基100 μ I转接于20mlYPD培养基中，28°C，250r/min振荡培养过夜，0D600=1. 3 I. 5 时，4°C 1500g 离心 5min 收获细胞。(3)细胞依次用100ml、50ml冰预冷水和20ml冰预冷的IM山梨醇洗涤，4°C 1500g离心5min,最后用O. 8ml冰预冷的IM山梨醇悬浮菌体,置冰浴。(4)取Sal I线形化的重组载体10 μ I ( 100 μ g)与80 μ I毕赤酵母感受态细胞混匀，然后转入到冰预冷的O. 2cm的电转移杯中，冰上放置5min。(5)将电转移杯放在电穿孔仪上用脉冲电流电击一次，电转条件电压1500V，电容25F，电阻200 Ω，时间5ms，温度(TC。(6)电击结束，立即加入Iml冰预冷的IM山梨醇，混勻，取200 μ I转化物涂布在ZE OCIN浓度梯度为O. 5、I. 0,2. 0,3. 0,4. O和5. Omg/mL的YPDS平板上，置30°C恒温培养2 4天，逐级筛选ZEOCIN高抗性菌株，获得目的基因高拷贝重组菌株pPICZB-VP6/KM71。实施例4 :重组蛋白pPICZB-VP6蛋白在酵母表达菌中的表达从YPD-ZEOCIN平板上挑取筛选高拷贝菌落接种于IOOml BMGY培养基中，28°C 30°C振荡培养16 18h，当0D600=2 6时，室温1500g离心IOmin收集细胞，将收集的细胞用20ml BMMY培养基悬浮于250ml的三角瓶中，三层无菌纱布扎口，保证良好的通气性，28°C振荡培养诱导表达，每24h向培养基中补加甲醇浓度至O. 5% (V/V)，并且24h取样一次，取样量Iml以保证持续诱导表达。收集的菌液通过冷冻干燥使其变成粉末，用100 μ I ρΗ7. 4的PBS悬浮使粉末尽量溶解。I.重组蛋白pPICZ B-VP6电泳检测( I )SDS_PAGE 溶液的配制Tris-甘氨酸缓冲液25mmol/L Tris、250mmol/L 甘氨酸(pH 8. O) ,0. 1%SDS。2XSDS 上样 buffer IOOmmoI/L Tris. Cl (ρΗ8· O)、200mmol/L 巯基乙醇、4%SDS、O. 2% 溴酚蓝(W/V)、20% 甘油(V/V)。氨基黑染色液(100ml) :0. 5g氨基黑IOB溶于60ml水、30ml乙醇、IOml冰乙酸中。封闭液10mlPBST+0. 3g BSA。底物溶液(30ml)30ml PBST 中溶解 15mg 的 DAB(二氨基联苯胺)，9mgCoCl ·6Η20，加入10 μ I 30%Η202混匀后立即使用。5Χ 核酸上样缓冲液50% 甘油(V/V)、50mmol/L EDTA ρΗ8· 0、0· 125% 溴酚蓝(W/V)、O. 125% 二甲苯氰(W/V) O考马斯亮蓝染色液45ml甲醇、45ml水、IOml冰醋酸中溶解O. 25g考马斯亮蓝R250。脱色液30%甲醇(V/V)、10%冰乙酸(V/V)，蒸馏水补体积至100ml。PBST 溶液5. 8g Na2HPO4 · 12Η20、0· 4g KCl、0.4g KH2P04、16g NaClUml 吐温-20，蒸馏水补体积至2000ml。(ii)sds-page(I)洗净玻璃板，固定在电泳槽上，用2.0%琼脂糖封边。按《分子克隆》的配方配制15%的分离胶20ml，迅速注入两玻璃板之间，胶顶覆盖Iml双蒸水。待分离胶凝固后倾出覆盖层液体，用去离子水冲洗凝胶顶部数次，倒置空干液体，加入2ml 5%的积层胶溶液，插上梳子，垂直放置电泳槽使其凝固。(2)小心移去梳子，在电泳装置上、下槽间加入Tris-甘氨酸缓冲液，用注射器冲洗加样孔数次，将电源负极与上槽相连。