专利名称：双组分系统基因dtrA和dtrB的用途与利用方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及耐辐射异常球菌Rl中一对双组分系统基因dtrA和dtrB在提高菌株热敏感性和UV辐射抗性上的用途和利用方法。
背景技术：
耐福射异常球菌Rl (Deinococcus radiodurans Rl)具有超强的电离福射、紫外线、DNA损伤试剂及干燥的抗性，备受各国科学家的关注和重视。如宋道军、余增亮的《耐辐射异常球菌抗辐射机理的研究新进展》中报道了各国在耐辐射异常球菌生理生化和遗传学特性、特殊的细胞膜结构、各种诱变因素所致的DNA损伤与其高效的修复机制方面的研究；基因组分析显示，耐辐射球菌Rl中含有20种组氨酸激酶和26种反应调控蛋白，存在多个 双组分系统，其中二号染色体上的dr_a0009 (dtrA)和dr_a0010 (dtrB)基因分别编码组氨酸激酶和反应调控蛋白，与枯草芽孢杆菌的同源性为40%以上。当外界或内部环境发生变化吋，组氨酸激酶的传感器结构域能够感应环境的刺激并迅速ニ聚化，导致催化ATP依赖的特定的组氨酸残基自我磷酸化，然后反应调控蛋白催化组氨酸的磷酸基团转移到它自身的天门冬氨酸残基上，反应调控蛋白的磷酸化激活效应器结构域，从而与下游基因的启动子或与蛋白作用，产生调控应答反应。细胞内有一系列的信号转导途径应对外界环境刺激，其中热激和UV辐射是ー种重要的逆境胁迫。热激反应是细胞和有机体应对温度升高时的ー种保守反应，能保护细胞和有机体免受热损伤，使得细胞恢复正常的生理活动，从而达到ー个更高的耐热性水平。热激能迅速诱导ー套基因的表达，同时使细胞膜的流动性发生变化。UV辐射能够产生嘧啶ニ聚体，造成的DNA损伤。目前，耐福射异常球菌 Rl (Deinococcus radiodurans Rl)中 dtrA (dr a0009,GeneID:1798204)基因和 dtrB (dr aOOlO, Gene ID: 1798154)基因对于热激反应和 UV辐照的研究尚未见报道。而在发酵行业中，需要高温发酵杀死虫卵及ー些有害细菌，可以提高发酵的质量，因此发酵行业对于热敏感菌株具有较大需求。紫外线(ultravioletradiation, UV)对人体皮肤造成损伤已日益得到人们的重视，随之产生多种针对皮肤的防晒产品，在化妆品行业对抗UV辐射菌株的需求也与日俱增，因此利用基因工程研究基因在菌株热敏感性和UV辐射抗性中的应用是非常重要并具有经济价值的。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明提供了一种双组分系统基因dtrA和dtrB的用途，用于提高菌株热敏感性和UV辐射抗性。双组分系统基因dtrA和dtrB的序列如SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2所示。本发明还提供了ー种利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法,包括克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤，双组分系统基因的序列如SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2所示，还包括构建具有热敏感性和UV辐射抗性的Λ dtrA和AdtrB突变株的步骤。克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤包括设计dtrA和dtrB基因的PCR扩增特异性引物。从Deinococcus radiodurans基因组DNA中扩增出完整的dtrA和dtrB核苷酸序列。构建具有热敏感性和UV辐射抗性的Λ dtrA和Λ dtrB突变株的步骤包括I).用SacII酶和EcoRV酶将分别连接在载体上的dtrA基因和dtrB基因从中间切开；2).插入两端加了同一酶切位点的卡那抗性盒，测序验证克隆基因；3).通过PCR将插入卡那抗性盒的目的片段扩增出来；
