专利名称：一种犬α干扰素衍生物的制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种犬a干扰素衍生物的制备方法与应用，属于蛋白质类药物修饰领域。
背景技术：
目前我国约有宠物I亿只，主要为犬，而且数量仍在急剧增长，与此同时，犬瘟热、 细小病毒病和腺病毒病等严重危害着犬的健康，给宠物犬的饲养造成极大地经济损失。在目前靠疫苗预防为主的情况下，干扰素已成为唯一治疗犬病毒病的有效药物，但由于蛋白质类药物自身的一些缺点制约了其进一步发展①稳定性差，易被胃肠道内蛋白水解酶水解，难以口服给药；②较高的免疫原性，易引起发热、过敏等不良反应；③半衰期短，进入机体后易被循环系统清除，生物利用度低，频繁给药增加了工作量且造成极大地痛苦。为了提高疗效，延长半衰期，降低免疫原性等，国内外学者对干扰素等蛋白质类药物的修饰技术进行了深入的研究，包括脂质体、多糖缓释技术，以及基因突变，共价修饰等，其中，聚乙二醇 (PEG)共价修饰技术能有效改善药物体内分布和药动学性质，是近十几年来应用较广的改进蛋白质类药物药动学性质的新技术。聚乙二醇是由环氧乙烷与水或乙二醇不断加成聚合而成的高分子化合物。有学者将PEG注射小鼠做实验发现PEG为基本无毒的化学物质，且广泛应用于化妆品、食品和制药等行业。聚乙二醇易溶于水及乙醚、己烷等有机溶剂，在水溶液中，PEG为高度水合的聚合物，由于其具有高度灵活的骨架以及和水分子的高度结合性，PEG流体动力学体积为相近分子量水溶性蛋白分子的5到10倍，并且，当PEG与蛋白结合后，对这些蛋白的性质几乎没有太大的影响，但却可以在很大程度上提高这些蛋白的溶解度和分子量。由于普通聚乙二醇末端为活性很低的羟基，需要在复杂条件才能够发生与蛋白质类药物的共价结合，对蛋白质类药物的活性造成一定的损失，且不利于大批量生产纯化。
发明内容
本发明的目的是提供一种犬a干扰素衍生物的制备方法与应用。该犬a干扰素衍生物的制备方法，包括以下步骤I)用氨基保护剂封闭犬a干扰素中赖氨酸残基的ε氨基，得到ε氨基被封闭的犬a干扰素；2)使所述ε氨基被封闭的犬a干扰素的位于氨基端的a氨基和醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应；反应完毕后，去除所述氨基保护剂，得到所述犬a干扰素衍生物；所述犬a干扰素衍生物为犬a干扰素的a氨基与醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应形成酰胺键后生成的化合物；所述犬a干扰素衍生物分子量为40KD。所述步骤2)中所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇为丙醛基修饰的单甲氧基封端的直链聚乙二醇，分子量为20KD。所述步骤I)中所述氨基保护剂具体可为二甲基马来酸酐，其用量为所述犬a干扰素氨基端的α氨基和赖氨酸残基的ε氨基的摩尔数之和的3-5倍，或具体可为O. 2g所述犬α干扰素使用0.0664g 二甲基马来酸酐或Ig所述犬α干扰素使用O. 332g 二甲基马来酸酐；所述封闭是在0°C，pH值为8. 5的磷酸盐缓冲溶液中进行；所述磷酸盐缓冲溶液的溶质为43mM的Na2HPO4和14mM的KH2PO4，溶剂为水。所述步骤I)中所述犬α干扰素在所述磷酸盐缓冲溶液中的含量为2mg/ml-10mg/ ml ο所述步骤2)中所述亲核取代反应是在如下条件下进行的温度为37°C，使用 NaBH3CN作为催化剂；所述NaBH3CN的用量与所述步骤I)中所述犬α干扰素摩尔数相同， 或具体可为O. 2g步骤I)中所述犬α干扰素使用O. 032g NaBH3CN或Ig步骤I)中所述犬 α干扰素使用O. 16g NaBH3CN0所述步骤2)中所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇的用量为步骤I)中所述犬α干扰素摩尔数的2-10倍,或具体可为O. 