专利名称：一种大豆生育期e1基因及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种大豆生育期El基因及其编码蛋白。
背景技术：
大豆为人类提供重要的植物蛋白质和油份。在世界范围内，北至高纬度的北欧瑞典和北美加拿大，南至巴西及阿根廷等广泛区域内均有大豆栽培，但单个品种或种质资源一般适宜种植的纬度跨度较小，这种区域适应性与大豆的生育期基因密切相关。迄今已发 现了 9个主要影响大豆开花期和成熟期(生育期)基因位点E1-E8和J。早在上世纪20年代，美国学者Owen就发现一对控制大豆熟性的主要遗传因子，并定名为E与e。其后，Bernard(1971)推测E与e为同一位点的不同等位基因，定名为El/el。El位点对开花期与成熟期的贡献率高达50% 70%。大豆生育期基因El不仅对大豆开花期与成熟期的影响最大，而且还与光周期反应密切相关。现代大豆基因组信息表明，El基因位于第六染色体(Gm06)的着丝点附近，其遗传重组率极低，因而克隆难度极大。虽然人们先后用模式作物同源基因法或精细图谱定位法克隆出了 E4、E3、Dtl和E2基因，但至今尚未见到成功克隆El基因的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆生育期El基因及其编码蛋白。本发明的一种大豆生育期El基因序列如序列表Seq ID No 1所示。本发明的大豆生育期El基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No 2所
/Jn ο本发明含有启动子区段的大豆生育期El基因序列如序列表Seq ID No 3所示。本发明含有启动子区段的大豆生育期El基因如序列表Seq ID No 3所示(含El基因的转录区段即全长cDNA，下划线表示)，其中，I 2668bp及3194 4332bp的序列分别为El基因的5’与3’端启动子序列，2669bp 3193bp的序列为大豆生育期El基因序列，2512 2668bp及3194 3349bp分别为编码大豆生育期El基因全长cDNA的5’与3’端非翻译区；其中，启动子区段(如序列表Seq ID No :3所示的I 2668bp及3194 4332bp序列)来源于BAC克隆MiB42Gl的序列APOl 1814，有关BAC克隆的筛选及测序参照Xia Z，Sato H, Watanabe S, Kawasaki S, Harada K(2005)Construction and characterizationof a BAC library of soybean. Euphytical41 :129_137。本发明的有益效果本发明是在分子水平上首次成功地克隆出生育期基因E1。本发明利用大豆品种Harosoy的两个不同近等基因系Harosoy-El及Harosoy-el间杂交所获得的遗传群体，通过图位克隆法，成功地将大豆生育期El基因定位于着丝点附近的17. 4Kb区域，该区域位于BAC克隆MiB42Gl中序列AP011814中，并通过GenScan，GeneMark, FGENESH以及RiceGAAS确定出大豆生育期El基因的序列的位置。本发明获得的 El 基因编码区全长序列(Seq ID No 1)与 phytozome (http://www. phytozome. net)中公布的Glyma06g23040. I (大豆基因组Glymal. O版本的基因i全释)相对应,但是其序列并不一致，本发明获得的El基因翻译的蛋白质具有174aa(Seq ID No :2)。通过转基因，验证了 El基因具有强烈抑制大豆开花的生理功能。同时，通过同源比对，发现El基因在拟南芥与水稻中没有同源基因，是豆科植物特有的基因，且目前尚没有关于El及豆科作物中El同源基因的克隆及功能验证的报导，生物信息学表明本发明的El基因含有一个核定位信号(putative bipartite nuclearlocalization signal),具有KKRK和RRR 二元结构域,该二元结构域能够起到定位信号功能，能够使El基因蛋白定位于(运输至)细胞核，在细胞核内起作用，分别位于序列表SeqID No :2中的13-16及29-31位置。另外，El基因还含有与拟南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻中的粳稻(Oryza sativa)相似的B3结构域，并在氨基酸水平上具有21 % 27%的相似度。本发明的大豆生育期El基因为525bp (Seq ID No : I)，大豆生育期El基因的表达受到光周期的调节，在短日照(12小时光照/12小时黑暗)条件下大豆生育期El基因的表达量受到了明显的抑制如图13所示。
