专利名称：一种抑制结核分枝杆菌的化合物、其筛选方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法、采用所述筛选方法筛选所得抑制结核分枝杆菌的化合物以及该化合物的用途。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的传染性疾病。根据世界卫生组织统计，全世界约有1/3人口感染结核菌，每年约有880万新发病例，200万人因结核病而死亡。目前结核病治疗药物需长期使用，对人体的伤害很大，而且感染菌可在宿主的干酪化的病灶中长期潜伏而成为休眠菌，一旦防御免疫机能低下即可“死灰复燃”而重 新发病。目前多重耐药结核分枝杆菌的出现及结核菌在患者体内的“持留”状态，已经成为结核病预防和治疗过程中的重大问题。因此，寻找新的药物作用靶点，建立新的药物筛选模型，研制出能控制多重耐药性结核杆菌和根除休眠菌的强力低毒抗结核药物非常关键。目前寻找新型抗结核药物的方法大多限于药敏试验，但是结核分枝杆菌由于生长速度缓慢，一次药敏试验周期长达3-4周，不适于大规模筛选，也难发现新型药物。传统抗结核药物通过抑制细胞壁合成或细菌生长来杀灭MTB，但同时会产生MTB选择性压力。靶向分泌型毒力因子的药物有效解决了这个问题，也避免了药物通过细胞壁时产生渗透性障碍。对于免疫系统受到损害的患者(如HIV感染者)及高风险感染TB的医务工作者，这些药物也能降低感染几率。此类抑制剂与传统的抗生素联用还可以有效清除感染，减少MTB抗性产生。mPTPA/mPTPB是MTB的分泌型毒力因子，以mPTPA/mPTPB为药物靶标筛选出很多有应用前景的抑制剂，预示着未来TB治疗的可选择性。目前很多mPTPA/mPTPB的抑制剂有进一步发展的潜力。新发现的有双位点活性的isoxazole-salicylate化合物具有细胞活性，在感染MTB的巨噬细胞内证明了其治疗效应。与对照相比，消减了巨噬细胞内MTB90%的生长。其独特双位点结合抑制模型是其较高活性及选择性的结构基础，这种结构也为以后设计新抑制剂提供了思路。但是，更多的抑制剂由于缺乏晶体结构信息，阻碍了它们的进一步优化。作为判断治疗药物的标准，对抑制剂与靶标结合复合物进行晶体结构研究及动物模式实验是目前急需的。酪氨酸磷酸酶能特异地水解蛋白质底物上的酪氨酸磷酸酯键，脱去磷酸，从而调节该蛋白质功能的酶。蛋白酪氨酸残基的磷酸化作用对于调节生理应答过程起着重要作用，例如细胞增殖和分化、细胞迁移、免疫细胞活化和凋亡等。因此，如果细胞中的酪氨酸磷酸化作用失调会引起严重的后果，包括可能会引起自体免疫、非正常代谢应答和细胞转化等，随之而来的是许多疾病的产生，包括癌症，糖尿病和自身免疫缺陷。有报道PTPB特异性抑制剂有望提高胰岛素的敏感性，有效地治疗2型糖尿病、胰岛素抵抗和肥胖症。这就提示我们，酪氨酸酶抑制剂可能在治疗诱因是mPTPB引起的疾病方面也有显著效果，包括糖尿病、肥胖、高脂血、高甘油三酯血、高胆固醇血、低HDL水平、动脉粥样硬化、血管再狭窄、炎性肠病、胰腺炎、脂肪细胞肿瘤、脂肪细胞癌、脂肉瘤、血脂异常、肿瘤、癌症，自身免疫疾病等。
结核病作为全球性的公共健康问题，通过借鉴抗癌药物研究成果及研究思路，结合癌细胞中蛋白磷酸酶的信号机制及抑制剂筛选的方法，有助于加速新的抗结核药物面市。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法；同时本发明还提供了采用所述筛选方法筛选得到的抑制结核分枝杆菌的化合物，以及所述化合物的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法，包括以下步骤(I)建立以酪氨酸磷酸酶为靶点的筛选模型以结核菌H37Rv株基因组DNA为模板，PCR克隆酪氨酸磷酸酶基因，转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酪氨酸磷酸酶，进行酶活分析，建立以酪氨酸磷酸酶为靶点的筛选模型；
(2)利用步骤(I)所建立的筛选模型筛选对酪氨酸磷酸酶具有抑制活性的化合物。作为本发明所述抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法的优选实施方式，所述步骤(O中采用的宿主细胞为大肠杆菌，用表达载体的目的片段经双酶切，与pET-28a(+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达，获得重组酪氨酸磷酸酶。作为本发明所述抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法的优选实施方式，所述的IPTG终浓度为O. I O. 2mM,诱导温度为18 37°C。