(3)收集的菌液通过冷冻干燥使其变成粉末，用100 μ I ρΗ7. 4的PBS悬浮，超声波裂解到菌液呈半透明，加入等体积的2 X SDS上样buffer，混匀，水浴煮沸5min，用微量进样器上样20 μ I，打开电源，用80V电压电泳至溴酚蓝进入分离胶，把电压提高到120V，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。(4)染色取下凝胶用蒸馏水冲洗，用5倍凝胶体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，放在脱色摇床上室温染色3h。(5)脱色用30% (V/V)甲醇、10% (V/V)冰乙酸的混合液，在脱色摇床上脱色过夜，其间更换染色液3 4次。待蓝色背景完全脱净后，将凝胶浸入蒸馏水中终止脱色。实施例5 :重组蛋白pPICZB-VP6在制备草鱼出血病疫苗中的应用(I) Western-blot 分析溶液的配制洗漆液溶液150mmol/LNaCl50mmol/L Tris-HCl pH7. 5转移缓冲液39mmol/L甘氨酸48mmol/L Tris 喊O. 037% SDS (W/V)20% 甲醇(V/V)氨基黑染色液(IOOmL) :0. 5g氨基黑IOB溶于40mL双蒸水、50mL甲醇、IOmL冰乙酸中。封闭液10mLPBST+0. 3g BSA
底物溶液(30mL)在30mL PBST中加入15mg的DAB (二氨基联苯胺)和9mgCoC12 · 6H20使其溶解，加入10 μ I 30%Η202混匀后立即使用。(II)重组表达蛋白的Westen-blot分析(I).转印剪8块滤纸与I块硝酸纤维素膜(NC)，大小与凝胶相等，在转移缓冲液中浸泡3min，在正极板上按四层滤纸、NC膜、SDS-PAGE电泳凝胶、四层滤纸的顺序叠放整齐，确定无气泡后盖上负极板，IlOmA转移I小时。(2).封闭转移完成后，取下NC膜，切下标准分子量Marker，置氨基黑染色液中浸染5min，取出后用漂洗脱色，直至背景蓝色脱尽。其余NC膜用PBS冲洗，加入IOmL封闭液，室温轻轻振摇l_2hr。
(3).与抗体的结合封闭结束后，用PBS冲冼NC膜4-5次，加入PBST 1:200倍稀释的鼠抗草鱼呼肠孤病毒104株VP6蛋白的多克隆抗体10mL，37°C结合I. 5小时，用PBST冲洗4-5次，每次在摇床缓慢摇动。加入1:2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(二抗)，室温下轻摇孵育I小时，取出用PBST冲洗3-4次，每次lOmin。(4).底物显色将NC膜转移到IOmL底物溶液中，室温避光轻摇3min观察显色情况，等出现条带时，立即转入PBST缓冲液中，室温保存。(5).重组表达蛋白免疫鉴定结果重组pPICZB-VP6表达产物经SDS-PAGE后转移至NC膜上进行免疫印迹试验，结果在46kDa左右出现明显的阳性反应带，说明表达产物能被鼠抗草鱼呼肠孤病毒104株VP6蛋白的多克隆抗体所识别，具有免疫性。、
以上试验说明表达的VP6蛋白可与鼠抗草鱼呼肠孤病毒104株VP6蛋白的多克隆抗体发生很好的抗原一抗体反应，VP6蛋白具有免疫活性，完全可以作为草鱼出血病疫苗抗原蛋白。
权利要求
1.一种草鱼呼肠孤病毒，其特征在于草鱼呼肠孤病毒GCRV-104，CCTCC N0:V201217。
2.根据权利要求I所述的草鱼呼肠孤病毒制得的一种草鱼出血病抗原蛋白，其特征在于其序列为SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列。
