专利名称：动物α干扰素和γ干扰素的表达方法
技术领域：
本发明涉及一种干扰素的表达方法，尤其涉及ー种在昆虫杆状病毒生物反应器中联合表达或共表达动物α干扰素和Υ干扰素的方法，属于重组干扰素的制备领域。
背景技术：
干扰素(Interferon，IFN)是在特定的诱生剂的作用下，由细胞产生的ー种具有高度生物活性的糖蛋白，在本动物细胞中具有广谱抗病毒活性。目前已知干扰素并非直接杀伤病毒，而是通过诱导宿主本身的细胞产生多种酶来干扰病毒的基因转录或者病毒蛋白组分的翻译。干扰素根据产生的细胞来源不同、理化性质和生物学活性差异等方面可以分为I型和II型IFN ;1型IFN主要包括IFN- α、β、ω、δ、κ、ε、ζ和τ等，II型IFN只有 IFN-γ —种(Cann AJ. Principles ofMolecular Virology. Beijing Science Press,2006:177-178)。IFN-y主要是由机体内活化的T淋巴细胞和NK细胞产生的，当抗原、PHA或者ConA刺激后T细胞分泌产生IFN- Y，通常与IL-2的产生一致，IFN- Y对酸敏感，具有抑制病毒复制调节作用，但其抗病毒作用比I型干扰素弱，主要參与诱导主要组织相容性抗原(MHC)的表达盒免疫调节效应，也称为免疫干扰素。I型干扰素的抗病毒活性较II型干扰素要高，但由于II型干扰素具有诱导调节作用，所以对某种生物体(如猪、狗、鸡等)用两种类型干扰素的混合剂的效价远远高于单一任意一种干扰素的效用。干扰素自1957年有Isaacs等人发现后，就一直被克隆并在各种生物反应器中进行表达，比如Vandenbroeck等在大肠杆菌中和昆虫细胞中对猪PoIFN-Y基因的外显子进行了克隆和拼接表达(Vandenbroeck K, et al. Biochem Biophys Res Commun, 1991 1408-1415 ；Vandenbroeck K, et al. Lymphokine Cytokine Res, 1994 :253-258),同样国内ー些研究者也先后利用不同的表达系统表达了 PoIFN-Y。人IgG免疫球蛋白在人体内的半衰期可达到19 21天，IgG的Fe片段被用来与IFN2a连接构成融合蛋白，Fe片段使融合蛋白分子量増大，避免被肾小球滤过，同时Fe片段可与新生Fe受体结合，避免融合蛋白进入溶酶体中被降解，从而延长体内半衰期。构建了 IFN2 a 2b与人IgG免疫球蛋白Fe片段的融合基因并在毕赤酵母中以ニ聚体形式分泌表达，并有部分糖基化。大鼠皮下注射后循环血液中半衰期达65h，血液中存留时间120h以上，比普通重组干扰素的体内半衰期延长约8倍，血液存留时间延长10倍，显示了其良好的临床应用前景(王磊，生物工程学报，2008 53-62)。同样的原理，猪、鸡、犬的α或Y的长效干扰素也可以用相应动物的IgG的Fe片段或HAS序列与其α或Y干扰素基因进行融合表达，应用本申请的方法可获得相应的长效干扰素。杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的α-干扰素以来(Smith，Mol. Cell Biol.，3 2156-2165，1983)，已有数十个外源基因得到了高效表达。昆虫杆状病毒表达载体系统是当今基因工程四大表达系统之一，相对于原核表达系统而言，杆状病毒表达系统是ー种真核、表达系统，具有真核蛋白翻译后加工、修饰和转运体系，表达产物在生物活性、抗原性和免疫原性方面接近天然产物。利用此系统来生产重组蛋白包括各种干扰素的优点在于1.这一表达系统的表达效率极高,产量可达毫克级/虫的水平，因而可大大降低生产成本并使许多贵重的重组蛋白的大規模生产成为可能；2.这ー表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使其在生化性质和生物活性等与天然产品相似，这为表达出的重组蛋白具有正常的生物学活性提供了保证。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。已经成为当今基因工程常用的 四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之一。杆状病毒基因组较大，所以只能通过同源重组的办法，先将外源基因连接到转移载体上，再将转移载体与病毒共转染细胞或者体外酶促重组，从而构建杆状病毒表达载体。一般的转移载体均含有病毒的两个同源臂，一个或多个杆状病毒启动子(多数取多角体启动子)，将外源目的基因插入到启动子下游之后，与杆状病毒重组，得到重组病毒，再将重组病毒纯化，感染昆虫细胞或虫体，外源基因随着病毒的复制的而获得表达。