图I为GFP未融合El基因的瞬时表达载体结构示意图；图2为GFP融合El基因的瞬时表达载体结构示意图；图3为GFP未融合El基因的激光共聚焦显微镜GFP通道下的亚细胞定位影像图；图4为GFP未融合El基因的激光共聚焦显微镜chlorophyll通道下的亚细胞定位影像图；图5为GFP未融合El基因的激光共聚焦显微镜明视野下的亚细胞定影像位图；图6为GFP未融合El基因的激光共聚焦显微镜GFP通道、chlorophyll通道与明视野融合后的亚细胞定位影像图；图7为GFP融合El基因的激光共聚焦显微镜GFP通道下的亚细胞定位影像图；图8为GFP融合El基因的激光共聚焦显微镜chlorophyll通道下的亚细胞定位影像图；图9为GFP融合El基因的激光共聚焦显微镜明视野下的亚细胞定位影像图；图10为GFP融合El基因的激光共聚焦显微镜GFP通道、chlorophyll通道与明视野融合后的亚细胞定位影像图；图11为转入El基因与未转入El基因后的大豆开花状态图；图12为Realtime荧光定量PCR显示El基因在长日照的表达水平曲线图；图13为Realtime荧光定量PCR显示El基因在短日照的表达水平曲线图。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式的一种大S·生育期El基因序列如序列表Seq IDNo 1所示。
具体实施方式
二 本实施方式的大豆生育期El基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No :2所示。大豆生育期El基因的获得与鉴定方法如下(I)大豆生育期El基因的获得一、在 2004 年，将大豆的两个近等位基因系 Harosoy-El (L68_694，Ele2E3E4e5，PI547707)和 Harosoy-el (L58-266，ele2E3E4e5，PI 547676)进行杂交，然后通过图位克隆法对El基因进行筛查；二、在杂交后的117个F2代大豆群体中，通过图位克隆法筛选出El基因位点位于Satt365与Satt489之间；三、进一步对1442个F2:3代大豆群体进行筛查，筛选出7个在已定位区间的遗传重组体，其中，筛选出的7个遗传重组体的El基因位点位于Satt365与Satt557之间，并通过分子标记A和分子标记E5，对获得的7个遗传重组体进一步进行自交后代的表型鉴定，将El基因位点定位于分子标记A和E5的289kb范围内；四、通过图位克隆法对13761个F2:5代大豆群体进行筛查， 筛选出10个重组体，并采用分子标记33与分子标记12对获得的10个重组体进行自交后代的表型鉴定，将El基因位点定位于分子标记 33 与分子标记 12 的 17372bp 区间内；五、用 GenScan, GeneMark, FGENESH (http://linuxl. softberry. com/berry, phtml)及 RiceGAAS(http://ricegaas. dna. affrc. go. jp)程序对步骤四定位的17372bp的DNA序列进一步鉴定，确立了唯一的候选基因并定名为El基因；六、以大豆Harosoy-El品系的叶片为材料，提取叶片基因组作为模板，通过Kl (SeqID No :19)与K2(Seq ID No :20)，采用购买自Takara公司的高保真酶primerSTARHS扩增El基因，PCR反应条件如下94°C预变性10min，94°C变性30s，60。。退火15s，72。。延伸lmin，共30循环，再72°C延伸7min，将PCR产物的序列在ABI3130测序仪(ABI公司)上进行测序；测序结果表明大豆生育期El基因具有序列表中Seq ID NO 1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No 1由525个碱基组成，并编码具有序列表中SEQ ID NO 2的氨基酸序列的蛋白质。