4).将插入卡那抗性盒的DNA片段通过同源重组的方法直接转化到耐辐射异常球菌Rl中。优选的是,所述连接dtrA和dtrB基因的载体为T载体。进ー步优选的是，所述连接dtrA基因的载体为pMD19T载体。进ー步优选的是,所述连接dtrB基因的载体为pGEM_T Easy载体。具体将DNA片段转化到耐辐射异常球菌Rl中的步骤如下I)挑取耐辐射异常球菌Rl单菌落于TGY液体培养基中，30°C培养至对数期；2)按1:100转接至新鲜的TGY液体培养基中，30°C培养至对数期(0D_ ^ O. 4);3)取2111し菌液6000\8离心2111丨11，去上清，用20(^し含301111 CaCl2的TGY液体培养基重悬菌体，30°C水浴80min ；4)吸50 μ L上述菌悬液于一新的EP管中，加入10 μ L冰上放置的DNA片段，振荡混匀后，30°C水浴90min ；5)加800 μ L新鲜TGY液体培养基混匀，于30°C摇床中培养4h ；6)取100 μ L培养好的菌液涂布于不含抗生素的TGY固体培养基上，30°C培养约2d ；7)挑取单菌落，提取其基因组，用验证引物进行PCR验证，获得AdtrA和AdtrB
突变株。对该突变株进行一系列生理生化分析，实验结果显示，本发明所述的dtrA基因和dtrB基因突变后，导致在高温(42°C )下生长时两突变株较野生型Rl敏感，同时突变株的UV辐射抗性增强。该双组分系统基因dtrA和dtrB的提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的功能可以被利用在发酵行业，将该双组分系统基因的突变AdtrA和AdtrB作为发酵用菌株，可提闻菌株耐闻温的能力，提闻闻温细菌的分解代谢能力，缩短发酵时间，提闻生广能力，減少染菌的机会，提高发酵的产量和质量；将该双组分系统基因dtrA和dtrB应用到生产抗UV辐射的化妆品行业，可利用转化了该系统基因的菌株生产的可吸收紫外光辐射的代谢产物生产抗紫外线辐射化妆品，具有良好的应用前景。
图I是含有D. radiodurans Rl中dtrA基因序列的PCR产物验证电泳图谱；图2是含有D. radiodurans Rl中dtrB基因序列的PCR产物验证电泳图谱；图3是野生型Rl和突变株Λ dtrA和Λ dtrB生长到对数期后，经30°C正常温度处理3h后的生长情况的照片，图中a为野生型Rl ；b 为 Λ dtrA 突变株；c 为 AdtrB 突变株；图4是野生型Rl和突变株Λ dtrA和Λ dtrB生长到对数期后，经42°C高温热激处理3h后的生长情况的照片，图中a为野生型Rl ；b 为 Λ dtrA 突变株；c 为 Λ dtrB 突变株； 图5是野生型Rl和突变株AdtrA和Λ dtrB在42°C高温处理下的生长曲线，其中a为野生型Rl ；b 为 Λ dtrA 突变株；c 为 Λ dtrB 突变株；图6是UV辐照前野生型Rl和突变株Λ dtrA和Λ dtrB的生长情况的照片，图中a为野生型Rl;b 为 Λ dtrA 突变株；c 为 Λ dtrB 突变株；图7是UV辐照处理7min后野生型Rl和突变株Λ dtrA和Λ dtrB的生长情况的照片，图中a为野生型Rl ；b 为 Λ dtrA 突变株；c 为 Λ dtrB 突变株；
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解为这些实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件。实施例IdtrA和dtrB核苷酸序列SEQ ID NO: I的克隆根据已公布的Deinococcus radioduransRl菌株的基因组序列，设计dtrA和dtrB基因的PCR扩增特异性引物。从Deinococcus radiodurans基因组DNA中扩增出完整的dtrA和dtrB核苷酸序列dtrA-Up 5， CGCCACGAACACGGTCAG 3，dtrA-Down 5’ CACTCAGCGGCACGAAGG 3’dtrB-up 5’ CACCGGCCTGAACTCCAT 3’dtrB-down 5’ TCGCACCGTTCCTACACC 3’PCR 反应条件为 95°C、5min，[%で 30sec,57°C 30sec,72°C 90sec]30 个循环，72°C延伸10min，PCR产物过柱纯化，dtrA克隆于pMD19T载体上，dtrB克隆于pGEM-T Easy载体上。
