专利名称：一种犬重组干扰素α及制备方法
技术领域：
本发明公开了一种犬重组干扰素α，同时还提供了犬重组干扰素α的制备方法， 为基因工程方法生产重组犬干扰素，属于生物制品领域。
背景技术：
随着国内工作犬(军犬、警犬、实验用犬等)、肉用犬以及宠物犬等犬类饲养量的大幅度增加，病毒性疾病益成为威胁犬类生命的直接原因。人与犬的亲密接触大大增加了人被病毒感染的机会。如狂犬病毒、犬细小病毒和犬瘟热病毒等，都会给人类健康带来极大的威胁，已引起全社会的关注。在兽医临床方面，由于疫苗的使用、保存、运输等方面的原因，常会使免疫失败，而疫苗研究的时间较长，不能及时地用于新病毒的临床治疗。因此，若要综合控制犬病毒性疾病，需要安全、有效、副作用少的药物。犬干扰素具有广谱抗病毒活性，在一定程度上可以满足上述要求，具有有很高的临床应用价值。1957年，英国科学家Alick Isaacs和lean Lindenmann利用鸡胚绒毛尿囊研究流感干扰现象时，发现一种能够干扰病毒繁殖的物质，称之为干扰素(interferon，IFN).从此以后，IFN—直是病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关领域的研究热点.目前，重组人干扰素已广泛应用于治疗乙肝、心肌炎等病毒性感染且获得了较好的疗效。Himmler等于1987年首先开始研究犬干扰素(CaIFN-α )基因，利用人干扰素α 的cDNA为探针，从犬的全基因组文库中克隆出CaIFN-α基因，报道了该序列并申请了专利，其对犬细胞的生物活性为3X105IU/L。我国科研工作者也相继展开了关于犬干扰素α重组、表达等方面的研究，并获得了一系列成果。夏春等利用PCR技术扩增、克隆了拉布拉多犬和德国牧羊犬的干扰素基因 alphaIFN并进行了测序夏春，汪明，夏兆飞.拉布拉多犬和德国牧羊犬干扰素alpha基因克隆及测序.农业生物技术学报1999，7 (3)但未进行表达，应用方面的研究。项黎丽等克隆了犬干扰素α基因序列，利用IPTG化学试剂进行了诱导表达，经纯化获得了纯度较好的犬α干扰素项黎丽，闫若潜，盛敏等，犬α干扰素的克隆、表达及纯化.中国动物检疫 2010, 27 (1)35-38，但未对发酵培养进一步研究；本发明进行了不同程度的发酵培养研究且获得了高纯度的犬重组干扰素。
发明内容
本发明提供了一种犬重组干扰素α。本发明还提供了犬重组干扰素α的制备方法。本发明公开的犬重组干扰素α，其特征在于将犬干扰素α基因与表达载体 PBV220进行连接。所述犬重组干扰素α的基因，为以下序列
ATG TGC CAT CTG COG GAC AOC CAT GGC CTG OGT AAT TGG OGT GTG CTG AOG CTG CTG GGC 60CAG ATG OGT OGT CTG AGC GCG GGT AGC TGC GAC CAT TAT AOC AAC GAT TTT GCG TTC COG 120 AAA GAG CTG TTT GAT GGT CM OGT CTG CAA GM GCC CAG GCG CTG AGC GTG GTG CAT GTG 180 ATG ACC CAG AM GTG TTT CAC CTG ITT TGC QjG GAT AOG AGC AGC GCG OCA TGG AAT ATG 240 AOC CTG CTG GAA GAA CTG TGC AGC GGC CTG AGC GAA CAG CTG GAT GAT CTG GAA GCG TGC 300 OCA CTG CAG GM GCC GGT CTG GCG GM ACC COG CTG ATG CAT GM GAT AGC ACC CTG OGC 360 ACC TAC TTT CAG OGC ATT AGC CTG TAT CTG CAG GAC OGT AAC CAT AGC COG TGC GCG TGG 420 GM ATG GTG OGT GCG GM Απ GGC OGT AGC ITT TTC AGC AGC AOG ATC CTG CAA GAG OGT 480 Απ OGT OGT GGC AM TM498