其中，图位克隆法中所使用的分子标记A是采用Al (Seq ID No :11)与分子A2 (SeqID No 12)为引物，以上述的F2:5大豆群体的基因组DNA为模板，采用购买自Takara的ExTaq酶扩增出分子标记A，PCR反应条件94 V预变性IOmin，94 V变性30s，60 V退火30s，72°C延伸lmin，共35循环，再72°C延伸IOmin ；分子标记E5是采用BI (Seq ID No : 13)与B2 (Seq ID No : 14)为引物，以上述的F2:5大豆群体的基因组DNA(为模板，采用购买自Takara的ExTaq酶扩增出分子标记E5，PCR反应条件94°C预变性10min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35循环，再 72°C延伸 IOmin ；分子标记33是采用Cl (Seq ID No 15)与C2 (Seq ID No 16)为引物，以上述的F2:5大豆群体的基因组DNA为模板，采用购买自Takara的ExTaq酶扩增出分子标记33，PCR反应条件94°C预变性10min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35循环，再 72°C延伸 IOmin ；分子标记12 是采用 Dl (Seq ID No : 17)与 D2 (Seq ID No 18)，以上述的 F2:5 大豆群体的基因组DNA为模板，采用购买自Takara的ExTaq酶扩增出分子标记12，PCR反应条件94°C预变性10min，94°C变性30s，60。。退火30s，72。。延伸lmin，共35循环，再72°C延伸IOmin ；其中，步骤一所述的Harosoy-El和Harosoy-el来源于美国农业部基因种质库(the USDA-ARS National Plant Germplasm System)的统一入库编号，分别为 PI 547707和PI547676 ；Harosoy-EI和Harosoy-el从日本生物资源研究所基因库中购得。(2)大豆生育期El基因的功能验证
I、全长cDNA序列测定一、以大豆Harosoy-El品系的叶片为材料,用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取叶片总RNA ;二、采用DNase I处理步骤一提取的总RNA，处理后的总RNA采用NanoDrop检测其DNA含量及质量，当DNA含量及质量达到标准后,进行下一步操作；三、取I μ g步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照购买自BDBiosciences Clontech 公司的 BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 试剂盒的使用手册进行，获得cDNA;四、分别以El基因Fl (Seq ID No 9)与F2 (Seq ID No 10)为引物，对步骤三获得的cDNA通过Race-PCR进行5’与3’扩增，将获得的5’与3’的DNA片断在ABI3130测序仪(ABI公司)上进行测序，然后将测序后的5’与3’的DNA片断拼接为全长cDNA,如序列表Seq ID No :4所不；其中，DNase I购买自Toyobo公司，NanoDrop购买自Thermo Scientific公司；Harosoy_El从日本生物资源研究所基因库中购得。犾得的El基因的全长cDNA为838bp，如序列表Seq ID No:4所不。El基因的上游5，UTR与下游3，UTR分别为157bp和156bp。2、大豆生育期El基因核定位研究以步骤I中获得的El基因cDNA为模板，通过序列表中Seq ID No 3的序列设计Gl(Seq ID No : 19)和G2 (Seq ID No :20)引物，采用购买自Takara公司的高保真酶primerSTARHS扩增El基因，PCR反应条件如下94°C预变性10min，94°C变性30s，60°C退火15s，72°C延伸lmin，共30循环，再72°C延伸7min，获得El基因编码区产物(Seq IDNo 1) ;二、将步骤一获得的El基因编码区产物采用ClaI酶和SpeI酶进行酶切，然后将酶切片段克隆到PBSK质粒中，形成一个CaMV 35S启动子驱动的El与eGFP融合体质粒(即 CaMV 35S E1 eGFP);三、制备拟南芥原生质体(Arabidopsis protoplasts),将步骤二得到CaMV 35S E1 :eGFP质粒通过氯化f丐聚乙二醇法转染拟南芥原生质体(Arabidopsisprotoplasts)，同时，将不含有El的pBSK(CaMV 35S eGFP)质粒作为对照组，通过氯化钙聚乙二醇法转染拟南芥原生质体(Arabidopsis protoplasts);然后置于激光共聚焦显微镜下观察，其中，pBSK质粒购买自Stratagene公司；其中，拟南芥原生质体(Arabidopsis