2g步骤I)中所述犬α干扰素使用2. 63g所述醒基化的单甲氧基聚乙二醇或具体可为Ig步骤I)中所述犬α干扰素使用7.89g所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇；去除所述氨基保护剂的方法是将反应体系的PH调至6. O。由以上任一所述方法制备的犬α干扰素的衍生物也属于本发明保护的范围。所述的衍生物可用于制备病毒抑制剂。所述病毒为犬瘟热病毒。使用本发明的方法得到的犬α干扰素衍生物，其修饰率约为30%以上，分离纯化后纯度可达95%以上；半衰期为犬α干扰素的3-5倍，活性为犬α干扰素的70%。使用本发明的方法可有效地延长干扰素的半衰期，提高干扰素在体内的有效作用时间，最终可得到一种不会产生耐药性的杀灭病毒的蛋白质类新药，拓宽了蛋白质类药物在临床上的应用。
图I为不同反应时间的反应产物的SDS-PAGE鉴定。其中，M泳道为分子量标准， 从上到下依次为 97. 4KD、66. 2KD、43. 0KD、31. 0KD、20. IKD 和 14. 4KD ;1Η、1· 5Η、2Η、2. 5Η、3Η、 12Η和17Η泳道分别代表反应时间为1、1. 5、2、2. 5、3、12、17小时后的反应产物。图2为聚乙二醇修饰犬α干扰素的SDS-PAGE鉴定。其中，从左到右的泳道依次为分子量标准(同图I)、实施例2得到的反应产物和实施例3得到的反应产物。图3为Superdex 75分离纯化聚乙二醇修饰的犬α干扰素衍生物的洗脱图谱。其中，A为聚乙二醇修饰的犬α干扰素衍生物，B为未修饰的游离犬α干扰素，C为杂蛋白。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例所用的醛基化的单甲氧基聚乙二醇是丙醛基修饰的单甲氧基封端的直链聚乙二醇，又称为单甲氧基聚乙二醇丙醛，分子量为20kD。实施例I、犬α干扰素(CaIFNa-2b)的制备与纯化I)将序列表中序列I所示的犬α干扰素成熟肽基因用EcoRI和Hind III酶切后连接到质粒pET-21a(+)(默克化工，69740)的EcoRI和Hind III位点间得到重组表达载体 ρΕΤ-CaIFNa -2b。2)将ρΕΤ-CaIFN a -2b转入菌株Rosetta (DE3)(购自全式金生物科技有限公司)的感受态细胞，得到含有重组表达载体pET-CaIFNa-2b的重组菌Rosetta(DE3)/ ρΕΤ-CaIFNa -2b。将pET_21a(+)转入菌株Rosetta(DE3)(购自全式金生物科技有限公司) 的感受态细胞，得到含有空载体的对照重组菌Rosetta (DE3)/pET-2Ia (+)。将重组菌Rosetta (DE3)/pET_CaIFNa -2b 和 Rosetta (DE3)/pET-2Ia (+)分别在 LB 液体培养基中37°C下培养3小时，提取包涵体(用超声破碎细胞，12000rpm离心，将沉淀溶于8M盐酸胍水溶液中)，进行SDS-PAGE鉴定。3)将步骤2)得到的包涵体3ml约60mg逐滴加入到500ml复性液(由IOOmM Tris · Cl、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM还原型谷胱甘肽和O. 5mM氧化型谷胱甘肽组成的水溶液；该复性液的PH为8. O)中，4°C条件下复性6-12小时。4)浓缩管离心浓缩步骤3)得到的复性包涵体，经凝胶过滤层析和离子交换柱层析分离纯化，得到高纯度的犬α干扰素CaIFNa-2b，大小为21KD。其中，凝胶过滤层析和离子交换柱层析具体方法如下将步骤4)浓缩的复性包涵体经Superdex75(GE公司，17-5174-01)凝胶过滤层析， 洗脱液为PH8. 5的O. OlM的PBS溶液，层析柱规格30cm(柱长)X lcm(内径)，上样体积为 5 μ L，流速为lml/min。收集得到的主峰(洗脱体积为70_74mL)进行活性检测，然后进行 SDS-PAGE。