重组病毒最早构建时构建使用的是环状的野生病毒，当病毒与转移载体发生重组之后，病毒的多角体蛋白基因受到破坏，不能形成多角体，感染这种重组毒株的细胞在显微镜下形成空斑，通过多次重复筛选，可以对重组病毒进行纯化，此筛选过程耗费很大人力物力，效率很低，在很大程度上限制了杆状病毒的应用。目前在用杆状病毒表达系统这一生物反应器表达干扰素时，都是单独将ー个类型的干扰素重组到杆状病毒后在昆虫宿主或细胞中进行表达，存在着表达效率低、所表达的重组干扰素产物效价低、稳定性差等缺陷，有待改进。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种新的干扰素的表达方法，该表达方法具有表达效率高，所表达的重组干扰素产物效价高、稳定性好等优点。本发明的主要目的是通过以下技术方案来实现的一种干扰素的表达方法，包括将人或同种动物的α干扰素和Y干扰素在昆虫杆状病毒生物反应器中进行联合表达或共表达。其中，将人或同种动物的α干扰素基因和Υ干扰素基因在昆虫杆状病毒生物反应器中进行联合表达包括以下步骤(I)将人或同种动物的α干扰素基因和Y干扰素基因联合在一起后重组到杆状病毒的复制或感染的非必须基因位点上，获得重组杆状病毒；
(2)用重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞，表达外源基因，得到α干扰素和Υ干扰素联合表达的产物。优选的，步骤(I)中通过IRES序列将人或同种动物的α干扰素基因和Υ干扰素基因连合在一起，用以促进核糖体对后面干扰素基因的表达；所述IRES序列的核苷酸序列为 SEQ ID No. 3 所示。优选的，步骤(I)中通过以下方式将联合在一起的基因重组到杆状病毒的复制或感染的非必须基因位点上将联合在一起的α干扰素基因和Y干扰素基因克隆到杆状病毒转移载体上，获得重组杆状病毒转移载体；将重组杆状病毒转移载体与杆状病毒在昆虫细胞中进行重组，将联合在一起的α干扰素基因和Y干扰素重组到杆状病毒的复制或感染的非必须基因位点上；其中，所述的杆状病毒转移载体优选为PVL1393载体；所述的杆状病毒的复制或感染的非必须基因位点包括多角体基因位点^10、681474426等位点,优选为多角体基因位点。
步骤(2)中所述的感染方式优选为用重组病毒感染昆虫细胞或穿刺接种昆虫幼虫或蛹；在感染3-6天后收集含表达产物的昆虫细胞或幼虫或蛹的体液或组织匀浆。所述的将人或同种动物的α干扰素基因和Υ干扰素基因在昆虫杆状病毒生物反应器中进行共表达包括以下步骤(a)将人或同种动物的α干扰素基因和Y干扰素基因分别重组到杆状病毒的复制或感染的两个非必须基因位点上，获得重组杆状病毒；(b)将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞，表达外源基因，得到α干扰素和Y干扰素共表达的产物；优选的，步骤(a)中按照以下方式将人或同种动物的α干扰素基因和Y干扰素基因分别重组到杆状病毒的复制或感染的两个非必须基因位点上，获得重组杆状病毒将Y干扰素基因同EGFP(增强型绿色荧光蛋白)标记蛋白基因连接一起，通过在大肠杆菌中进行体外重组的方法将其重组到ReBm-dcc-dl629-dlO杆状病毒穿梭载体(家蚕杆状病毒穿梭载体ReBm-dcc-dl629-dlO是通过对BmNPV的0RF1629基因位点进行体外敲除获得无法正常进入病毒生活史的穿梭载体)的PlO基因位点上，通过EGFP的表型筛选出重组载体；将EGFP标记基因敲掉，获得重组了 Y干扰素的缺陷型(ReBm-dcc-dl629-dlO)杆状病毒穿梭载体；将α干扰素基因重组到含有0RF1629同源臂的杆状病毒转移载体中，获得重组杆状病毒转移载体；将重组了 Y干扰素的缺陷型杆状病毒穿梭载体与重组杆状病毒转移载体共转染家蚕细胞，通过失活拯救的方法获得0RF1629基因被修复的重组杆状病毒；在家蚕生物反应器中进行表达从而获得两种类型干扰素的共表达产物。其中，在共表达α干扰素和Y干扰素时，本发明优选将α干扰素重组到杆状病毒的多角体基因位点上，将Y干扰素重组到杆状病毒的PlO基因位点上。另外，为了避免用此生物反应器表达的各种外源干扰素由于表达环境不同而引起的低抗病毒活力或无活力的情况，本发明通过对所获得的各种干扰素的基因进行优化，主要是密码子偏好型和kozak序列的改造，使其尽量能够适合于在所应用的生物反应器中表达出有活性的成分，通过对干扰素基因的优化，提高了干扰素的表达效率及表达产物的效价。