本发明公开的犬重组干扰素α的制备方法，包括以下步骤
1)编码犬重组干扰素α基因的获得
利用CaIFN- α基因序列合成权利要求2所述的目的基因片段； 将上述基因片段与大肠杆菌升温诱导型载体(PBV220 )进行重组 用限制性内切酶(EcoR I和Ml I )消化酶切表达载体，然后进行琼脂糖凝胶电泳切下目的DNA带，以外源目的DNA和载体DNA5:1的末端比例，用Τ4 DNA连接酶进行粘性末端定向连接，得重组目的基因片段；
2)E. coli BL21工程菌的获得
取37°C振荡培养过夜的E. coli BL21菌种，接种于LB培养基中，37°C振荡培养2_3小时；冰浴10min，4°C 4000r/min离心IOmin收集菌体，用预冷的IOOmMCaCl2溶液悬浮细胞， 离心收集细胞，再用预冷的IOOmM CaCl2溶液悬浮细胞，得到E. coli BL21感受态细胞；
将重组目的基因片段与100 μ 1 Ε. coli BL21感受态细胞混勻，冰浴30min，42°C水浴 90s，再冰浴2min，加入0. 5mlLB培养基37°C培养1小时后涂布于含100 μ g/mlAmpicillin 的LB琼脂板，37°C培养过夜；挑取转化子接种于含Ampicillin的LB液体培养基中，37°C振荡过夜；收集菌体，得E. coli BL21工程菌；
3)发酵表达
按接种量将工程菌接种于200ml LB培养液中，30°C振荡培养过夜；按5%接种于IL LB培养液中，转二代30°C培养至OD值为0. 6时，按10%接种于发酵罐中，30°C培养至OD为 1-2时，快速升温至42°C，菌体表达，培养4-5小时，4000r/min离心30min，收集表达菌体；
3)菌体破碎
将上述菌体冰浴条件下超声破碎频率为20kHz，破碎时间为5s，间隔时间为5s，连续 30min ； 10000r/min离心15min，收集沉淀，得包涵体；将包涵体用4mol/L尿素，pH=8. 5按 1:5溶解，得包涵体悬浮液；
4)犬重组干扰素的变性
将上述包涵体悬浮液lOOOOr/min离心15min，收集沉淀；将沉淀按1 5溶于7mol/L盐酸胍中，混合均勻，裂解作用2-3小时，得到裂解液；
5)犬重组干扰素的复性
将裂解液用2. 5mol/L盐酸胍稀释后，按1:8悬浮0. 15mol/L硼酸溶液中，4°C作用18h， 得到复性液；
6)犬重组干扰素α的纯化
上述复性液经0. 45 μ m滤膜过滤，上载疏水层析柱和分子筛层析柱进行纯化；疏水层析(hydrophobic interaction chromatography HIC)疏水层析柱予页先用 (50mmol/L PB、1.5mol/L (NH4)2SO4 ρΗ7· 8)液体平衡，用(50mmol/L PB、lmol/L (NH4)2SO4 PH7.8)洗脱，用(0.5mol/L NaOH)洗脱以再生层析柱，得到纯化的重组犬干扰素α样品；
分子筛层析(S印hacryl-S-100):将上述纯化样品上载分子筛层析柱 (S印hacryl-S-100)，预先用(20mmol/L PB,0. 85% NaCl pH7. 4)平衡层析柱；样品上载后用(20mmol/L PB,0. 85% NaCl pH7. 4)洗脱，用(0. lmol/L NaOH)洗脱以再生层析柱，得到高纯度的犬重组干扰素α样品。犬重组干扰素α浓度的测定
本发明采用Lowry法测定犬重组干扰素α的浓度。Lowry法即R)Iin酚法测定纯化后重组犬干扰素的蛋白含量。其原理为磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应。蛋白质中含有代酚基的酪氨酸，所以可用此反应测定蛋白含量。犬重组干扰素α纯度的测定
本发明采用SDS聚丙烯凝胶电泳法测定犬重组干扰素α的纯度。待测纯度样品经SDS 聚丙烯凝胶电泳获得的电泳图谱，用BandScan软件分析即可得到样品的纯度。犬重组干扰素α的生物活性测定