将上述活性峰溶液经过pH8. O的Tris缓冲溶液(溶质为IOmM的Tris和IOmM的 NaCl，溶剂为水)平衡后，进行阴离子交换柱层析。该离子交换柱的体积为5ml。对照Rosetta(DE3)/pET-2Ia(+)经包涵体提取后得到的产物在分离纯化中的洗脱峰经犬α干扰素的活性检测无活性，说明Rosetta(DE3)/pET_CaIFNa -2b的包涵体分离纯化过程中的洗脱峰活性为犬α干扰素成熟肽基因表达产生的蛋白活性。实施例2、低浓度犬α干扰素条件下mPEG20000-CaIFN a -2b的制备I)犬α干扰素溶液的制备用O. IM磷酸盐缓冲液(溶质为43mM的Na2HPO4和 14mM的KH2PO4，溶剂为水，pH8. 5)溶解实施例I制备的犬α干扰素(CaIFN a -2b)，得到浓度为 2mg/mL CaIFN a -2b 的 10OmT,溶液。2)封闭反应将步骤I)得到的2mg/mL CaIFN a -2b的IOOmL溶液进行(TC冰浴， 在缓慢搅拌条件下加入O. 0664g 二甲基马来酸酐(DMMAn)，待DMMAn溶解后再持续搅拌 30mino3)亲核取代反应将步骤2)的反应体系升温至37°C，在缓慢搅拌条件下加入 2. 63g单甲氧基封端、丙醛基修饰的直链聚乙二醇(mPEG20000-ALD)(分子量为20KD，北京键凯科技有限公司，M-ALD-20K)，待mPEG20000-ALD溶解后再加入O. 032g氰化硼氢化钠 (NaBH3CN)，溶解后保持反应30min。4)终止反应以O. IM的HCl调节步骤3)反应溶液的pH至6. 0，37 °C再持续搅拌30min，得到含有犬α干扰素衍生物mPEG20000-CaIFN a -2b的溶液。该 mPEG20000-CaIFNa-2b为犬α干扰素的α氨基与醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应形成酰胺键后生成的化合物。
实施例3、高浓度犬α干扰素条件下mPEG20000-CaIFN a -2b的制备I)犬α干扰素溶液的制备用O. IM磷酸盐缓冲液(溶质为43mM的Na2HPO4和 14mM的KH2PO4,溶剂为水，ρΗ8· 5)溶解实施例I制备的CaIFNa -2b，得到浓度为IOmg/ mLCaIFN a -2b 的 IOOmL 溶液。2)封闭反应将步骤I)得到的10mg/mL CaIFN a -2b的IOOmL溶液于(TC冰浴，在缓慢搅拌条件下加入O. 332g 二甲基马来酸酐(DMMAn)，待DMMAn溶解后再持续搅拌30min。3)亲核取代反应将步骤2)的反应体系升温至37°C，在缓慢搅拌条件下加入 7. 89g单甲氧基封端、丙醛基修饰的直链聚乙二醇(mPEG20000-ALD)(分子量为20KD，北京键凯科技有限公司，M-ALD-20K)，待mPEG20000-ALD溶解后再加入O. 16g氰化硼氢化钠 (NaBH3CN)，溶解后保持反应30min。4)终止反应以O. IM的HCl调节步骤3)的反应溶液pH至6. 0，37 °C再持续搅拌30min，得到含有犬α干扰素衍生物mPEG20000-CaIFN a -2b的溶液。该 mPEG20000-CaIFNa-2b为犬α干扰素的α氨基与醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应形成酰胺键后生成的化合物。实施例4、不同反应时间对PEG修饰犬α干扰素的影响按照实施例2的方法，将加入NaBH3CN后的反应时间分别设置为I、I.5、2、2.5、3、 12、17小时，其他步骤同实施例2。结果如图I所示。实施例5、mPEG20000-CaIFN a -2b 的分离纯化I)将实施例2和实施例3得到的含有犬α干扰素衍生物mPEG20000-CaIFN a -2b 的溶液中O. IM的磷酸盐缓冲溶液更换为IOmM磷酸盐缓冲液(溶质为4. 3mM的Na2HPO4和