3.权利要求2所述的一种草鱼出血病抗原蛋白的制备方法，其步骤是 A.逆转录草鱼草鱼呼肠孤病毒VP6基因 用草鱼呼肠孤病毒GCRV-104，从中提取病毒总RNA，以总RNA为模板逆转录草鱼草鱼呼肠孤病毒VP6基因； 根据草鱼呼肠孤病毒VP6基因的核苷酸全序列设计一对引物进行逆转录聚合酶链反应，克隆获得VP6蛋白基因；所用的引物序列为 Pl :5’ -CGGAATTCATGGCACGTGTGGTTTAT-3’,划线处为 EcoR I 酶切位点； P2 :5’ -TCCCCGCGGGTGTGGTTACGCGGGTCAG-3’,划线处为 Sac II 酶切位点； 反应条件为48°C逆转录45分钟；94°C灭活及预变性5分钟；再经94°C I分钟，60°CI分钟，72 0C I分钟，反应40个循环；72°C延伸10分钟； B.构建酵母表达重组子 将步骤A逆转录聚合酶链反应产物和pPICZ B载体分别用I和fee II双酶切，然后在连接酶的作用下使两产物连接，构建成pPICZ B-VP6表达载体，通过聚合酶链反应鉴定和酶切鉴定予以确认； C.构建重组毕赤酵母表达菌，增殖并进行诱导表达重组毕赤酵母表达菌； 将步骤B中获得的重组子电转入毕赤酵母中，取200 μ I转化物涂布在ZEOCIN浓度梯度为O. 5、I. O、2. O、3. O、4. O和5. O mg/mL的YPDS平板上，置30°C恒温培养2 4天，逐级筛选ZEOCIN高抗性菌株，获得目的基因高拷贝重组菌株； 从YPD-ZE0CIN平板上挑取筛选高拷贝菌落接种于100 ml BMGY培养基中，28°C 30°C振荡培养16 18 h，当0D600为2 6时，室温1500 g离心10 min收集细胞，将收集的细胞用20 ml BMMY培养基悬浮于100 ml的三角瓶中，三层无菌纱布扎口，保证良好的通气性，28°C振荡培养诱导表达，每24h向培养基中补加甲醇浓度至O. 5%V/V，并且24 h取样一次，取样量I ml以保证持续诱导表达； D.经分离纯化得到所用的抗原蛋白收集步骤C中得到的菌液通过冷冻干燥使其变成粉末，用100 μ I ρΗ7. 4的PBS悬浮使粉末尽量溶解，超声波裂解到菌液呈半透明，经SDS-PAGE电泳后46KDa处即为目的蛋白。
4.权利要求2所述的一种草鱼出血病抗原蛋白在制备草鱼出血病疫苗中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种草鱼出血病抗原蛋白及制备方法和应用，其步骤是A.根据草鱼呼肠孤病毒VP6基因的核苷酸全序列设计引物进行逆转录聚合酶链反应，克隆获得VP6蛋白基因；B.将步骤A逆转录聚合酶链反应产物和pPICZB载体分别用EcoRⅠ和SacⅡ双酶切，构建成pPICZB-VP6表达载体；C.将步骤B中获得的重组子电转入毕赤酵母中，涂布到含有ZEOCIN抗生素的YPDS平板，筛选获得含目的基因的高拷贝重组酵母菌株；D.经分离纯化得到所用的抗原蛋白。该方法简单，易操作，可以用发酵罐进行规模化生产，蛋白安全可靠，具有免疫活性，完全可以作为草鱼出血病疫苗抗原蛋白。
文档编号C12N15/81GK102703390SQ20121016130
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月23日 优先权日2012年5月23日
发明者周勇, 曾令兵, 苏岚 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所