本发明利用MDCK (犬肾细胞)和VSV (水泡性口炎)病毒，采用细胞病变抑制法测量犬重组干扰素α生物活性，并计算其比活性。犬重组干扰素α内毒素检测
本发明利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。确定最大有效稀释倍数(MVD)最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。根据最大有效稀释倍数稀释犬重组干扰素α样品，检查其细菌内毒素。用以下公式来确定MVD MVD=cL/λ
式中，L为供试品的细菌内毒素限值； c为供试品溶液的浓度；
λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)，或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。本发明的积极效果在于将犬干扰素α的重组基因在大肠杆菌中进行表达，通过复性和纯化过程，获得了纯度大于98%的犬干扰素α。利用MDCK (犬肾细胞)-VSV (水泡性口炎)病毒体系对其生物活性进行测定，其比活性达到了 2-3Χ 107IU/mg。
图1为目的基因片段l、CaIFN_a双酶切，2、marker。图2为连接表达载体后的重组基因片段1_4、pBV220-CaIFN-a双酶切，5、 markerο图3为重组犬干扰素α发酵表达1、诱导前，2、marker，3_6、诱导l_4h，7、诱导 4. 5h，8、诱导 5h。图4为纯化重组犬干扰素α电泳图；1、marker，2、纯化后样品。
图5为重组犬干扰素α发酵表达；1、marker，2、诱导前，3-7、诱导1_证。图6为纯化重组犬干扰素α电泳图；1、marker，2、纯化后样品。图7为重组犬干扰素α发酵表达；1、marker，2、诱导前，3-7、诱导1_证。图8为纯化重组犬干扰素α电泳图；1、纯化后样品，2、marker。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1
1)编码犬重组干扰素α基因的获得
参照CaIFN-α基因序列，合成目的基因片段，基因序列如下
ATG TGC CAT CTG COG GAC AOC CAT GGC CTG OGT AAT TGG OGT GTG CTG AOG CTG CTG GGC 60 CAG ATG OGT OGT CTG AGC GCG GGT AGC TGC GAC CAT TAT AOC AAC GAT TTT GCG TTC COG 120 AAA GAG CTG TTT GAT GGT CM OGT CTG CAA GM GCC CAG GCG CTG AGC GTG GTG CAT GTG 180 ATG ACC CAG AM GTG TTT CAC CTG TTT TGC OOG GAT AOG AGC AGC GCG CCA TGG AAT ATG 240 AOC CTG CTG GAA GAA CTG TGC AGC GGC CTG AGC GAA CAG CTG GAT GAT CTG GAA GCG TGC 300 OCA CTG CAG GM GCC GGT CTG GCG GM ACC OOG CTG ATG CAT GAA GAT AGC AOC CTG OGC 360 ACC TAC ITT CAG OGC ATT AGC CTG TAT CTG CAG GAC OGT MC CAT AGC COG TGC GCG TGG 420 GAA ATG GTG OGT GCG GAA ATT GGC OGT AGC TTT TTC AGC AGC AOG ATC CTG CM GAG OGT 480 Απ OGT OGT GGC AM TM498
