一种犬干扰素α融合蛋白及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程【技术领域】，具体公开了一种犬干扰素α融合蛋白及编码该犬干扰素α融合蛋白的核酸序列及其制备方法和应用。本发明犬干扰素α融合蛋白可溶性好，稳定性高，不需要酶切即具有活性，具有良好应用价值。
【专利说明】一种犬干扰素 α融合蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种具有抗病毒活性的犬干扰素 α融 合蛋白及其核酸序列及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 干扰素（interferon，INF)是最早发现的细胞因子，因其具有干扰病毒的感染和 复制功能而得名。其中，干扰素 α因其广谱的生物学功能而被广泛应用和研究。1986年，美 国国家食品和药品管理局（FDA)批准重组α干扰素治疗人毛细胞白血病，此后，重组INFa 又被批准治疗艾滋病患者发生的Kaposi' s肉瘤、慢性髓样白血病、滤泡性非霍奇金氏淋巴 瘤、黑色素瘤、丙型肝炎、乙型肝炎等疾病[金伯泉，医学免疫学[M].第5版.北京：人民卫 生出版社，2008 :61.]。犬是人类忠实的朋友。根据犬的用途，可分为宠物犬和实用犬，实用 型的犬有实验犬、导盲犬、警犬等。无论哪一种，均是人类生活和工作上的好伙伴。但是随 着饲养量的增加，犬病，特别是病毒病的发病率不断升高，常常导致犬的死亡，给人类造成 精神和经济上的损失。犬的3大烈性病毒病，包括狂犬病、犬细小病毒病和犬温热病，致死 率均非常高[王红.犬α干扰素的表达及其治疗犬病毒性肠炎临床疗效观察[D].北京： 中国农业科学院，2009.]。犬干扰素 α由于其抗病毒活性而在治疗犬的病毒病方面有很大 的前景。
[0003] 传统的生产干扰素 α的方法是用人工方法在动物机体外或体内，在干扰素诱 生剂诱导下产生干扰素 α。由于动物产生的干扰素 α很微量[王红，犬α干扰素的表 达及其治疗犬病毒性肠炎临床疗效观察[D].北京：中国农业科学院，2009.]，传统方法 产生的干扰素 α无法满足需求。随着分子生物学的发展，基因工程表达干扰素 α成为 可能。从1987年Adolf Himmler第一个克隆出犬干扰素 α的基因 [Adolf Himmler, Rudolf Hauptmann, etc. Structure and expression in Escherichia coli of Canine Interferon- a gene [J]. Journal of interferon research，1987, 7 :173-183.]后，国内 外陆续有关于基因工程克隆表达犬干扰素 α的研究报道[Taira, 0, etc. Cloning and expression of Canine interferon-a genes in Escherichia coli[J]· Immunology, 2005,67(10) :1059-1062.项黎丽等，犬α干扰素的克隆、表达及纯化[J].中国动物检疫， 2010,1 :35-38. ]〇
[0004] 但干扰素 α在大肠杆菌中多以包涵体形式存在，几乎无活性，需要经过变性复性 的过程来获得具有活性的蛋白质[李桂伟.犬α干扰素的基因工程研究进展[J].黑龙江 水产，2012,1 :38-39]。复性过程时间长，需要大量的化学试剂，提高了成本。并且犬干扰素 α中含有多个二硫键，增加了复性成功的困难。所以不需要复性的可溶的蛋白是降低工业 成本的关键。