作为本发明所述抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法的优选实施方式，所述步骤(I)中采用酪氨酸磷酸酶试剂盒(RediPlate. % Fn/Chek. TyrosinePhosphatase AssayKit, Molecular Probes, Inc)对重组酪氨酸磷酸酶进行酶活分析。同时，本发明还提供一种抑制结核分枝杆菌的化合物，所述化合物采用上述的筛选方法筛选得到。所述化合物的作用靶点为酪氨酸磷酸酶。所筛选得到的化合物具有抗结核分枝杆菌的功效，能够有效抑制酪氨酸磷酸酶活性。所述化合物命名为Bostrycin。作为本发明所述抑制结核分枝杆菌的化合物的优选实施方式，所述化合物命名为Bostrycin,所述化合物的分子结构式为
O OH OH O OH
O作为本发明所述抑制结核分枝杆菌的化合物的优选实施方式，所述化合物是海洋微生物天然代谢活性产物。作为本发明所述抑制结核分枝杆菌的化合物的优选实施方式，所述化合物抑制结核分枝杆菌的最低浓度为7. 5 μ g/mL，此结果采用微量刃天青法测定所得。作为本发明所述抑制结核分枝杆菌的化合物的优选实施方式，所述化合物的作用靶点为酪氨酸磷酸酶。所述化合物的作用靶点的验证方法包括以下步骤
( I)利用权利要求I中步骤(I)所建立的模型验证化合物对酪氨酸磷酸酶的酶活抑制活性；(2)利用Docking软件进行生物信息学预测，化合物与酪氨酸磷酸酶相互作用；(3)利用荧光光谱验证，化合物与酪氨酸磷酸酶相互作用；(4)利用圆二色谱验证，化合物 酪氨酸磷酸酶相互作用。本发明还提供了如上所述抑制结核分枝杆菌的化合物在制备用于治疗诱因或诱因之一是酪氨酸磷酸酶的疾病的药物中的用途。本发明所述抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法，首先建立以酪氨酸磷酸酶为靶点的筛选模型，建立的筛选模型能快速、高效筛选具有抗结核分枝杆菌功效的酪氨酸磷酸酶抑制剂，减少工作量，加快工作效率，提高获得阳性实验结果的几率。采用本发明所述筛选方法筛选得到的化合物，具有抗结核分枝杆菌的功效，以酪氨酸磷酸酶为作用靶点，能够有效抑制酪氨酸磷酸酶活性，具有较大的临床应用前景和潜力。
图I为本发明抑制结核分枝杆菌的化合物的分子结构式。图2为结核分枝杆菌H37Rv基因组中酪氨酸磷酸酶在E. coli BL21 (PlysS)中表达图；图2中，M为标准蛋白分子量maker，I为重组蛋白粗提物，2为纯化的重组蛋白。图3为不同浓度酪氨酸磷酸酶酶活图；图3中，从^Te，酪氨酸磷酸酶浓度呈10倍增加。图4为基于酪氨酸磷酸酶活性的抑制剂筛选图；图4中，I号为空白对照，2号为原矾酸钠正对照，3号为阴性对照，Γ29号为所筛选的化合物。图5为基于酪氨酸磷酸酶活性的抑制剂筛选图；图5中，30号为空白对照，31号为原矾酸钠正对照，32号为阴性对照，33 59号为所筛选的化合物。图6为部分化合物抑制结核分枝杆菌H37Ra的效果图；图6中，37代表化合物Bostrycin, 38 41代表Bostrycin的衍生物。图7为部分化合物抑制结核分枝杆菌H37Ra的效果图；图7中，42 44代表Bostrycin的衍生物，45代表药物利福平，46代表溶解化合物的溶剂DMSO。图8为Bostrycin与mPTPB相互作用示意9为25°C时不同浓度比的化合物Bostrycin与酪氨酸磷酸酶mPTPB相互作用的荧光发射光谱图；图 9 中，a 0 ；b :0· 25 ；c :0· 5 ；d :0· 75 ；e :1 ；f I. 25 ；g :1. 5。图10为25°C时不同浓度比的DMSO与酪氨酸磷酸酶mPTPB相互作用的荧光发射光谱；图 10 中，a 0 ；b :0· 25 ；c :0· 5 ；d :0· 75 ；e :1 ；f I. 25 ；g :1. 5。图11为不同浓度比的化合物Bostrycin与酪氨酸磷酸酶mPTPB相互作用的⑶光谱图；图11 中，a 0 ；b :0· 5 ；c :1 ；d :1. 5。图12为不同浓度比的甲醇与酪氨酸磷酸酶mPTPB相互作用的⑶光谱图；图 12 中，a :0 ;b :0. 5 ;c :1 ;d :1· 5。