做琼脂糖凝胶电泳鉴定其基因片段大小与理论大小相符(见图1)；将基因片段与大肠杆菌升温诱导型载体(PBV220)重组，方法如下。用限制性内切酶(EcoR I和Ml I )消化酶切表达载体，然后进行琼脂糖凝胶电泳切下目的DNA带，以外源目的DNA和载体DNA5:1的末端比例，用T4 DNA连接酶进行粘性末端定向连接，得重组目的基因片段(见图2)；
2)E. coli BL21工程菌的获得
取37°C振荡培养过夜的E. coli BL21菌种，接种于LB培养基中，37°C振荡培养2_3小时；冰浴10min，4°C 4000r/min离心IOmin收集菌体，用预冷的IOOmMCaCl2溶液悬浮细胞， 离心收集细胞，再用预冷的IOOmM CaCl2溶液悬浮细胞，得到E. coli BL21感受态细胞；
将重组目的基因片段与100 μ 1 Ε. coli BL21感受态细胞混勻，冰浴30min，42°C水浴 90s，再冰浴2min，加入0. 5mlLB培养基37°C培养1小时后涂布于含100 μ g/mlAmpicillin 的LB琼脂板，37°C培养过夜；挑取转化子接种于含Ampicillin的LB液体培养基中，37°C振荡过夜；收集菌体，得E. coli BL21工程菌；
3)发酵表达
按接种量将工程菌接种于200ml LB培养液中，30°C振荡培养过夜；按5%接种于IL LB培养液中，转二代30°C培养至OD值为0. 6时，按10%接种于10L发酵罐中，30°C培养至 OD为1-2时，快速升温至42°C，菌体表达，培养4-5小时，4000r/min离心30min，收集表达菌体50g ；目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的20% (见图3)；
4)菌体破碎将上述菌体冰浴条件下超声破碎频率为20kHz，破碎时间为5s，间隔时间为5s，连续 30min ； 10000r/min离心15min，收集沉淀，得包涵体；将包涵体用4mol/L尿素，pH=8. 5按 1:5溶解，得包涵体悬浮液；
5)犬重组干扰素的变性
将上述包涵体悬浮液lOOOOr/min离心15min，收集沉淀；将沉淀按1 5溶于7mol/L盐酸胍中，混合均勻，裂解作用2-3小时，得到裂解液；
6)犬重组干扰素的复性
将裂解液用2. 5mol/L盐酸胍稀释后，按1:8悬浮0. 15mol/L硼酸溶液中，4°C作用18h， 得到复性液；
7)犬重组干扰素α的纯化
上述复性液经0. 45 μ m滤膜过滤，上载疏水层析柱和分子筛层析柱进行纯化； 疏水层析(hydrophobic interaction chromatography HIC)疏水层析柱予页先用 (50mmol/L PB、1.5mol/L (NH4)2SO4 ρΗ7· 8)液体平衡，用(50mmol/L PBUmol/L (NH4)2SO4 PH7.8)洗脱，用(0.5mol/L NaOH)洗脱以再生层析柱得到纯化重组犬干扰素α样品；
分子筛层析(S印hacryl-S-100):将上述纯化样品上载分子筛层析柱 (S印hacryl-S-100)，预先用(20mmol/L PB,0. 85% NaCl pH7. 4)平衡层析柱；样品上载后用(20mmol/L PB,0. 85% NaCl pH7. 4)洗脱，用(0. lmol/L NaOH)洗脱以再生层析柱，得到纯度大于98%的犬重组干扰素α蛋白(见图4);
8)犬重组干扰素的活性检测
利用细胞病变抑制法，依据抑制VSV病毒攻击MDCK细胞病变的方法，设计标准品对照和空白对照组，用结晶紫染液染色细胞，酶标仪上检测测定波长为570nm，参比波长为 630nm，经SOFT max PRO软件测定输入相关参数及稀释倍数后，记录测定结果。测定犬重组干扰素α纯化产物的活性约为4700080IU。9)犬重组干扰素的蛋白含量测定
利用Folin酚法测定重组犬重组干扰素α的蛋白含量为200 μ g/ml。10)犬重组干扰素的内毒素检测
利用鲎试剂检测纯化后重组犬干扰素的内毒素< 10EU/mg 11)犬重组干扰素比活性计算
比活性为生物学活性与蛋白质含量之比，计算得到重组犬干扰素的比活性为 2. 4X107IU/mg。12)犬重组干扰素生产工艺各步骤质量及收率