本发明对猪α干扰素基因和Υ干扰素基因进行了优化，优化后的猪α干扰素基因的核苷酸序列为SEQ ID No. I所示，优化后的猪Y干扰素基因的核苷酸序列为SEQIDNo. 2所示；此外，本发明对猪α干扰素的序列进行突变，在保证其活性的情况下对其进行改造使其获得比较高的蛋白酶抗性，有利于干扰素在体内存在的时间，经过大量的点突变实验，本发明发现，将猪α干扰素的第64位谷氨酸突变为谷氨酰胺的效果最为优良，有效降低了对血液和组织中蛋白水解酶的敏感性，获得了长效猪α干扰素突变体，编码该突变体的核苷酸序列为SEQ ID No. 9所示，其氨基酸序列为SEQID No. 10所示。本发明对犬α干扰素基因和Υ干扰素基因进行了优化，优化后的犬α干扰素基因的核苷酸序列为SEQ ID No. 5所示，优化后的犬Y干扰素基因的核苷酸序列为SEQIDNo. 6所示；此外，本发明还对鸡α干扰素基因和Y干扰素基因进行了优化，优化后的鸡α干扰素基因的核苷酸序列为SEQ ID No. 7所示，优化后的鸡Y干扰素基因的核苷酸序列为SEQ ID No. 8 所示。 本发明中所述的昆虫杆状病毒包括BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、S1MNPV、SeMNPV、TnNPV 等；所述的昆虫宿主包括家蚕(Bombyx mori)、野香(Bombyx mandarina)、菌麻香(Philosamia cynthiaricimノ、 ^ (Dictyoploca japanicaノ、 _ ^ (Philosamia cynthiapryeriノ、ヰ ^(Antheraea pernyi)、日本ネ乍査(Antneraea yamamai)、里了天金(Antneraea polyphymus)、苜猜尺蠖(Atographa califorica)、荼尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestrabrassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera Iittoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothisarmigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、乐万粘虫(Pseudaletia separata)、舞_蛾(Lymantria dispar)
坐寸O按照本发明的表达方法可在杆状病毒复制或感染的非必须基因位点如多角体基因、pl0、egt、p74、p26等位点通过依次在杆状病毒穿梭质粒中导入干扰素基因表达盒，实现用一个重组病毒同时在宿主昆虫或昆虫细胞内表达多个干扰素。本发明方法将人或同种动物的α干扰素基因和Y干扰素基因在同一昆虫杆状病毒生物反应器中进行联合表达或共表达，所表达的重组干扰素产物之间具有协同增效作用，能够提高重组干扰素产物的效价及稳定性，本发明方法具有表达效率高，表达产物效价闻、稳定性好等优点。
图I含有0RF1629同源臂的pVL1393载体图谱。图2 SIFNG重组BmBacmid后PCR检测峰图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进ー步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。I、菌株、病毒株与载体大肠杆菌株BmNPV，运载载体pVL1393、pBm035,家蚕细胞BmN > Bm-5、Sf-21 细胞，大肠杆菌(ToplO, DH10B)等购自 Invitrogen 公司或日本 RikenBRC ;pGL_3 载体、突光素酶试剂盒 Luciferase Assay System 购自 Promega ;pMD_18T 载体和 pMD-18T-simple 载体购自 TaKaRa 公司；含重组酶的 BW25113/pKD46，DH5alpha/pCP20 购自 Depart of MCD biology 830KBT，耶鲁大学。2、酶与试剂限制性内切酶、连接酶为Promega公司产品。3、生化试剂IPTG、X_Gal、SDS为Sigma公司产品。Lipofectin、低融点琼脂糖LMP、PCR试剂盒、T4DN A连接酶、RNA酶、Proteinase K、细胞培养基TC-100、胎牛血清及其他试剂购于Invitrogen公司。