具体实施例方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。实施例I抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法中筛选模型的建立本实施例以酚氯仿抽提法提取了结核菌H37Rv基因组DNA，并以之为模板，PCR克隆mptpb基因，使其在E. coli BL21 (PlysS)中高效表达，见附图2 所示，利用镍离子亲和层析柱纯化得到mPTPB蛋白，利用酪氨酸磷酸酶试剂盒(RediPlate. 96 EnzChek TyrosinePhosphatase Assay Kit, Molecular Probes, Inc)进行酶活分析,建立了以酪氨酸憐酸酶为靶点的筛选模型。不同浓度的酪氨酸磷酸酶酶活如附图3所示。实施例2抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法中筛选模型的应用I、抑制剂筛选利用实施例I建立的以酪氨酸磷酸酶为靶点的筛选模型，对化合物抑制酪氨酸磷酸酶mPIPB酶活性进行分析，采用酪氨酸磷酸酶试剂盒(RediPlate. 96 EnzChek(R)Tyrosine Phosphatase Assay Kit, Molecular Probes, Inc),对 84 种分离自海洋真菌的化合物及其衍生物进行了筛选，其中42种化合物具有酶的抑制活性，对H37Ra进行的药敏试验和MIC试验发现有39种具有抑菌圈。其中，化合物Bostrycin (分子结构式见附图I所示)及其衍生物，抑制酶活性与抑菌圈的出现有较强的相关性，说明该药物的作用靶点为mPTPB。本实施例所用抑制mPTPB酶活性的正对照为原钒酸钠(Na3VO4),试验设计详见表
Io表I筛选新型抗结核药物试验设计
权利要求
1.一种抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)建立以酪氨酸磷酸酶为靶点的筛选模型以结核菌H37RV株基因组DNA为模板，PCR克隆酪氨酸磷酸酶基因，转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酪氨酸磷酸酶，进行酶活分析，建立以酪氨酸磷酸酶为靶点的筛选模型； (2)利用步骤(I)所建立的筛选模型筛选对酪氨酸磷酸酶具有抑制活性的化合物。
2.如权利要求I所述的抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法，其特征在于，所述步骤(O中采用的宿主细胞为大肠杆菌，用表达载体的目的片段经双酶切，与pET-28a(+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达，获得重组酪氨酸磷酸酶。
3.如权利要求I所述的抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法，其特征在于，所述步骤(I)中采用酪氨酸磷酸酶试剂盒对重组酪氨酸磷酸酶进行酶活分析。
4.一种抑制结核分枝杆菌的化合物，其特征在于，所述化合物采用权利要求I中的方法筛选得到。
5.如权利要求3所述的抑制结核分枝杆菌的化合物，其特征在于，所述化合物命名为Bostrycin,所述化合物的分子结构式为
6.如权利要求4或5所述的抑制结核分枝杆菌的化合物，其特征在于，所述化合物是海洋微生物天然代谢活性产物。
7.如权利要求4或5所述的抑制结核分枝杆菌的化合物，其特征在于，所述化合物抑制结核分枝杆菌的最低浓度为7. 5 μ g/mL。
8.—种如权利要求4或5所述的化合物，其特征在于，所述化合物的作用靶点为酪氨酸磷酸酶。
9.一种如权利要求8所述的化合物，其特征在于，所述化合物的作用靶点的验证方法包括以下步骤 (1)利用权利要求I中步骤(I)所建立的模型验证化合物对酪氨酸磷酸酶的酶活抑制活性； (2)利用Docking软件进行生物信息学预测，化合物与酪氨酸磷酸酶相互作用； (3)利用荧光光谱验证，化合物与酪氨酸磷酸酶相互作用； (4)利用圆二色谱验证，化合物与酪氨酸磷酸酶相互作用。
10.一种如权利要求4或5所述化合物在制备用于治疗诱因或诱因之一是酪氨酸磷酸酶的疾病的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开一种抑制结核分枝杆菌化合物的筛选方法，包括以下步骤(1)建立以酪氨酸磷酸酶为靶点的筛选模型以结核菌H37Rv株基因组DNA为模板，PCR克隆酪氨酸磷酸酶基因，转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酪氨酸磷酸酶，进行酶活分析，建立以酪氨酸磷酸酶为靶点的筛选模型；(2)利用步骤(1)所建立的筛选模型筛选对酪氨酸磷酸酶具有抑制活性的化合物。采用所述方法能快速、高效筛选具有抗结核分枝杆菌功效的酪氨酸磷酸酶抑制剂。另外，本发明还公开了一种采用所述筛选方法筛选得到的化合物，以及所述化合物在制备用于治疗诱因或诱因之一是酪氨酸磷酸酶的疾病的药物中的用途。
文档编号C12Q1/02GK102732474SQ20121016114
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日
发明者佘志刚, 牛长红, 陆勇军, 陈洪 申请人:中山大学