纯度浓度比活性内毒素发酵表达20%复性52%40 μ g/mlsS lOOOEU/mg疏水层析85%780 μ g/ml1. 1X 107IU/mgsS 50EU/mg分子筛98%200 μ g/ml2. 4X107IU/mgsS lOEU/mg
实施例2
1)编码犬干扰素α重组基因的获得
方法参照实施例1获得犬重组干扰素α基因
2)Ε. coli BL21工程菌的获得方法参照实例1经转化获得该重组基因的E. coli BL21工程菌的获得。3)发酵表达
按接种量将工程菌接种于200ml LB培养液中，30°C振荡培养过夜；按5%接种于IL LB培养液中，转二代30°C培养至OD值为0. 6时，按10%接种于50L发酵罐中，30°C培养至 OD为1-2时，快速升温至42°C，菌体表达，培养4-5小时，4000r/min离心30min，收集表达菌体270g ；目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的22% (见图5)；
4)菌体破碎
将上述菌体冰浴条件下超声破碎频率为20kHz，破碎时间为5s，间隔时间为5s，连续 30min ； 10000r/min离心15min，收集沉淀，得包涵体；将包涵体用4mol/L尿素，pH=8. 5按 1:5溶解，得包涵体悬浮液；
5)犬重组干扰素的变性
将上述包涵体悬浮液lOOOOr/min离心15min，收集沉淀；将沉淀按1 5溶于7mol/L盐酸胍中，混合均勻，裂解作用2-3小时，得到裂解液；
6)犬重组干扰素的复性
将裂解液用2. 5mol/L盐酸胍稀释后，按1:8悬浮0. 15mol/L硼酸溶液中，4°C作用18h， 得到复性液；
7)犬重组干扰素的纯化
纯化方法参照实施例1，得到纯度大于98%的犬重组干扰素α蛋白(见图6);
8)犬重组干扰素的活性检定
利用MDCK-VSV体系，根据细胞病变抑制法检测生物学活性，具体方法参照实施例1 ；
8)犬重组干扰素的蛋白含量测定测定方法参照实施例1 ；
9)犬重组干扰素的内毒素检测检测方法参照实施例1 ；
10)犬重组干扰素比活性计算
比活性为生物学活性与蛋白质含量之比，计算得到重组犬干扰素的比活性为 2. 56X 107IU/mg。11)犬重组干扰素生产工艺各步骤质量及收率
权利要求
1.一种犬重组干扰素α，其特征在于将犬干扰素α基因与表达载体pBV220进行连接。
2.权利要求1所述犬重组干扰素α的基因，为以下序列ATG TGC CAT CTG COG GAC ACC CAT GGC CTG OGT AAT TGG OGT GTG CTG AOG CTG CTG GGC 60 CAG ATG OGT OGT CTG AGC GCG GGT AGC TGC GAC CAT TAT ACC AAC GAT TTT GCG TTC COG 120 AAA GAG CTG ITT GAT GGT CAA OGT CTG CAA GAA GCC CAG GCG CTG AGC GTG GTG CAT GTG 180 ATG ACC CAG AAA GTG ITT CAC CTG ITT TGC COG GAT AOG AGC AGC GCG OCA TGG AAT ATG 240 ACC CTG CTG GM GAA CTG TGC AGC GGC CTG AGC GM CAG CTG GAT GAT CTG GAA GCG TGC 300 CCA CTG CAG GM GCC GGT CTG GCG GM AOC QjG CTG ATG CAT GAA GAT AGC AOC CTG OGC 360 ACC TAC ITT CAG OGC Απ AGC CTG TAT CTG CAG GAC OGT MC CAT AGC COG TGC GCG TGG 420 GAA ATG GTG OGT GCG GAA ATT GGC OGT AGC TTT TTC AGC AGC AOG ATC CTG CM GAG OGT 480 Απ OGT OGT GGC AM TM498。
