专利名称：一种ema与pcr结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测饲料中沙门氏菌活细胞的方法及试剂盒，特别是涉及一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的方法及试剂盒。
背景技术：
动物饲料是“从农场到餐桌”食品安全链的重要环节，食用受病原菌污染饲料的动物或动物产品或导致人类疾病，因此准确、快速地检测饲料中的沙门氏菌，对于防止畜禽和人类沙门氏菌污染具有十分重要的意义。传统沙门氏菌检测方法，由于其检测周期长、漏检 率高、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。实时PCR技术被应用多年，用于检测食品或饲料中的病原微生物。传统的PCR检测方法可以对沙门氏菌等特定微生物DNA的单条基因片段进行放大，放大后，特定的DNA片段被成千上万倍的复制，运用可视技术按照细菌基因序列探测和识别复制后细菌的遗传物质可以更加容易。然而，目前的PCR检测方法容易出现假阳性的结果，这造成了巨大的浪费和不必要的召回事件的发生。出现这种结果的原因是，PCR技术跟其它的DNA法一样，均不能将活的跟死的沙门氏菌区分开，因此这导致PCR技术提供了错误的结果。为了克服以上PCR技术的弱点，有效区分死细菌及活细菌，可用叠氮溴化已啶(EMA)对待检样品进行前处理，使死的沙门氏菌细胞不能进行PCR扩增，从而有效区分沙门氏菌死细胞及活细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的方法及试剂盒，成本低廉，操作方便快捷，能客观反映饲料中沙门氏菌活细胞的存在情况，可为饲料中沙门氏菌的快速、准确检测提供有效手段。本发明采用以下技术方案
一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的试剂盒，其中，所述试剂盒包括以下成分沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照、Taq预混酶及引物混合物、DL Marker2000、EMA溶液和共价交联曝光装置。进一步，所述Taq预混酶及引物混合物中，预混酶浓度为20u/mL，引物浓度为100pmol/mL，其保存条件为-20° C。进一步，所述引物的序列为SE-I:GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG ;SE-2:CATCGCACCGTCAAAGGAAC。
进一步，叠氮溴化已唳浓度为O. 5mg/mL。进一步，所述共价交联曝光装置包括箱体，其特征在于所述箱体上设有活动门、卤素灯开关、紫外灯管开关和总电源开关，所述箱体内顶部设有齒素灯，箱体两侧内壁上分别设置有至少一个紫外灯管。进一步，所述的紫外灯管为两个。
进一步，所述箱体上还设有可视窗口。一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的方法,其中，包括如下步骤
I)将饲料样品用BPW肉汤增菌，分别吸取500ul菌悬液于四个I. 5mL离心管中，其中两份作为制备好的活细胞菌悬液，两份进行100° C水浴10 min制成死细胞悬浮液。取活细胞菌悬液及死细胞菌悬液各一份，分别加入4ul O. 5mg/mL的叠氮溴化已啶溶液，摇匀，将 其置于冰盒上，在共价交联装置内曝光3min。2)对四支离心管内的菌悬液分别提取细菌DNA。3)PCR扩增沙门氏菌invA基因取试剂盒中预混酶及引物混合物，50ul体系吸取40ul，加入提取的细菌DNAlO ul进行PCR扩增，扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性30sec，56°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，33 个循环，最后 72°C终延伸 10 min。4)电泳分析将PCR产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后，凝胶成像系统进行成像分析。本发明的有益效果为
本发明经过大量研究，研制出了用于检测饲料样品中沙门氏菌活细胞的快速检测试剂盒，采用了 EMA与PCR结合技术用叠氮溴化乙锭染料对饲料样品的菌悬液进行处理，叠氮溴化乙锭在强光照的环境下进入死的细菌体内后与DNA分子进行结合，使得细菌在染色后不能被溶解，但不能穿透活细胞，因此不影响饲料中沙门氏菌活细胞的PCR扩增，但可阻断饲料中沙门氏菌死细胞的PCR扩增，这种改进的PCR技术可为饲料中沙门氏菌的快速、准确检测提供有效手段。共价交联曝光装置可提供约200001UX的强光，进而使PMA与菌悬液混合均匀后在本装置内进行光照交联，PMA所带的光敏性叠氮基团转化为高活性的氮宾自由基，并与结合位点附近的任意碳氢化合物反应形成稳定的共价氮碳基，致使死细胞DNA分子的永久修饰，最后阻断死细胞DNA分子的聚合酶链式反应(PCR)扩增。本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书所特别指出的结构来实现和获得。