[0005] 现有技术中，为提高外源蛋白在大肠杆菌系统中表达的可溶性，通常采用基因工 程技术将目标蛋白与一些分子伴侣蛋白相融合。该方法在提高外源蛋白可溶性的同时往往 还能提高融合蛋白在大肠杆菌中的表达量。但是融合蛋白通常需要表达后再酶切才能释放 出有活性的蛋白。而酶切的步骤增加了纯化工艺和成本，酶消化过程则增加了蛋白质的不 稳定性。因此本发明提出的基因工程表达的犬干扰素 α不需要酶切将极大地节约生产的 成本。另外，现在市场上的干扰素制剂需要每天给药，2-4周为一个疗程。每天给药和长时 间的周期不仅是病犬的痛苦，也增加了饲养主的精神和经济负担。本发明通过基因工程将 犬干扰素 α与大肠杆菌蛋白NusA蛋白融合表达，NusA蛋白分子量大，能够保护分子量较 小的犬干扰素 α，形成空间位阻，阻止蛋白酶对犬干扰素 α的降解，使犬干扰素 α稳定性 提高，能长时间保留活性，本发明对犬干扰素 α稳定性的提高有效地改善了上述现状。
【发明内容】
[0006] 现有技术中的犬干扰素 α在大肠杆菌表达系统中多为包涵体。本发明克服了现 有技术制备犬干扰素 α产物为包涵体的缺陷，提出了一种可溶的犬干扰素 α融合蛋白及 其核酸序列。针对现有技术中的犬干扰素 α多为包涵体、表达量低、融合蛋白虽能解决上 述缺陷但往往需要表达后再酶切才能释放出有活性的犬干扰素 α的问题，本发明提出了 一种犬干扰素 α融合蛋白，不但不用酶切就有活性，且稳定性提高。
[0007] 本发明提出一种编码犬干扰素 α融合蛋白的核酸序列，所述犬干扰素 α融合蛋 白具有如SEQ ID No :1所示的核酸序列。
[0008] 其中，所述之核酸序列包含位于N端的NusA核酸序列和位于C端的犬干扰素 α 核酸序列，所述NusA核酸序列与所述犬干扰素 α核酸序列之间由EcoR I酶切序列连接。
[0009] 其中，所述之犬干扰素 α核酸序列是针对大肠杆菌表达系统密码子偏好性优化 过的核酸序列。参照大肠杆菌表达系统对氨基酸密码子的偏爱性、碱基GC含量、mRNA二级 结构等综合因素对天然犬干扰素 α核酸序列进行优化，得到既不改变天然犬干扰素 α的 氨基酸序列，又能在大肠杆菌表达系统中正常表达的核酸序列；所述之犬干扰素 α核酸序 列具有如SEQ ID No :3所述的核酸序列。
[0010] 其中，所述犬干扰素 α融合蛋白为可溶蛋白。
[0011] 本发明还提出了一种犬干扰素 α融合蛋白，其包含一NusA蛋白和一犬干扰素 α， 编码所述犬干扰素 α融合蛋白的核酸序列如SEQ ID No :1所示。NusA蛋白为大肠杆菌中 一种重要的蛋白，能减少某些转录的暂停，提高转录量。本发明首次提出将犬干扰素 α与 NusA蛋白融合，从而使其成为可溶性蛋白，而不是包涵体。本发明所述犬干扰素 α融合蛋 白的核酸序列经过密码子优化，能在大肠杆菌系统中正常表达，从而使表达得到的犬干扰 素 α融合蛋白为可溶蛋白。
[0012] 本发明犬干扰素 α融合蛋白包含位于氮端的大肠杆菌NusA蛋白和位于碳端的犬 干扰素 α蛋白，所述NusA蛋白与所述犬干扰素 α蛋白由双肽Glu-Phe连接。连接NusA 蛋白与犬干扰素 α蛋白的双肽具有如SEQ ID No :2所示的氨基酸序列，该双肽不能被特异 性蛋白酶酶切，能稳定连接NusA蛋白和犬干扰素 α蛋白。本发明将犬干扰素 α与大肠杆 菌蛋白NusA蛋白融合，形成可溶的犬干扰素 α融合蛋白，该可溶的犬干扰素 α融合蛋白 不需要酶切，具有抗病毒活性。
[0013] 本发明中，所述犬干扰素 α融合蛋白具有如SEQ ID No :5所示的氨基酸序列。
[0014] 本发明犬干扰素 α融合蛋白为可溶性蛋白。本发明犬干扰素 α融合蛋白不需要 酶切即有抗病毒活性。其中，所述犬干扰素 α融合蛋白降解缓慢，具有高稳定性，具有长效 抗病毒活性。本发明提出了一种不需要酶切即有抗病毒活性的可溶性的犬干扰素 α融合 蛋白，所述犬干扰素 α融合蛋白为可溶性表达，不需要复性，具有高稳定性。