4、培养基大肠杆菌培养基为LB(1 %蛋白胨、O. 5%酵母提取物、I % NaCl,PH7. O);昆虫细胞培养基为TC-100。5、所用引物表I实验中所用的引物序列
权利要求
1.一种干扰素的表达方法，其特征在于，包括将人或同种动物的a干扰素和Y干扰素在昆虫杆状病毒生物反应器中进行联合表达或共表达。
2.按照权利要求I所述的表达方法，其特征在于，将人或同种动物的a干扰素和Y干扰素在昆虫杆状病毒生物反应器中进行联合表达的方法包括(I)将人或同种动物的a干扰素基因和Y干扰素基因联合在一起后重组到杆状病毒的复制或感染的非必须基因位点上，获得重组杆状病毒；(2)用重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞，表达外源基因，得到a干扰素和Y干扰素联合表达的产物。
3.按照权利要求2所述的表达方法，其特征在干步骤(I)中通过SEQID No. 3所示的核苷酸序列将人或同种动物的a干扰素基因和Y干扰素基因连合在一起。
4.按照权利要求2所述的表达方法，其特征在于，步骤(I)中通过以下方式将联合在一起的基因重组到杆状病毒的复制或感染的非必须基因位点上将联合在一起的a干扰素基因和Y干扰素基因克隆到杆状病毒转移载体上，获得重组杆状病毒转移载体；将重组杆状病毒转移载体与杆状病毒在昆虫细胞中进行重组，将联合在一起的a干扰素基因和Y干扰素重组到杆状病毒的复制或感染的非必须基因位点上。
5.按照权利要求4所述的表达方法，其特征在于所述的杆状病毒转移载体为PVL1393载体；将联合在一起的a干扰素基因和Y干扰素重组到杆状病毒的多角体基因位点上。
6.按照权利要求I所述的表达方法，其特征在于，所述的将人或同种动物的a干扰素基因和Y干扰素基因在昆虫杆状病毒生物反应器中进行共表达的方法包括以下步骤(I)将人或同种动物的a干扰素基因和Y干扰素基因分别重组到杆状病毒的复制或感染的两个非必须基因位点上，获得重组杆状病毒；(2)将重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞，表达外源基因，得到a干扰素和Y干扰素共表达的产物。
7.按照权利要求6所述的表达方法，其特征在于，步骤(I)中按照以下方式将人或同种动物的a干扰素基因和Y干扰素基因分别重组到杆状病毒的复制或感染的两个非必须基因位点上，获得重组杆状病毒将Y干扰素基因同增强型绿色荧光蛋白标记基因连接ー起，将其重组到ReBm-dcc-dl629-dlO杆状病毒穿梭载体的plO基因位点上，通过EGFP的表型筛选出重组载体^fEGFP标记基因敲掉，获得重组了 Y干扰素的缺陷型杆状病毒穿梭载体；将a干扰素基因重组到含有0RF1629同源臂的杆状病毒转移载体中，获得重组杆状病毒转移载体；将重组了 Y干扰素的缺陷型杆状病毒穿梭载体与重组杆状病毒转移载体共转染家蚕细胞，获得重组杆状病毒。
8.按照权利要求6或7所述的表达方法，其特征在干将a干扰素重组到杆状病毒的多角体基因位点上，将Y干扰素重组到杆状病毒的PlO基因位点上。
9.按照权利要求I所述的表达方法，其特征在于所述的动物包括猪、犬或鸡；优选的，所述猪a干扰素基因的核苷酸序列为SEQ ID No. I或SEQ ID No. 9所示，猪、干扰素的核苷酸序列为SEQ ID No. 2所示；犬a干扰素的核苷酸序列为SEQ ID No. 5所示，犬、干扰素的核苷酸序列为SEQ ID No. 6所示；鸡a干扰素的核苷酸序列为SEQID No. 7所示，鸡Y干扰素的核苷酸序列为SEQ ID No. 8所示。
10.ー种猪a干扰素突变体，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID No. 10所示。
全文摘要
本发明公开了一种动物α干扰素和γ干扰素的表达方法，包括将人或同种动物的α干扰素和γ干扰素在昆虫杆状病毒生物反应器中进行联合表达或共表达。本发明将人或同种动物的α干扰素基因和γ干扰素基因在同一昆虫杆状病毒生物反应器中进行联合表达或共表达，所表达的重组α干扰素产物和重组γ干扰素之间具有协同增效作用，能够提高重组干扰素产物的效价及稳定性。本发明方法具有表达效率高，产物效价高、稳定性好等优点。
文档编号C07K14/56GK102628062SQ20121011053
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月13日 优先权日2012年4月13日
发明者丁农, 刘兴健, 张志芳, 张金卫, 易咏竹, 李轶女, 李金祥, 沈桂芳, 王国增, 钟鲁龙 申请人:中国农业科学院生物技术研究所