图I为本发明共价交联曝光装置的结构示意 图2为本发明实施例I的电泳 图3为本发明实施例2的电泳 图4为本发明实施例3的电泳 图5为本发明实施例4的电泳图。
具体实施例方式 下面结合实施例对本发明作进一步描述
如图I所示，本发明的共价交联曝光装置的箱体I上设有可视窗口 3、活动门5、卤素灯开关6、紫外灯管开关7和总电源开关8，活动门5与箱体I铰接，箱体I顶部的内壁上设有500W的卤素灯4，箱体I两侧的内壁上分别安装有两个紫外灯管2，两个平行的紫外灯管2分别左右对称设置于箱体I的内侧面。卤素灯4提供强光，紫外灯管2用于杀菌，为了提高杀菌效果，在箱体I两侧的内壁上分别安装两个紫外灯管2。通过可视窗口 3观察内部的光照交联效果。本发明可用于永久性修饰细菌死细胞的DNA分子，阻断DNA分子的聚合酶链式反应，从而有效区分样品中细菌的死活状态，降低PCR检测样品中致病菌的假阳性率。本发明可提供约200001UX的强光，进而使EMA与菌悬液混合均匀后在本装置内进行光照交联，EMA所带的光敏性叠氮基团转化为高活性的氮宾自由基，并与结合位点附近的任意碳氢化合物反应形成稳定的共价氮碳基，致使死细胞DNA分子的永久修饰，最后阻断死细胞DNA分子的聚合酶链式反应(PCR)扩增。实施例I :
本发明的试剂盒包括沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照、适宜浓度的Taq预混酶及引物混合物、DL Marker 2000、适宜浓度的EMA溶液和共价交联曝光装置。预混酶为20u/mL，引物浓度为lOOpmol/mL，其保存条件为-20° C。引物的序列为SE_1:GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG SE-2: CATCGCACCGTCAAAGGAAC 。EMA 溶液，其浓度为O. 5mg/mL。本发明的方法包括如下步骤
1)将饲料样品用BPW肉汤增菌，分别吸取500ul菌悬液于四个I.5mL离心管中，其中两份作为制备好的活细胞菌悬液，两份进行100° C水浴10 min制成死细胞悬浮液。取活细胞菌悬液及死细胞菌悬液各一份，分别加入4ul O. 5mg/mL的叠氮溴化已啶溶液，摇匀，将其置于冰盒上，在共价交联装置内曝光3min ；
2)对四支离心管内的菌悬液分别提取细菌DNA；
3)PCR扩增沙门氏菌invA基因取试剂盒中预混酶及引物混合物，50ul体系吸取40ul，加入提取的细菌DNAlO ul进行PCR扩增，扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性30sec，56°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，33 个循环，最后 72°C终延伸 10 min ；
4)电泳分析将PCR产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后，凝胶成像系统进行成像分析。电泳图见图2。由左至右分别为DL Marker 2000、沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照、空白对照、沙门氏菌活细胞PCR产物、沙门氏菌死细胞PCR产物、经叠氮溴化已啶处理的沙门氏菌活细胞PCR产物、经叠氮溴化已啶处理的沙门氏菌死细胞PCR产物。由图可以看到，沙门氏菌死细胞、沙门氏菌活细胞、经叠氮溴化已啶处理的沙门氏菌活细胞PCR扩增效率相同，经叠氮溴化已啶处理的沙门氏菌死细胞不能扩增出沙门氏菌相应条带。可见叠氮溴化已啶可选择性修饰沙门氏菌死细胞的DNA分子，而对沙门氏菌活细胞的DNA分子PCR扩增效率无影响，因此应用本方法可有效区分饲料中沙门氏菌死细胞及活细胞，从而为饲料中沙门氏菌的监测提供有效的监管手段。实施例2
试剂盒包括沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照、适宜浓度的Taq预混酶及引物混合物、DL Marker 2000、适宜浓度的EMA溶液和共价交联曝光装置。预混酶为20 u/mL，引物浓度为100 pmol/mL，其保存条件为-20° C。引物的序列为SE_1:GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG SE-2: CATCGCACCGTCAAAGGAAC。EMA溶液，其浓度为 O. 5mg/mL。本发明的检测方法包括以下步骤1)将取灭菌的空白浓缩饲料及配合饲料2份，每25克添加ICFU的沙门氏菌，于灭菌好的BPW肉汤增菌，分别吸取500ul菌悬液于四支I. 5mL离心管中，其中两支离心管中分别加入4ul O. 5mg/mL的叠氮溴化已啶溶液，将离心管置于冰盒上，在共价交联装置内曝光3min ；