I.4mM的KH2PO4,溶剂为水，pH7. O)，进行Superdex 75凝胶过滤层析。2)收集洗脱峰A处的蛋白(如图2所示)，即得至IJ mPEG20000-CaIFN a -2b原液。3)经SDS-PAGE鉴定，实施例2和实施例3制备的mPEG20000_CaIFN a -2b的大小均为40KD，结果如图3所示。
权利要求
1.一种制备犬α干扰素衍生物的方法，包括以下步骤1)用氨基保护剂封闭犬α干扰素中赖氨酸残基的ε氨基，得到ε氨基被封闭的犬 α干扰素；2)使所述ε氨基被封闭的犬α干扰素的位于氨基端的α氨基和醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应；反应完毕后，去除所述氨基保护剂，得到所述犬α干扰素衍生物；所述犬α干扰素衍生物为犬α干扰素的α氨基与醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应形成酰胺键后生成的化合物，所述犬α干扰素衍生物分子量为40KD。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤2)中所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇为丙醛基修饰的单甲氧基封端的直链聚乙二醇，分子量为20KD。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述步骤I)中所述氨基保护剂为二甲基马来酸酐，其用量为所述犬α干扰素氨基端的α氨基和赖氨酸残基的ε氨基的摩尔数之和的3-5倍；所述封闭是在0°C，pH值为8. 5的磷酸盐缓冲溶液中进行；所述磷酸盐缓冲溶液的溶质为43mM的Na2HPO4和14mM的KH2PO4，溶剂为水。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤I)中所述犬α干扰素在所述磷酸盐缓冲溶液中的含量为2mg/ml-1 Omg/ml。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述步骤2)中所述亲核取代反应是在如下条件下进行的温度为37°C，使用NaBH3CN作为催化剂；所述NaBH3CN的用量与所述步骤I)中所述犬α干扰素的摩尔数相同。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述步骤2)中所述醛基化的单甲氧基聚乙二醇的用量为步骤I)中所述犬α干扰素摩尔数的2-10倍；去除所述氨基保护剂的方法是将反应体系的pH调至6. O。
7.由权利要求1-6中任一所述方法制备得到的犬α干扰素衍生物。
8.权利要求7所述的衍生物在制备病毒抑制剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种犬α干扰素衍生物的制备方法与应用。该方法包括以下步骤1)用氨基保护剂封闭犬α干扰素中赖氨酸残基的ε氨基，得到ε氨基被封闭的犬α干扰素；2)使所述ε氨基被封闭的犬α干扰素的位于氨基端的α氨基和醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应；反应完毕后，去除所述氨基保护剂，得到所述犬α干扰素衍生物。所述犬α干扰素衍生物为犬α干扰素的α氨基与醛基化的单甲氧基聚乙二醇发生亲核取代反应形成酰胺键后生成的化合物，分子量为40KD。使用本发明的方法得到的犬α干扰素衍生物修饰率约为30％以上，分离纯化后纯度可达95％以上，半衰期为犬α干扰素的3倍，活性为犬α干扰素的70％。
文档编号A61K47/48GK102585011SQ20121002968
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者夏春, 李奇润 申请人:中国农业大学