专利名称：一种灰产色链霉菌海藻糖合成酶及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和现代酶工程技术领域，具体涉及ー种来自灰产色链霉菌的海藻糖合成酶及其编码基因和应用。
背景技术：
海藻糖(Trehalose)是由两分子葡萄糖以α，α _1，I糖苷键相连而成的非还原性ニ糖，是ー种安全、可靠的天然糖类，1832年由Wiggers将其从黑麦的麦角菌中首次提取出来，随后的研究发现海藻糖在自然界中许多可食用动植物及微生物体内都广泛存在，如人们日常生活中食用的蘑菇类、海藻类、豆类、虾、面包、啤酒及酵母发酵食品中都有含量较高的海藻糖。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干 燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。外源性的海藻糖同样对生物体及生物大分子、生物膜具有良好的非特异性保护作用，它可以保护细胞免受由于环境变化(如脱水、高滲)造成的损害，具体表现为对生物膜、蛋白质和DNA等的有效保护，海藻糖因此在科学界素有“生命之糖”的美誉。国际权威的《自然》杂志曾在2000年7月发表了对海藻糖进行评价的专文，文中指出“对许多生命体而言，海藻糖的有与无，意味着生命或者死亡”。这ー独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料，大大拓展了海藻糖作为天然食用甜味糖的功能。在医学上已经成功地应用海藻糖替代血浆蛋白作为血液制品、疫苗、淋巴细胞、细胞组织等生物活性物质的稳定剂。不仅可以常温条件下干燥存放，更重要的是可以防止因血源污染而引起こ肝、艾滋病等致命疾病的传播，世界卫生组织对此十分重视。可见海藻糖的广泛应用可以提高人类的生活和健康水平。在上世纪80年代的末期，海藻糖只能从含量甚微的天然微生物中提取，因而价格高达1000美元/kg ;后来，利用酵母提取海藻糖获得成功，使海藻糖价格降低到300美元/kg以下。酵母提取法虽然大大价低了海藻糖的价格，但是无法进行大規模エ业化的生产，同时微生物培养的副产物较多増加了海藻糖精制的困难，回收率也较低，都导致海藻糖的生产成本很难再进ー步降低。1991年，意大利研究人员最早发现ー些耐热古细菌的细胞提取物能将淀粉转化成海藻糖，随后日本研究人员对该酶做了分离纯化的研究，并克隆到相关的海藻糖合成酶基因，实现了利用酶法来生产海藻糖，也使海藻糖价格降低到10美元/kg以下。海藻糖早期昂贵的价格限制了应用与开发的研究，海藻糖价格的降低就意味着海藻糖将更广泛应用于医药食品等行业，这会大大促进相关产业的发展，也会加快海藻糖的应用开发研究。因此，研究开发更有效和生产成本更低的海藻糖生产技术，仍然是海藻糖广泛应用于食品行业要解决的关键性问题。
微生物合成海藻糖的途径可以分为三种第一种途径是海藻糖磷酸化酶合成(0TSA-0TSB)途径海藻糖磷酸化酶合成途径先由6磷酸海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，然后再由6磷酸海藻糖酯酶脱磷酸后得到海藻糖。第二种途径是麦芽寡糖基海藻糖合成酶(TreY-TreZ)途径麦芽寡糖基海藻糖合成酶是先由麦芽寡糖基海藻糖合成酶以麦芽糊精(Maltodextrin)为底物,通过分子内转糖基作用把麦芽糊精末端的两个葡萄糖分子间的α, α-1,4糖苷键转变成α，α -1，I糖苷键，形成麦芽寡糖基海藻糖。然后麦芽寡糖基海藻糖在麦芽寡糖基海藻糖水解酶的催化下从麦芽寡糖基海藻糖分子上水解下ー个海藻糖分子，而原来的麦芽糊精则转变为减少了两个葡萄糖基的新寡糖，并可作为新的底物进行下一轮反应，如此反复就可以将麦芽糊精转化成海藻糖。
第三种途径是海藻糖合成酶(TreS )途径海藻糖合成酶途径是以麦芽糖(Maltose)为底物，直接由海藻糖合成酶催化转化麦芽糖生成海藻糖。三种途径相比，第一种途径需要用到价格昂贵的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6_磷酸葡萄糖为底物来生产海藻糖，在生产成本很难产生竞争优势；第二种和第三种途径是以淀粉的水解产物麦芽糊精或者麦芽糖为底物生产海藻糖，在原料上具有很强的竞争优势。第二种途径需要两种酶，在实际生产中要考虑两种酶的生产设备和生产エ艺，还要考虑两种酶的最适反应条件是否一致；而第三种途径只需要ー种酶，在生产设备的占用率会更低，生产エ艺上会更简単，因而具有更强的竞争优势。