2)提取细菌DNA;
3)PCR扩增沙门氏菌invA基因取试剂盒中预混酶及引物混合物，50ul体系吸取40ul，加入提取的细菌DNAlO ul进行PCR扩增，扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性30sec，56°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，33 个循环，最后 72°C终延伸 10 min ；
4)电泳分析将PCR产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后，凝胶成像系统进 行成像分析，电泳图见图3。由左至右分别为DL Marker 2000、沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照、空白对照、浓缩饲料沙门氏菌阳性添加PCR产物、配合饲料沙门氏菌阳性添加PCR产物、经叠氮溴化已啶处理的浓缩饲料沙门氏菌阳性添加PCR产物、经叠氮溴化已啶处理的配合饲料沙门氏菌阳性添加PCR产物。由图可以看到，经叠氮溴化已啶处理后的样品其PCR扩增效率与未经叠氮溴化已啶的样品PCR扩增效率一致。可见叠氮溴化已啶对沙门氏菌活细胞的DNA分子PCR扩增效率无影响，本方法可检测出浓缩料或配合料中1CFU/25克浓度的沙门氏菌活细胞。实施例3
1)将取灭菌的空白浓缩饲料及配合饲料4份，每25克分别添加104CFU/mL及IO5CFU/mL的沙门氏菌，于灭菌好的BPW肉汤增菌，分别吸取500ul菌悬液于四支I. 5mL离心管中，100° C水浴10 min制成死细胞悬浮液,分别加入4ul O. 5mg/mL的叠氮溴化已唳溶液,将离心管置于冰盒上，在共价交联装置内曝光3min ；
2)提取细菌DNA；
3)PCR扩增沙门氏菌invA基因取试剂盒中预混酶及引物混合物，50ul体系吸取40ul，加入提取的细菌DNAlO ul进行PCR扩增，扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性30sec，56°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，33 个循环，最后 72°C终延伸 10 min ；
4)电泳分析将PCR产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后，凝胶成像系统进行成像分析，电泳图见图4。由左至右分别为DL Marker 2000、沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照、空白对照、经叠氮溴化已啶处理的浓缩饲料沙门氏菌104CFU/mL阳性添加PCR产物、经叠氮溴化已啶处理的配合饲料沙门氏菌104CFU/mL阳性添加PCR产物、经叠氮溴化已啶处理的浓缩饲料沙门氏菌105CFU/mL阳性添加PCR产物、经叠氮溴化已啶处理的配合饲料沙门氏菌105CFU/mL阳性添加PCR产物、由图可以看到，经叠氮溴化已啶处理后的样品其PCR扩增被抑制，即便是浓缩饲料及配合饲料中沙门氏菌死细胞浓度很高，经叠氮溴化已啶处理后均未扩增出对应的沙门氏菌条带。实施例4
1)将从市场上随机抽取的样品I(肉鸡浓缩料)、样品2 (发酵豆柏)、样品3 (豆柏)、样品4 (血粉)、样品5 (鱼粉)、样品6 (枯草芽孢杆菌微生态制剂)、样品7 (蛋白酶制剂)，各称取25g于灭菌好的BPW肉汤增菌，分别吸取500ul菌悬液于7支I. 5mL离心管中，分别加入4ul O. 5mg/mL的叠氮溴化已啶溶液，将离心管置于冰盒上，在共价交联装置内曝光3min ；
2)提取细菌DNA；3)PCR扩增沙门氏菌invA基因取试剂盒中预混酶及引物混合物，50ul体系吸取40ul，加入提取的细菌DNAlO ul进行PCR扩增，扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性30sec，56°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，33 个循环，最后 72°C终延伸 10 min ；