protoplasts)制备方法如下一、配制纤维素酶消化液，混合均匀后在55°C温度下加热lOmin，再加入终浓度为10mM/L的CaCl2溶液，5mM/L的β-巯基乙醇和0.1% (w/v)BSA;二、取三至四周龄未抽苔的拟南芥莲座叶片，切成约O. 5mmXO. 5mm的形状，然后浸没于步骤一制得的纤维素酶消化液中，在黑暗放置3h，再用200目筛网过滤，收集滤过液并置于离心管中以100g/min的速度离心2min，去上清，用预冷的W5的溶液重悬清洗，再次以100g/min的速度离心后，收集沉淀用W5重悬并于冰上放置30min，再次以100g/min的速度离心，收集沉淀，用ImL的MMg溶液重悬，即得拟南芥原生质体(Arabidopsis protoplasts);其中，纤维素酶消化液各组分的配比为1.25% (w/V)的纤维素酶R10，0. 3% (w/v)的离析酶R10，0. 4M/L的甘露醇，20mM/L的KCl，20mM/L的MES (pH = 5. 7) ；W5 的各组分的配比为154mM/L 的 NaCl, 125mM/L 的 CaCl2, 5mM/L 的 KCl 和2mM/L的MES缓冲液(pH = 5. 7) ;MMg的配比为0. 4M/L的甘露醇，15mM/MgCl2溶液和4mM/L 的 MES。氯化钙聚乙二醇法具体步骤如下一、分别取10μ I的质粒(CaMV 35S:El:eGFP与CaMV35S:eGFP，质粒浓度为I μ g/μ L)加入100 μ I的制备好的拟南芥原生质体(Arabidopsis protoplasts)中，再加入 110 μ I 的 PEG-CaCl2 溶液，吹吸混勻，转化 20min ；二、转化完后，加入440 μ I的W5溶液混匀后，然后以100g/min的速度离心3min，去上清后加入ImL的W5溶液过夜培养16h，即完成氯化钙聚乙二醇法；其中，PEG-CaCl2是由4g的PEG4000, 3mL的H2O, 2. 5mL的0. 8M/L甘露醇，ImL的1M/L CaCl2溶液制成；W5的组成为154mM/L 的 NaCl 溶液，125mM/L 的 CaCl2 溶液，5mM/L 的 KCl 溶液和 2mM/L 的 MES 缓冲液(pH=5. 7)。在激光共聚焦显微镜下观察转染后的拟南芥原生质体不同器官中大豆生育期El基因的分布，确定核定位，初步确定大豆生育期El基因定位于细胞核中。
其中，图I和图2为El基因核定位研究所用载体的结构不意图，图I为对照载体，即eGFP (绿色荧光蛋白)未融合El ;图2为本试验构建的El与eGFP融合蛋白载体。在荧光显微镜下观察大豆生育期El基因蛋白在不同器官中的分布情况如图3至10所示。由图3至图10可知El蛋白(Seq ID No 2)主要定位于细胞核中，在细胞质中也存在少量El蛋白。3、转基因进行功能验证具体步骤为一、以大豆Harosoy-El品系的叶片为材料，提取全基因组作为模板，以Hl (Seq ID No:6)和H2(Seq ID No :5)为引物，采用购买自Takara公司的高保真酶primerSTARHS购买自Takara的ExTaq酶扩增，PCR反应条件94°C预变性10min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸5min，共35循环，再72°C延伸lOmin，获得含有启动子的大豆生育期El基因(Seq ID No 3) ;二、将获得的含有启动子的大豆生育期El基因(Seq ID No 3)克隆到 pMDC123_GFP 质粒中，将 pMDC123_GFP 质粒转入到大豆 Kariyutaka品种中；另设PMDC123-GFP空质粒作为对照组，即不含有El基因的pMDC123_GFP质粒作对照试验，比较El基因对植株的开花状态的影响；其中，有关质粒改造及转基因方法参照“Sato H, Yamada T, Kita Y, Ishimoto M, Kitamura K(2007)Production of transgenicplants and their early seed set in Japanese soybean variety, Kariyutaka. PlantBiotechnol 24:533-536” 和“Curtis MD, Grossniklaus U(2003)A gateway cloningvector set for high-throughput functional analysis of genes in planta. PlantPhysiololgy 133(2) :462_9”的方法进行；其中，大豆 