目前已有不少文献和专利报道了海藻糖合成相关基因的克隆和分离，以及这些海藻糖合成酶基因在制备海藻糖中的应用，但这些海藻糖合成相关酶的合成途径不同，或者菌种来源不同，导致了 DNA序列和氨基酸序列相差甚远，酶的分子量、酶学特性以及酶对底物的转化率也不同，而且目前得到的可エ业化应用的基因和专利不多。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种海藻糖合成酶。本发明的另一目的在于提供ー种海藻糖合成酶的编码基因。本发明的另一目的在于提供ー种含有上述的海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。本发明的又一目的在于提供上述海藻糖合成酶编码基因在表达海藻糖合成酶中的应用。本发明的又一目的在于提供ー种海藻糖合成酶及其编码基因在制备海藻糖中的应用。本发明的又一目的在于提供一种制备海藻糖的方法。本发明的目的通过以下技术方案实现ー种海藻糖合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明提供的海藻糖合成酶其编码基因克隆自灰产色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes编号11007),命名为Sg-TreS,具有下述核苷酸序列之一
(I)序列表中的SEQ ID NO. I的核苷酸序列；(2)编码序列表中SEQ ID NO. 2氨基酸序列的多核苷酸。本发明是通过研究海藻糖合成酶基因的保守序列，然后设计相关的兼并PCR引物从灰产色链霉菌中克隆得到海藻糖合成酶的编码基因。所采用的实验方法，包括聚合酶链式反应(PCR)技术；DNA的提取、酶切、连接等DNA分子操作技术，以灰产色链霉菌总DNA为模板，扩增出一段可能为海藻糖合成酶编码基因的DNA序列(Sg-TreS)，把这一段DNA序列连接到表达载体上如pET-30a等表达质粒上，然后导入大肠杆菌进行高效表达，获得该基因表达的目的蛋白进行研究，确定基因的功能和酶学特性，证实了这一段DNA序列编码的是ー种特性特征与前人发现不同的海藻糖合成酶。这些不同的特性特征包括基因来源不同、DNA序列和氨基酸序列的不同、酶的分子大小不同、酶的最适反应温度和最适pH不同。目前尚无检索到公开的文献和专利等关于从灰产色链霉菌中克隆得到海藻糖合成酶基因 的报道，或者是关于利用灰产色链霉菌制备海藻糖的报道，因此可以判断本发明属于ー种新发明。从灰产色链霉菌得到的海藻糖合成酶具有以下特征I.该海藻糖合成酶的编码基因长度为1716个碱基对，编码572个氨基酸，分子量约为65. 9 kD2.该海藻糖合成酶的适合反应温度为15 35°C，优选2(T25°C3.该海藻糖合成酶的适合应的pH在6. (Γ8. 0，优选pH为7. 0 7. 54. ニ价金属离子的浓度在5m mol/L时，Cu2 +对该海藻糖合成酶活有明显的抑制作用，而其它Fe3 +、Zn2 +、K1 +、Ca2 +、Mn2 +、Fe2 +和Ba2 +对该海藻糖合成酶活没有抑制作用。5.在pH7. 5和25°C的反应条件下，以15%的麦芽糖为底物，反应140分钟麦芽糖的转化率达到最大值，随着反应时间的増加海藻糖和麦芽糖的含量都会減少，而葡萄糖的含量会増加，但变化不大。上述的海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。所述的重组表达载体，为将上述的海藻糖合成酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达海藻糖合成酶的重组表达载体；所述的大肠杆菌表达载体优选为pET-30a载体。所述的转基因重组菌，是将上述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达海藻糖合成酶的转基因重组菌；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21 (DE3)。上述的海藻糖合成酶编码基因在表达海藻糖合成酶中的应用。上述的海藻糖合成酶及其编码基因在制备海藻糖中的应用。一种表达海藻糖合成酶的方法，是培养上述的转基因重组菌得到海藻糖合成酶。—种制备海藻糖的方法，是以麦芽糖为底物，用上述的海藻糖合成酶进行催化反应，得到海藻糖；所述的反应温度优选为15 35°C，最优选为2(T25°C，反应液的pH优选为6. 