[0015] 本发明犬干扰素 α融合蛋白具有高稳定性。本发明犬干扰素 α融合蛋白是由犬 干扰素 α与大肠杆菌蛋白NusA蛋白融合组成，所述NusA蛋白与所述犬干扰素 α蛋白由双 肽Glu-Phe连接。NusA蛋白分子量大，能够保护分子量较小的犬干扰素 α，形成空间位阻， 阻止蛋白酶对犬干扰素 α的降解，使犬干扰素 α稳定性增强，活性延长。在本发明一个实 施例中，犬干扰素 α融合蛋白在37 C放直12h后蛋白含量保留约90%，放直96h后蛋白含 量仍保留约63%。在本发明另一个实施例中，用犬干扰素 α融合蛋白处理细胞，即在含有 血清、各种蛋白酶和细胞因子的环境下，96h时活性仍然为30%左右。相比较地，现有技术 中，例如文献（朱姣等，重组复合α干扰素及其聚乙二醇化修饰产物理化性质研究[J]，药 物生物技术，2009,16(1) :28-32)记载，在37°C血清中放置72h，干扰素活性降为0。例如， 另一文献（姚文兵等，聚乙二醇修饰干扰素 a_2b的稳定性研究[J]，中国生化药物杂志， 2001,22(6) :289-292)记载，干扰素 α在37°C放置8h，活性只保留原来的20%，放置25h 后活性基本丧失，而不同PEG修饰的干扰素 α只保留约80%和50%活性。该文献记载，在 37°C血清中放置lh，干扰素 α活性基本丧失，不同PEG修饰的干扰素 α只保留约30%和 10%活性。本发明犬干扰素 α融合蛋白同时具有高度的结构稳定性和活性稳定性。现有技 术通常用PEG修饰来增加稳定性，但是PEG修饰和纯化工艺复杂，时间长，增加了成本。本 发明犬干扰素 α融合蛋白不需要修饰即具有高度稳定性，且稳定性比经现有技术PEG修饰 后的更1?。
[0016] 本发明还提供了上述犬干扰素 α融合蛋白的制备方法。本发明所提供的犬干 扰素 α融合蛋白可参考常规基因工程表达方法而得。将犬干扰素 α的DNA序列按照大 肠杆菌表达系统的密码子偏爱性优化密码子。通过克隆技术连接到表达NusA蛋白的载体 pET44a中，形成编码犬干扰素 α融合蛋白的重组质粒，再将该质粒转化进大肠杆菌BL21表 达系统中，经诱导表达而产生犬干扰素 α融合蛋白。当诱导温度较低时，所表达的犬干扰 素 α融合蛋白为可溶性表达。经过镍离子亲和层析纯化，透析除盐，最终得到犬干扰素 α 融合蛋白。
[0017] 本发明制备方法中，该表达载体为pET44a原核表达载体，表达系统为大肠杆菌 BL21 (DE3)表达系统，纯化方法为镍离子柱亲和层析，除盐方法为透析除盐。
[0018] 本发明制备方法中，诱导表达的适宜温度范围为18°C -37°C。优选地，诱导温度为 25。。。
[0019] 本发明中，编码犬干扰素 α融合蛋白的重组质粒的构建方法如下：首先参照大肠 杆菌BL21 (DE3)对氨基酸密码子的偏爱性、GC含量、mRNA二级结构等综合因素对天然犬干 扰素 α的核酸序列进行优化，得到既不改变天然犬干扰素 α的氨基酸序列、又能在大肠杆 菌BL21(DE3)中高效表达的犬干扰素 α成熟肽基因，其序列如下，如SEQ ID No :3所示：
[0020] TGCCATCTGCCGGATACCCATAGCCTGCGCAATTGGCGTGTGCTGACGCTGCTGGGCCAGATGCGTCGT CTGAGCGCGAGCAGCTGTGATCATTATACCACCGATTTTGCGTTTCCGAAAGAACTGTTTGATGGCCAGCGTCTGCA AGAGGCGCAAGCGCTGAGCGTGGTGCATGTGATGACCCAGAAAGTGTTTCATCTGTTTTGCACCAATATGAGCAGCG CACCGTGGAATATGACCCTGCTGGAAGAGCTGTGTAGCGGCCTGAGCGAACAGCTGGATGATCTGGATGCGTGCCCG CTGCAGGAGGCAGGTCTGGCGGAAACCCCGCTGATGCATGAAGATAGCACCCTGCGTACCTATTTTCAACGCATTAG CCTGTACCTGCAAGATCGTAATCATAGCCCGTGCGCGTGGGAAATGGTGCGTGCGGAAATTGGCCGTAGCTTTTTCA GCCTGACCATTCTGCAGGAACGTGTTCGTCGTCGTAAATAA(SEQ ID No:3)