Harosoy-El 及 Kariyutaka 品系从日本生物资源研究所基因库中购得，pMDC123_GFP质粒经购自The Arabidopsis BiologicalResource Center (ABRC) (http://www.arabidopsis.org)的 PMDC123 (CD3-747)改造而来，改造的方法参照 Sato H, Yamada T, Kita Y, Ishimoto M, Kitamura K(2007)Productionof transgenic plants and their early seed set in Japanese soybean variety,Kariyutaka. Plant Biotechnol 24 :533_536 来进行。本试验的大豆生长及开花状态如图11所示，由图11可知，I为El基因高表达，呈现出明显的晚花状态，而2为空质粒对照，明显早花，并已经结荚，说明El基因的功能具有抑制大豆开花的功能。4、Real-time荧光定量PCR进行功能验证
具体操作步骤为一、以大豆Harosoy-El品系的叶片为材料，用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取叶片总RNA ;二、采用DNase处理步骤一提取的总RNA，处理后的总RNA采用购买自Toyobo公司的NanoDrop检测其DNA含量及质量；三、取经步骤二 NanoDrop检测到达标准后的IygS RNA，采用购买自TOYOBO公司的ReverTraAce的试剂盒，以及试验盒配带的dT20引物,按照ReverTra Ace试剂盒的操作手册合成cDNA ;四、取2 μ I步骤三稀释3倍后的cDNA作为RT-PCR模板，以Jl (Seq ID No 7)和J2(Seq ID No :8)为引物，操作步骤按购买自BioRad公司的SYBR Green Supermixkit试剂盒中所介绍的操作步骤进行，每个样品的总反应体积为20 μ L ;五、采用购买自BioRad公司的iCycle iQ实时PCR检测系统进行检测；基因的表达水平以相对于参照基因GmTubulin的相对值来表示，每个点的数值为三个独立叶片的测定结果。El基因在长日照的表达水平曲线图如图12所示，El基因在短日照的表达水平曲线图如图13所示，其中TUB为参照基因GmTubulin ;图12中虚线表示Harosoy-El品种中的El基因，图13中实线表示Harosoy-El品种中的El基因，其中TUB为参照基因GmTubulin。
由图12和13可知，本发明的El基因在短日照条件下表达近于零，说明El抑制开花的效果近于零，大豆品种早开花，且品种间差异消失，间接说明了 El基因的功能，对本试验重复操作一次后，获得了相似结果，重复操作试验证明了短日照表达量低这一规律。广义上来讲启动子是基因(gene)的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子(Promoters)就像“开关”，决定基因的活动。在试验中El启动子区段(如序列表Seq IDNo 3所示的I 2694bp及3436 4332bp序列)必然存在着控制El基因表达的顺式元件，致使El基因出现长日照条件下表达量高，短日照条件下表达量低的特征。
具体实施方式
三本实施方式的含有启动子区段的大豆生育期El基因序列如序列表Seq ID No 3所示。
权利要求
1.一种大豆生育期El基因，其特征在于大豆生育期El基因序列如序列表Seq ID No:I所示。
2.如权利要求I所述的一种大豆生育期El基因的编码蛋白，其特征在于大豆生育期El基因的编码蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
全文摘要
一种大豆生育期E1基因及其编码蛋白，它涉及一种大豆生育期E1基因及其编码蛋白。本发明提供了一种大豆生育期E1基因及其编码蛋白。本发明大豆生育期E1基因序列如序列表Seq ID No1所示。本发明大豆生育期E1基因的编码蛋白的氨基酸序列如Seq ID No2所示。本发明通过图位克隆法克隆出E1基因，并通过转基因及筛选多个EMS突变体库，验证了E1基因具有强烈抑制大豆开花的生理功能。本发明涉及大豆基因领域。
文档编号C07K14/415GK102643832SQ20121011266
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者吕世翔, 吴红艳, 夏正俊, 翟红 申请人:中国科学院东北地理与农业生态研究所