0 8. 0，最优选为7. 0 7. 5;反应底物的浓度为10% 50% (10 50 g/100 mL)，优选为10% 30% (10 30 g/100 mL)。本发明所述的海藻糖合成酶是以麦芽糖为底物，用海藻糖合成酶转化麦芽糖能生成海藻糖，并能以浓度为109Γ50%的麦芽糖为反应底物，从而可以减少设备的占用率和生产后期浓缩的耗能，有利于降低生产成本。本发明所述的海藻糖合成酶在天然的灰产色链霉菌中含量也非常低，很难检测到酶的活力，应用基因工程菌来表达本发明所述的海藻糖合成酶基因，可以使酶的活力比天然菌株高数千倍，可以用于海藻糖的生产。本发明与现有技术相比，具有实质性特点和显著的优势 I.目前报道的海藻糖合成酶的麦芽糖转化率6(Γ80 %，降低反应温度可以提高麦芽糖的转化率，提高反应温度会降低麦芽糖的转化率，同时会增加副产物葡萄糖的生成，大多会产生10-30%的葡萄糖。本发明的海藻糖合成酶在25°C反应条件下，麦芽糖在转化率达80%左右,及广生较少的匍萄糖(5%以下)，这就有利于提闻底物的转化效率，有利提闻原料的利用率降低生产成本，更具有市场竞争力。2.本发明中海藻糖合成酶的适合反应温度范围广，在15_35°C都能保持较高的酶活力，这有利于在反应通过降低反应温度来提高麦芽糖的转化率，这也有利于降低生产成本。
3.除了 Cu2+对酶活力有明显的抑制作用外，其它金属离子Zn2 +、Fe3 +、K1 +、Ca2 +、Mn2 +、Fe2 +和Ba2 +对酶活都没有明显的抑制作用，这可以降低酶在生产中对水和淀粉麦芽糖糖浆纯度的要求，避免生产过程中水和原料中金属离子对酶活力的抑制，有利于提高生产ェ艺的稳定性。
图I是兼并PCR扩增结果电泳图。图2是重组菌诱导表达海藻糖合成酶的SDS-PAGE图。图3是麦芽糖反应的HPLC分析图。图4是pH对酶活力的影响曲线图。图5是温度对酶活力的影响曲线图。图6是反应时间对产物中各种糖含量影响曲线图。图7是金属离子对酶活力的影响曲线图。图8是不同麦芽糖浓度对转化率的影响曲线图。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进ー步说明，下述实验和实例所述内容属于本发明的主要内容，有些对本领域专业人员来说属于常规的实验方法并未在本专利说明书中出现。I.灰色产色链霉菌的培养灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)菌株编号11007,从中国エ业微生物菌种保藏管理中心购买，接种于以下培养基(克/升)葡萄糖4.0，酵母提取物10，麦芽提取物10，用KOH调pH至7. 0，然后在25-30°C恒温摇床上振荡培养至混浊，离心收集菌体用于总DNA的提取。2.灰产色链霉菌海藻糖合成酶基因(Sg-TreS)的克隆通过比对海藻糖合成酶基因的保守序列进行比对分析，设计以下兼并PCR引物引物1:5' -ATGABCGTSAACGASCCCG -3'引物2:5' -TCAAVCGCGGCGGCCGATG-3'用设计好的引物以灰产色链霉菌总DNA为模板进行PCR扩增，PCR条件为94°C预变性2分钟；94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 2分钟；35个循环后72°C延伸10分钟。将PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明获得片段约为I. 7kb，结果见图I中第2泳道，与预期结果相符，然后将PCR扩增产物纯化后连接到TAKARA的pMD20_T载体上送到测序公司进行测序分析。经测序后得到的核苷酸序列为本发明序列表中SEQ ID NO. I。3. Sg-TreS表达及粗酶的制备根据测序得到灰产色链霉菌可能为海藻糖合成酶基因(Sg-TreS)核苷酸序列，设计相应引物扩增该Sg-TreS基因并连接到表达载体pET-30a上，然后导入大肠杆菌进行表达。设计引物如下上游引物5' - CAGCATATGATGATCGTCAACGAGCC -3'