[0021] 为将犬干扰素 α成熟肽基因 （SEQ ID No :3)构建到表达NusA蛋白的pET44a表 达载体中，在SEQ ID No :3序列的5'端添加 CCGGAATTC(其中CCG为保护碱基，GAATTC为 EcoRI酶切位点），3'端添加 CTCGAGCGG (其中CTCGAG为XhoI酶切位点，CGG为保护碱基）， 得到CaIFNa序列（SEQ ID No :4)，委托生物公司合成。其次，将人工合成的CaIFNa序列 (SEQ ID No:4)和表达载体pET44a均用EcoRI/XhoI双酶切，将酶切后的CaIFNa连接到载 体pET44a上，形成重组质粒pET44_CaIFNa。将重组质粒 pET44_CaIFNa转化入大肠杆菌 DH5 a，筛选单克隆鉴定。经证实该重组质粒含有表达犬干扰素 a融合蛋白（SEQ ID No: 5)的基因序列 NusA-CaIFNa (SEQ ID No :1)。
[0022] 其中，发酵犬干扰素 a融合蛋白的方法具体如下：首先将含有NusA-CaIFNa基 因序列（SEQ ID N〇:5)的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达犬干扰素 a融 合蛋白的基因工程菌pET44-CaIFN a /BL21 (DE3)。将上述基因工程菌pET44-CaIFN a / BL21(DE3)接种于LB培养基中，37°C 210rpm过夜培养活化。将活化后的菌种转接于新鲜的 LB培养基中培养。当(?6(|(|为06-0. 8时加入IPTG，使其终浓度为lmmol/L。25°C，210rpm诱 导 12h。
[0023] 其中，纯化犬干扰素 a融合蛋白的方法具体如下：将发酵犬干扰素 a融合蛋白 的菌液离心，收集菌体。用IDAO重悬，超声破碎菌体。离心收集上清。取镍离子亲和层析 柱，将超声上清缓慢加入到层析柱中，再分别用2个柱体积的IDAO, IDA80, IDA100, IDA150， IDA200, IDA300, IDA1000溶液洗脱。收集含目的蛋白的梯度，用PBS透析除去咪唑。得到 纯化后的犬干扰素 a融合蛋白。
[0024] 其中各溶液的配方如下：
[0025] IDAO :20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5M NaCl。
[0026] IDA80 :20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5M NaCl，80mM 咪唑。
[0027] IDAlOO :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5M NaCl，IOOmM 咪唑。
[0028] IDA150 :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5M NaCl，150mM 咪唑。
[0029] IDA200 :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5M NaCl，200mM 咪唑。
[0030] IDA300 :20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5M NaCl，300mM 咪唑。
[0031] IDA1000 :20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5M NaCl，IM 咪唑。
[0032] PBS :NaCl 8g，KCl 0· 2g，Na2HPO4. 12H20 3. 5g，KH2PO4 0· 27g，蒸馏水定容至 1L。
[0033] 本发明还提供了犬干扰素 α融合蛋白的应用，进一步提出了所述犬干扰素 α融 合蛋白在制备犬抗病毒药物中的应用。其中，所述犬干扰素 a融合蛋白降解缓慢，具有高 稳定性，具有长效活性。所述犬干扰素 a融合蛋白为可溶性表达，不需要复性。所述犬干 扰素 a融合蛋白不需要酶切即具有活性。实验证明，本发明犬干扰素 a融合蛋白具有抗 病毒活性，能保护犬肾细胞（MDCK)不受水泡性口炎病毒（VSV)的感染，本发明犬干扰素 a 融合蛋白可应用于制成犬抗病毒药物。