实施例2构建Λ dtrA和Λ dtrB突变株dtrA基因含有ー个SacII酶切位点，dtrB基因含有ー个EcoRV酶切位点，分别用SacII酶和EcoRV酶将连在pMD19T载体和pGEM_T Easy载体上的dtrA基因和dtrB基因从中间切开，插入两端加了同一酶切位点的卡那抗性盒，测序验证克隆基因正确；通过PCR将插入卡那抗性盒的目的片段扩增出来；将插入卡那抗性盒的DNA片段通过同源重组的方法直接转化到耐辐射异常球菌Rl中，提取其基因组，用验证引物扩增目的片段并电泳，验证图谱见图I和图2。具体转化方法如下I)挑取耐辐射异常球菌Rl单菌落于TGY液体培养基中，30°C培养至对数期；2)按1:100转接至新鲜的TGY液体培养基中，30°C培养至对数期(OD6tltl ^ O. 4); 3)取2111し菌液6000\8离心2111丨11，去上清，用20(^し含301111 CaCl2的TGY液体培养基重悬菌体，30°C水浴80min ；4)吸50 μ L上述菌悬液于一新的EP管中，加入IOyL冰上放置的DNA片段，振荡混匀后，30°C水浴90min ；5)加800 μ L新鲜TGY液体培养基混匀，于30°C摇床中培养4h ；6)取100 μ L培养好的菌液涂布于不含抗生素的TGY固体培养基上，30°C培养约2d ；7)挑取单菌落，提取其基因组，用验证引物进行PCR验证，获得AdtrA和AdtrB
突变株。实施例3野生型Rl和突变株Λ dtrA和Λ dtrB的热激反应实验I、实验方法将野生型Rl和突变株Λ dtrA和Λ dtrB活化后，按1%的接菌量分别接种于不含任何抗生素的TGY液体培养基(Rl)和含8 μ g/mL卡那霉素的TGY液体培养基(Δ dtrA和AdtrB)中，30°C振荡培养IOh，培养至对数期(OD6tltl ^ O. 8)，用于热激处理。I)各取20mT,野生型Rl和突变株Δ dtrA和Δ dtrB的菌液,6000 X g离心IOmin,收集菌体，菌体分别用IOmM的pH 7. O的磷酸缓冲液洗涤2次，重悬于20mL磷酸缓冲液中，30°C正常培养3h，各取ImL于I. 5mL EP管中，用无菌的去离子水倍比稀释(10—1到10_5)，分别取IOyL稀释至10—1到10_5的野生型Rl和突变株Λ dtrA和Λ dtrB菌液，滴加在不含任何抗生素的TGY固体培养基上，观察野生型Rl和突变株Λ dtrA和Λ dtrB的生长情況。2)各取20mL野生型Rl和突变株Δ dtrA和Δ dtrB的菌液,6000 X g离心IOmin,收集菌体，菌体分别用IOmM的pH 7. O的磷酸缓冲液洗涤2次，重悬于20mL磷酸缓冲液中，42°C热激培养3h，各取ImL于I. 5mL EP管中，用无菌的去离子水倍比稀释(10—1到10_5)，分别取IOyL稀释至10—1到10_5的野生型Rl和突变株Λ dtrA和Λ dtrB菌液，滴加在不含任何抗生素的TGY固体培养基上，观察野生型Rl和突变株Λ dtrA和Λ dtrB的生长情況。2、实验结果I)已培养至对数期的野生型Rl和突变株Λ dtrA和Λ dtrB在30°C正常培养3h后，菌株均能正常生长，生长状况一致，没有差异(见图3，表I )。2)已培养至对数期的野生型Rl和突变株Λ dtrA和Λ dtrB在42°C高温热激3h后，野生型Rl和突变株Λ dtrA和AdtrB的生长表现出明显的差异(见图4，表I)。
表I野生型Rl和突变株Λ dtrA和Λ dtrB在42°C热激条件下的生长情况
权利要求
1.一种双组分系统基因dtrA和dtrB的用途，其特征在于用于提高菌株热敏感性和UV辐射抗性。
2.如权利要求I所述的双组分系统基因dtrA和dtrB的用途，其特征在于双组分系统基因dtrA和dtrB的序列如SEQ ID NO: I和SEQ ID NO: 2所示。
3.一种利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，包括克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤，双组分系统基因的序列如SEQ ID NO: I和SEQID N0:2所示，其特征在于还包括构建具有热敏感性和UV辐射抗性的A dtrA和A dtrB突变株的步骤。