3.权利要求1所述的犬重组干扰素α的制备方法，包括以下步骤1)编码犬重组干扰素α基因的获得利用CaIFN- α基因序列合成权利要求2所述的目的基因片段； 将上述基因片段与大肠杆菌温度诱导型载体(PBV220)进行重组； 用限制性内切酶(EcoR I和Ml I )消化酶切表达载体，然后进行琼脂糖凝胶电泳切下目的DNA带，以外源目的DNA和载体DNA5:1的末端比例，用Τ4 DNA连接酶进行粘性末端定向连接，得重组目的基因片段；2)E. coli BL21工程菌的获得取37°C振荡培养过夜的E. coli BL21菌种，接种于LB培养基中，37°C振荡培养2_3小时；冰浴10min，4°C 4000r/min离心IOmin收集菌体，用预冷的IOOmMCaCl2溶液悬浮细胞， 离心收集细胞，再用预冷的IOOmM CaCl2溶液悬浮细胞，得到E. coli BL21感受态细胞；将重组目的基因片段与100 μ 1 Ε. coli BL21感受态细胞混勻，冰浴30min，42°C水浴 90s，再冰浴2min，加入0. 5mlLB培养基37°C培养1小时后涂布于含100 μ g/mlAmpicillin 的LB琼脂板，37°C培养过夜；挑取转化子接种于含Ampicillin的LB液体培养基中，37°C振荡过夜；收集菌体，得E. coli BL21工程菌；3)发酵表达按接种量将工程菌接种于200ml LB培养液中，30°C振荡培养过夜；按5%接种于IL LB培养液中，转二代30°C培养至OD值为0. 6时，按10%接种于发酵罐中，30°C培养至OD为 1-2时，快速升温至42°C，菌体表达，培养4-5小时，4000r/min离心30min，收集表达菌体；4)菌体破碎将上述菌体冰浴条件下超声破碎频率为20kHz，破碎时间为5s，间隔时间为5s，连续 30min ； 10000r/min离心15min，收集沉淀，得包涵体；将包涵体用4mol/L尿素，pH=8. 5按 1:5溶解，得包涵体悬浮液；5)犬重组干扰素的变性将上述包涵体悬浮液lOOOOr/min离心15min，收集沉淀；将沉淀按1 5溶于7mol/L盐酸胍中，混合均勻，裂解作用2-3小时，得到裂解液；6)犬重组干扰素的复性将裂解液用2. 5mol/L盐酸胍稀释后，按1:8悬浮0. 15mol/L硼酸溶液中，4°C作用18h， 得到复性液；7)犬重组干扰素α的纯化上述复性液经0. 45 μ m滤膜过滤，上载疏水层析柱和分子筛层析柱进行纯化； 疏水层析(hydrophobic interaction chromatography HIC)疏水层析柱予页先用 (50mmol/L PB、1.5mol/L (NH4)2SO4 ρΗ7· 8)液体平衡，用(50mmol/L PB、lmol/L (NH4)2SO4 PH7.8)洗脱，用(0.5mol/L NaOH)洗脱以再生层析柱，得到纯化的重组犬干扰素α样品；分子筛层析(S印hacryl-S-100):将上述纯化样品上载分子筛层析柱 (S印hacryl-S-100)，预先用(20mmol/L PB,0. 85% NaCl pH7. 4)平衡层析柱；样品上载后用(20mmol/L PB,0. 85% NaCl pH7. 4)洗脱，用(0. lmol/L NaOH)洗脱以再生层析柱，得到犬重组干扰素α样品。
全文摘要
本发明公开了一种犬重组干扰素α，同时还提供了犬重组干扰素α的制备方法，将犬干扰素α的重组基因在大肠杆菌中进行表达，通过复性和纯化过程，获得了纯度大于98％的犬干扰素α。利用MDCK(犬肾细胞)-VSV(水泡性口炎)病毒体系对其生物活性进行测定，其比活性达到了2-3×107IU/mg。
文档编号C12N15/21GK102321169SQ20111029189
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者刘新涛, 李莹莹, 殷玉和 申请人:长春工业大学