[0034] 本发明还提出了利用所述犬干扰素 a融合蛋白抑制犬病毒活性的方法。其中，所 述犬干扰素 a融合蛋白为无需酶切即具有抗病毒活性的可溶性蛋白。其中，所述犬干扰素 a融合蛋白为可溶性表达，不需要复性。其中，所述犬干扰素 a融合蛋白降解缓慢，具有高 稳定性，具有长效活性。
[0035] 本发明有益效果包括：本发明提出了一种编码犬干扰素 α融合蛋白的核酸序列， 该核酸序列是针对大肠杆菌表达系统密码子偏好性优化所得，能在大肠杆菌中正常表达。 本发明还提出了一种犬干扰素 α融合蛋白。现有技术中重组犬干扰素 α多为包涵体，需 要复性才有活性，融合蛋白虽能解决上述问题但往往需要酶切才能释放出有活性的犬干扰 素 α。而本发明所述之犬干扰素 α融合蛋白为可溶性表达，不需要复性，克服了包涵体的 缺陷。且本发明所述犬干扰素 α融合蛋白不需要酶切即具有活性，省去了酶切过程所需要 的时间和试剂，节约了成本。同时本发明所述之犬干扰素 α融合蛋白稳定性高，作为犬抗 病毒药物中能减少用药次数，降低用药成本，因此具有很高的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1为犬干扰素 α融合蛋白重组质粒的鉴定图；1、2 :DNA marker ;3 :重组质粒； 4 :EcoRI和XhoI双酶切；5 :PCR鉴定。
[0037] 图2为不同温度诱导犬干扰素 α融合蛋白的可溶性鉴定；I :Protein marker ; 2-3 :18°C诱导的超声上清和沉淀；4-5 :25°C诱导的超声上清和沉淀；6-7 :37°C诱导的超声 上清和沉淀。
[0038] 图3为犬干扰素 α融合蛋白纯化前后的鉴定图；I :Protein marker ;2 :超声上 清；3 :超声沉淀；4 :过亲和柱后；5 :纯化后。
[0039] 图4为犬干扰素 α融合蛋白在37°C的体外稳定性情况。
[0040] 图5为犬干扰素 α融合蛋白处理犬肾细胞不同时间后的活性。
【具体实施方式】
[0041] 结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容 不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变 化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、 条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识， 本发明没有特别限制内容。
[0042] 实施例1编码犬干扰素 α融合蛋白的核酸序列的构建
[0043] 第一步：犬干扰素 α基因的优化
[0044] 参照大肠杆菌BL21 (DE3)对氨基酸密码子的偏爱性、GC含量、mRNA二级结构等综 合因素对天然犬干扰素 α的核酸序列进行优化，得到既不改变天然犬干扰素 α的氨基酸 序列，又能在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的犬干扰素 α成熟肽基因，其序列如以下SEQ ID No :3 所示：