下游引物5' - TAGCGGCCGCTCAAACGCGGCGGCCGA -3'上下游引物的5'端分别设计了 Nde I和Not I酶切位点用于连接到表达载体pET-30a，用设计好的引物扩增可能为海藻糖合成酶基因的DNA序列Sg-TreS，扩增产物用试剂盒纯化回收目的扩增片段，然后利用Nde I和Not I进行双酶切，与同样利用Nde I和Not I进行双酶切的表达载体pET-30a进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选验证得到表达重组质粒pET-Sg-TreS。把表达重组质粒pET-Sg-TreS转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株的感受态细胞中，挑取转化子于含50 Pg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C摇床中培养，当0D600达到O. 8左右时，加入IPTG使其终浓度达到O. 5 mmol/L,继续培养20小时进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用1/10发酵液体积的磷酸盐缓冲液缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波进行破胞，破胞至菌液澄清，12000 rpm/min离心15分钟离心收集上清，所收集的上清液即为海藻糖合成酶的粗酶液(SDS-PAGE分析结果如图2所示)，可用于转化麦芽糖的试验。4.灰产色链霉菌海藻糖合成酶的功能鉴定和转化麦芽糖产物的分析利用高效液相色谱仪(HPLC)来进行海藻糖合成酶转化麦芽糖后的产物分析，色谱柱为 Alltima Amino 100A 5u 柱(4. 6mmX 250mm);流动相为 75% こ臆/25% H2O0(I)灰产色链霉菌海藻糖合成酶基因(Sg-TreS)的功能鉴定取制备得到的粗酶液20 μ L加到O. 5 mL的ρΗ7· O 10% (10 g/100 mL)麦芽糖溶液中，在25°C保温反应I个小时，然后用HPLC分析反应的产物组分，结果见图3，麦芽糖的反应样和标准样品比较，表明麦芽糖在酶的作用下生成海藻糖，这证明了所克隆的DNA片段是海藻糖合成酶基因，其在大肠杆菌表达的海藻糖合成酶具有催化麦芽糖生成海藻糖的功能。(2)最适反应pH值分析分别用pH为5. 5,6. 0,6. 5,7. 0,7. 5和8. O的磷酸盐缓冲液配制10% (10 g/100mL)的麦芽糖溶液，然后分别取O. 5 mL加入5 μ L的步骤3制备的粗酶液，分别在25V反应lh，然后用HPLC分析反应的产物组分，以生成海藻糖的含量来表示酶活力的大小，结果见图4。结果表明海藻糖合成酶在pH6. 5-8. O都能维持较高的活力，最适反应pH为7. 0-7. 5。(3)最适反应温度測定取0.5mL ρΗ7· 5的10% (10 g/100 mL)麦芽糖底物加入5 μ L酶液，然后分别在15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C和45°C不同的反应温下保温反应I小时，然后用HPLC分析反应的产物组分，以生成海藻糖的含量来表示酶活力的大小，结果见图5。结果表明反应温度在15-35°C酶都能表现出比较高的酶活力，最适反应温度为20-25°C，但是在40°C条件时酶活迅速失活。(4)不同反应时间，产物中各种糖含量变化取O. 5mL pH7. 5的15% (15 g/100 mL)麦芽糖底物加入5 μ L酶液，在ρΗ7· 5和250C的条件下反应，每隔20分钟取样一次后測定反应体系中各种糖的含量，结果见图6。结果表明反应140分钟后海藻糖含量达到最大值，随着反应时间的増加，反应体系中海藻糖生成量和麦芽糖含量都会減少，而葡萄糖的含量会増加，但在5个小时变化不大。
(5)金属离子对酶活的影响取O. 5mL pH7. O的10%麦芽糖底物加酶液5 μ L后再加10 μ L金属离子,使金属离子在反应液的终浓度为5mmol/L，在25°C下反应I小吋，然后测定反应体系中麦芽糖的含量来反应酶活力的变化；取O. 5mL pH7. O的10% (10 g/100 mL)麦芽糖底物加酶液5 μ L后再加入10 μ L ρΗ7. O的磷酸盐缓冲液作为空白对照，以空白対照的酶活力为100%，结果见图7。表明在5 mmol/L的浓度的条件下Ni2+，Fe3+，Fe2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ca2+等ニ价金属离子对该酶的活力基本没有抑制作用，但Cu2+在5m mol/L的浓度时对该酶活力有很强抑制作用，导致麦芽糖转化成海藻糖的效率很低。