4.根据权利要求3所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤包括设计dtrA和dtrB基因的PCR扩增特异性引物。
5.根据权利要求4所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤包括从Deinococcusradiodurans基因组DNA中扩增出完整的dtrA和dtrB核苷酸序列。
6.如权利要求5所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于构建具有热敏感性和UV辐射抗性的A dtrA和A dtrB突变株的步骤包括 1).用SacII酶和EcoRV酶将分别连接在载体上的dtrA基因和dtrB基因从中间切开； 2).插入两端加了同一酶切位点的卡那抗性盒，测序验证克隆基因； 3).通过PCR将插入卡那抗性盒的目的片段扩增出来； 4).将插入卡那抗性盒的DNA片段通过同源重组的方法直接转化到耐辐射异常球菌Rl中。
7.如权利要求6所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于所述连接dtrA和dtrB基因的载体为T载体。
8.如权利要求7所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于所述连接dtrA基因的载体为PMD19T载体。
9.如权利要求8所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于所述连接dtrB基因的载体为pGEM-T Easy载体。
10.如权利要求6至9中任一项所述的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法，其特征在于具体将DNA片段转化到耐辐射异常球菌Rl中的转化方法如下 1)挑取耐辐射异常球菌Rl单菌落于TGY液体培养基中，30°C培养至对数期； 2)按1:100转接至新鲜的TGY液体培养基中，30°C培养至对数期(0D600^ 0. 4)； 3)取21^菌液6000\8离心2111111，去上清，用2001^含301111CaCl2的TGY液体培养基重悬菌体，30°C水浴80min ； 4)吸50ii L上述菌悬液于一新的EP管中，加入IOuL冰上放置的DNA片段，振荡混匀后，30°C水浴 90min ； 5)加800ii L新鲜TGY液体培养基混匀，于30°C摇床中培养4h ；6)取100ii L培养好的菌液涂布于不含抗生素的TGY固体培养基上，30°C培养约2d ；7)挑取单菌落，提取其基因组，用验证引物进行PCR验证，获得AdtrA和AdtrB突变株。
11.通过权利要求10的利用双组分系统基因dtrA和dtrB提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的方法构建的突变菌株。
全文摘要
本发明提供了一种双组分系统基因dtrA和dtrB的用途，用于提高菌株热敏感性和UV辐射抗性。还提供了一种双组分系统基因dtrA和dtrB的利用方法，包括克隆双组分系统基因dtrA和dtrB的步骤，双组分系统基因的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，进一步构建具有热敏感性和UV辐射抗性的ΔdtrA和ΔdtrB突变株；该双组分系统基因dtrA和dtrB的提高菌株热敏感性和UV辐射抗性的功能可以被利用在发酵行业和生产抗UV辐射的化妆品行业，具有良好的应用前景。
文档编号C12N1/20GK102676585SQ20121016026
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月22日 优先权日2012年5月14日
发明者张维, 林敏 , 王文涛, 赵鹏, 郝艳华, 陈明 申请人:中国农业科学院生物技术研究所