[0045] TGCCATCTGCCGGATACCCATAGCCTGCGCAATTGGCGTGTGCTGACGCTGCTGGGCCAGATGCGTCGT CTGAGCGCGAGCAGCTGTGATCATTATACCACCGATTTTGCGTTTCCGAAAGAACTGTTTGATGGCCAGCGTCTGCA AGAGGCGCAAGCGCTGAGCGTGGTGCATGTGATGACCCAGAAAGTGTTTCATCTGTTTTGCACCAATATGAGCAGCG CACCGTGGAATATGACCCTGCTGGAAGAGCTGTGTAGCGGCCTGAGCGAACAGCTGGATGATCTGGATGCGTGCCCG CTGCAGGAGGCAGGTCTGGCGGAAACCCCGCTGATGCATGAAGATAGCACCCTGCGTACCTATTTTCAACGCATTAG CCTGTACCTGCAAGATCGTAATCATAGCCCGTGCGCGTGGGAAATGGTGCGTGCGGAAATTGGCCGTAGCTTTTTCA GCCTGACCATTCTGCAGGAACGTGTTCGTCGTCGTAAATAA(SEQ ID No:3)
[0046] 为将犬干扰素 α成熟肽基因 （SEQ ID No :3)构建到表达NusA蛋白的pET44a表 达载体中，在SEQ ID No :3序列的5'端添加 CCGGAATTC(其中CCG为保护碱基，GAATTC为 EcoRI酶切位点），3'端添加 CTCGAGCGG (其中CTCGAG为XhoI酶切位点，CGG为保护碱基）， 得到CaIFNa序列（SEQ ID No :4)，委托生物公司合成。
[0047] 第二步：构建含犬干扰素 a融合蛋白基因 （SEQ ID No :1)的重组质粒
[0048] 人工合成的CaIFNa序列（SEQIDNo:4)和表达载体pET44a均用EcoRI/XhoI双 酶切，将酶切后的CaIFN α连接到载体pET44a上，形成重组质粒pET44_CaIFN α。将重组质 粒pET44_CaIFNa转化入大肠杆菌DH5a，筛选含有重组质粒的菌，做PCR鉴定，并提取质粒 做酶切鉴定，阳性克隆送至生物公司测序，证实该重组质粒含有表达犬干扰素 α融合蛋白 (SEQ ID No :5)的基因序列 NusA-CaIFNa (SEQ ID No :1)。
[0049] 优化重组质粒的鉴定图如图1所示，其中，1、2 :DNA marker ;3 :重组质粒；4 : EcoRI和XhoI双酶切；5 :PCR鉴定。
[0050] 实施例2犬干扰素 α融合蛋白的可溶性鉴定
[0051] 第一步：构建表达犬干扰素 α融合蛋白的可溶性鉴定的基因工程菌
[0052] 将上述所得的含有NusA-CaIFNa基因序列（SEQ ID No :5)的重组质粒转化 入大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达犬干扰素 α融合蛋白的基因工程菌pET44_CaIFNa/ BL21(DE3) 〇
[0053] 第二步：不同温度诱导表达
[0054] 将上述的基因工程菌pET44-CaIFNa /BL21 (DE3)接种于LB培养基中，37°C 210rpm 过夜培养活化。将活化后的菌种转接于新鲜的LB培养基中培养。当0D_为06-0. 8时加 入IPTG，使其终浓度为lmmol/L。不同诱导温度210rpm诱导12h。将上述所得菌液离心，收 集菌体。用IDAO重悬，超声破碎菌体。12000rpm离心5min，将上清和沉淀分离，分别进行 SDS-PAGE 分析。
[0055] 不同诱导温度下犬干扰素 α融合蛋白的可溶性鉴定结果如图2,其中，I :marker ; 2-3 :18°C诱导的超声上清和沉淀；4-5 :25°C诱导的超声上清和沉淀；6-7 :37°C诱导的超声 上清和沉淀。结果表明，在18°C和25°C下，犬干扰素 α融合蛋白存在于超声上清中，即为 可溶性表达。
[0056] 其中，IDAO 的配方为：20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5Μ NaCl。
[0057] 实施例3制备犬干扰素 α融合蛋白
[0058] 第一步：发酵犬干扰素 α融合蛋白
[0059] 将保存的基因工程菌pET44-CaIFNa /BL21 (DE3)接种于LB培养基中，37°C 210rpm 过夜培养活化。将活化后的菌种转接与新鲜的LB培养基中培养。当0D_为06-0. 8时加 入IPTG，使其终浓度为lmmol/L。25°C 210rpm诱导12h。