(6)不同浓度麦芽糖对酶转化率的影响用pH7. O的磷酸盐缓冲液分别配制10%、30%、50%的麦芽糖溶液，各取O. 5mL分别加5 μ L、10 μ L和20 μ L的酶液(取O. 5mL pH7. O的10%麦芽糖溶液，添加空宿主大肠杆菌BL21 (DE3)培养物的细胞破碎液上清液20 μ L为对照)；在25°C的条件下反应，每隔一个小时取样一次測定反应体系的海藻糖的百分含量，结果见图8，表明在底物浓度较低的条件下，反应体系中麦芽糖的转化速度快，转化率高，随着反应底物浓度的升高，需要延长反应时间才能提高麦芽糖的转化率。5.从市售麦芽糖浆制备海藻糖取市售以淀粉制备麦芽糖含量为85% (85g/100 mL)的超高麦芽糖浆O. 353 kg,用5 mol/L,pH为7. O磷酸盐缓冲液配制成I升含30%(30 g/100 mL)麦芽糖的反应底物，置于烧杯中加入前面制备的海藻糖粗酶液200mL，然后在25°C条件下保温反应，每隔5小时取样用HPLC測定反应体系中的海藻糖含量，直至海藻糖含量达到最大值。结果表明反应20小时后反应体系中海藻糖含量达到最大值，海藻糖的百分浓度为19.8%(19.8 g/100 mL),反应体系中葡萄糖的含量低于5%。经计算海藻糖的质量为I. 2升X 19. 8% (O. 198 kg/L)^ O. 2376 kg。也就是说O. 353kg的麦芽糖浆经过海藻糖合成酶的转化可以得到O. 2376kg的海藻糖，以商品的糖浆计算海藻糖得率为67. 31%，以糖浆的中纯麦芽糖计算，麦芽糖的转化率为79. 2%。
权利要求
1.ー种海藻糖合成酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
2.权利要求I所述的海藻糖合成酶的编码基因。
3.根据权利要求2所述的海藻糖合成酶的编码基因，其特征在于所述的海藻糖合成酶的编码基因具有下述核苷酸序列之一 (1)序列表中的SEQID NO. I的核苷酸序列； (2)编码序列表中SEQID NO. 2氨基酸序列的多核苷酸。
4.含有权利要求2或3所述的海藻糖合成酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体为将权利要求2或3所述的海藻糖合成酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达海藻糖合成酶的重组表达载体；所述的大肠杆菌表达载体优选为pET-30a载体。
6.根据权利要求4所述的转基因重组菌，其特征在于所述的转基因重组菌是将权利要求4或5所述重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达海藻糖合成酶的转基因重组菌；所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21 (DE3)。
7.权利要求2或3所述的海藻糖合成酶编码基因在表达海藻糖合成酶中的应用。
8.权利要求I所述的海藻糖合成酶及其编码基因在制备海藻糖中的应用。
9.一种表达海藻糖合成酶的方法，是培养权利要求4或6所述的转基因重组菌得到海藻糖合成酶。
10.一种制备海藻糖的方法，其特征在于是以麦芽糖浆为底物，用权利要求I所述的海藻糖合成酶进行催化反应，得到海藻糖；所述的反应温度优选为15 35°C，最优选为20 25°C，反应液的pH优选为6. (Γ8. 0，最优选为7. 0 7. 5 ;反应底物的浓度优选为10% 50%，优选为10% 30%。
全文摘要
本发明公开一种灰产色链霉菌海藻糖合成酶及其编码基因与应用，该海藻糖合成酶基因从灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)克隆到，该海藻糖合成酶能转化麦芽糖生成海藻糖，酶的适合反应温度为15～35℃，优选20～25℃，酶的适合应的pH在6.0～8.0，优选pH为7.0～7.5。该酶转化效率高，以麦芽糖为底物，在25℃反应条件下，麦芽糖在转化率达80％左右，及产生较少的葡萄糖，在5％以下，这有利提高底物的转化率，该酶能够用于转化商品化的超高麦芽糖浆制备海藻糖，可为工业化利用酶法生产海藻糖提供一种新的方法。
文档编号C12N1/21GK102690795SQ20121016040
公开日2012年9月26日 申请日期2012年5月22日 优先权日2012年5月22日
发明者李霜, 江凌, 贺沧, 黄和 申请人:南京工业大学