4)电泳分析将PCR产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后，凝胶成像系统进行成像分析，电泳图见图5。由左至右分别为DL Marker 2000、沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照、空白对照、样品I至样品7。由图5可以看到，样品I有对应的沙门氏菌条带扩增出，样品2-样品7未扩增出沙门氏菌对应条带。可见样品I中存在沙门氏菌活细胞，样品2-样品7中不存在沙门氏菌活细胞。根据此检测结果，可对样品I的沙门氏菌污染来源进行追溯，从饲料原料、生产工艺、环境等方面进行监控，阻止沙门氏菌的交叉污染，避免沙门氏菌阳性的饲料流入养殖环节对食品安全链造成威胁。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括以下成分沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照、Taq预混酶及引物混合物、DLMarker 2000、EMA溶液和共价交联曝光装置。
2.根据权利要求I所述的一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的试剂盒，其特征在于所述Taq预混酶及引物混合物中，预混酶浓度为20u/mL，引物浓度为100pmol/mL，其保存条件为-20° C。
3.根据权利要求I或2所述的一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的试剂盒，其特征在于所述引物的序列为SE-1 GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG ；SE-2:CATCGCACCGTCAAAGGAAC。
4.根据权利要求3所述的一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的试剂盒，其特征在于叠氮溴化已啶浓度为O. 5mg/mL。
5.根据权利要求I所述的一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的试剂盒，其特征在于所述共价交联曝光装置包括箱体，所述箱体上设有活动门、齒素灯开关、紫外灯管开关和总电源开关，所述箱体内顶部设有卤素灯，箱体两侧内壁上分别设置有至少一个紫外灯管。
6.根据权利要求5所述的一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的试剂盒，其特征在于所述的紫外灯管为两个。
7.根据权利要求5或6所述的一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的试剂盒，其特征在于所述箱体上还设有可视窗口。
8.—种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的方法，其特征在于包括如下步骤 1)将饲料样品用BPW肉汤增菌，分别吸取500ul菌悬液于四个I.5mL离心管中，其中两份作为制备好的活细胞菌悬液，两份进行100° C水浴10 min制成死细胞悬浮液； 取活细胞菌悬液及死细胞菌悬液各一份，分别加入4ul O. 5mg/mL的叠氮溴化已啶溶液，摇匀，将其置于冰盒上，在共价交联装置内曝光3min ； 2)对四支离心管内的菌悬液分别提取细菌DNA； 3)PCR扩增沙门氏菌invA基因取试剂盒中预混酶及引物混合物，50ul体系吸取40ul，加入提取的细菌DNAlO ul进行PCR扩增，扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性30sec，56°C退火 30 sec，72°C延伸 45sec，33 个循环，最后 72°C终延伸 10 min ； 4)电泳分析将PCR产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后，凝胶成像系统进行成像分析。
全文摘要
本发明公开了一种EMA与PCR结合快速检测饲料中沙门氏菌活细胞的方法及试剂盒，其中，所述试剂盒包括以下成分沙门氏菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照、Taq预混酶及引物混合物、DLMarker2000、EMA溶液和共价交联曝光装置。本发明成本低廉，操作方便快捷，能客观反映饲料中沙门氏菌活细胞的存在情况，可为饲料中沙门氏菌的快速、准确检测提供有效手段。
文档编号C12Q1/10GK102643926SQ20121015949
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日
发明者刘宏伟, 周红霞, 宋志超, 张发旺, 朱松波, 李华岑, 李金磊, 焦玉萍, 班付国, 舒畅, 董鹏, 贾振民, 陈晓鸽, 韩立, 马俊, 高小玲, 高延玲, 黄京燕 申请人:河南省兽药监察所