[0060] 第二步：纯化犬干扰素 α融合蛋白
[0061] 将上述所得菌液离心，收集菌体。用IDAO重悬，超声破碎菌体。离心收集上清。 取镍离子亲和层析柱，将超声上清缓慢加入到层析柱中，在分别用2个柱体积的IDA0， IDA80, IDA100, IDA150, IDA200, IDA300, IDA1000 溶液洗脱。收集各梯度的洗脱液，用 12% SDS-PAGE分析各洗脱液成分。收集含目的蛋白的洗脱峰，用pH7. 4的PBS透析除去咪唑。 得到纯化后的犬干扰素 α融合蛋白。
[0062] 犬干扰素 α融合蛋白纯化前后的鉴定图如图3所示，其中，I :Protein marker ;2 : 超声上清；3 :超声沉淀；4 :过未和柱后；5 :纯化后犬干扰素 α融合蛋白。
[0063] 其中各溶液的配方如下：
[0064] IDA80 :20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5Μ NaCl，80mM 咪唑。
[0065] IDAlOO :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5M NaCl，IOOmM 咪唑。
[0066] IDA150 :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5Μ NaCl，150mM 咪唑。
[0067] IDA200 :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5M NaCl，200mM 咪唑。
[0068] IDA300 :20mM Tris-HCl (pH = 7· 4)，0· 5M NaCl，300mM 咪唑。
[0069] IDA1000 :20mM Tris-HCl (pH = 7. 4)，0· 5M NaCl，IM 咪唑。
[0070] PBS :NaCl 8g，KCl 0· 2g，Na2HPO4. 12H20 3. 5g，KH2PO4 0· 27g，蒸馏水定容至 1L。
[0071] 实施例4犬干扰素 α融合蛋白的抗病毒活性检测
[0072] 本实施例采用实施例3制备得到的犬干扰素 α融合蛋白。
[0073] 采用微量细胞病变抑制法：将犬肾细胞MDCK接种于96孔板中，每孔1000个细胞， 待细胞贴壁之后加入4倍比稀释的犬干扰素 α融合蛋白，每个稀释度做8个重复。在CO2 培养箱中培养24小时。弃去上清，加入100TCID50的水泡型口炎疱疹病毒VSV。同时设立 阴性对照组（只加犬干扰素 α融合蛋白，不加病毒）、阳性对照（只加病毒，不加犬干扰素 α融合蛋白）、空白组（不加犬干扰素 α融合蛋白，不加病毒）。在CO2培养箱中培养24小 时。观察细胞病变情况。能保护半数细胞免受病毒感染的干扰素最高稀释倍数，即为干扰 素的效价。实验结果表明，阳性对照组细胞出现病变，说明本实验所用VSV确能感染MDCK， 即该测试系统有效。阴性对照组的细胞状态同空白组的相同，说明本发明犬干扰素 α融合 蛋白对细胞没有毒副作用。浓度较高的实验组中细胞未出现病变，说明本发明犬干扰素 a 融合蛋白能保护MDCK不受VSV的感染。用Reed-Muench法计算实验组，即本发明犬干扰素 α融合蛋白的效价为（2. 25±0.87)X1012U/mol，表明本发明犬干扰素 α融合蛋白具有抗 病毒活性。
[0074] 实施例5犬干扰素 α融合蛋白的体外稳定性实验
[0075] 本实施例采用实施例3制备得到的犬干扰素 α融合蛋白。
[0076] 犬干扰素 α融合蛋白溶在PBS中，0. 22um过滤除菌。置于37°C孵育，每隔一定时 间取样，冻于_20°C保存。最后将所有的样品进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色液染色后用软 件分析。实验结果如图4所示，犬干扰素 α融合蛋白在37°C放置12h后蛋白含量保留约 90%，放置96h后蛋白含量仍保留约63%，表明本发明犬干扰素 α融合蛋白降解缓慢，稳定 性好。
[0077] 实施例6犬干扰素 α融合蛋白的活性稳定性实验
[0078] 本实施例采用实施例3制备得到的犬干扰素 α融合蛋白。
[0079] 将犬肾细胞MDCK接种于96孔板中，待细胞贴壁之后加入4倍比稀释的犬干扰 素 α融合蛋白，每个稀释度做8个重复。在CO2培养箱中培养不同时间。弃去上清，加入 100TCID50的水泡型口炎疱疹病毒VSV。在CO 2培养箱中培养24小时。观察细胞病变情况。 能保护半数细胞免受病毒感染的干扰素最高稀释倍数，即为干扰素的效价。用Reed-Muench 法计算各个时间段犬干扰素 α融合蛋白的抗病毒活性。实验结果如图5所示，犬干扰素 a 融合蛋白处理细胞96h后仍保留30%左右的抗病毒活性，表明本发明犬干扰素 α融合蛋白 有长效的活性。
【权利要求】
1. 编码犬干扰素a融合蛋白的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列具有如SEQ ID No : 1所示之序列。
2. 如权利要求1所述之核酸序列，其特征在于，所述之核酸序列包含位于N端的NusA 核酸序列和位于C端的犬干扰素a核酸序列，所述NusA核酸序列与所述犬干扰素a核酸 序列之间由EcoR I酶切序列连接。
3. 如权利要求1所述之核酸序列，其特征在于，所述之犬干扰素a核酸序列是针对大 肠杆菌表达系统密码子偏好性优化过的核酸序列；所述之犬干扰素a核酸序列具有如SEQ ID No : 3所示之序列。
4. 一种犬干扰素a融合蛋白，其特征在于，所述犬干扰素a融合蛋白包含一 NusA蛋 白和一犬干扰素a ;编码所述犬干扰素a融合蛋白的核酸序列如SEQ ID No :1所示。
5. 如权利要求3所述的犬干扰素a融合蛋白，其特征在于，所述犬干扰素a融合蛋白 包含位于氮端的大肠杆菌NusA蛋白和位于碳端的犬干扰素a蛋白，所述NusA蛋白与所述 犬干扰素a蛋白之间由双肽Glu-Phe连接。
6. 如权利要求3所述的犬干扰素a融合蛋白，其特征在于，所述犬干扰素a融合蛋白 具有如SEQ ID No : 5所示之序列。
7. 如权利要求3所述的犬干扰素a融合蛋白，其特征在于，所述犬干扰素a融合蛋白 为可溶性蛋白。
8. 如权利要求3所述的犬干扰素a融合蛋白，其特征在于，所述犬干扰素a融合蛋白 不需要酶切即具有抗病毒活性。
9. 如权利要求3所述的犬干扰素a融合蛋白，其特征在于，所述犬干扰素a融合蛋白 具有1?稳定性。
10. 如权利要求3所述的犬干扰素a融合蛋白在制备犬抗病毒药物中的应用。
11. 一种利用犬干扰素a融合蛋白抑制犬病毒活性的方法，其中，所述犬干扰素a融 合蛋白为如权利要求3所述的无需酶切即具有抗病毒活性的可溶性蛋白。
12. -种犬干扰素a融合蛋白的制备方法，其特征在于，其步骤包括，将犬干扰素a 的DNA序列按照大肠杆菌表达系统的密码子偏爱性优化密码子，通过克隆技术连接到表 达NusA蛋白的载体pET44a中，形成编码犬干扰素a融合蛋白的重组质粒，再将该质粒转 化进大肠杆菌BL21表达系统中，经诱导表达而产生犬干扰素a融合蛋白；当诱导温度为 18°C-25°C时，所表达的犬干扰素a融合蛋白为可溶性表达；经过镍离子亲和层析纯化，透 析除盐，得到如权利要求3所述的犬干扰素a融合蛋白。
13. 如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述犬干扰素a融合蛋白为不需要 酶切即具有抗病毒活性的可溶性蛋白。
【文档编号】A61K38/21GK104388452SQ201410568273
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】杨芳, 黄静, 潘盈盈, 谭士明, 严文娟, 陈亚州, 吴自荣 申请人:华东师范大学