专利名称：一种检测活细胞内atg4b活性的多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能够特异性检测活细胞中ATG4B酶活性的新型多肽的制备及应用，特别涉及一种新型小肽的设计、合成以及该小肽在检测与ATG4B活性相关的细胞自噬水平方面的应用。
背景技术：
自卩遼相关蛋白4B (Autophagy-ralete d protein 4B, ATG4B)是细胞自卩遼过程中的一种关键酶，首先由Mar ifio等于2003年发现并报道，随后Taichi等解析了其结构，并逐渐阐明了其在细胞自噬发生过程中的作用与机制。I. ATG4B的基本组成及结构ATG4B全长由394个氨基酸残基构成，其结构中包含8个α螺旋结构和13个β折叠结构(图I)，共组成柔性与蛋白酶2个结构域。其中D278，H280和C74位氨基酸残基是其发挥功能中的关键位点(图2)。2. ATG4B在细胞自噬过程中的作用及机制细胞自噬(Autophagy)是细胞的一种基本存活机制，其主要功能是及时清除细胞内损伤的细胞器、蛋白质等组份，保持细胞内部的清洁与稳定，并能将分解产生的氨基酸等产物作为细胞生长的原料，因此被称为细胞内的“垃圾处理厂”。细胞自噬的过程可分为3个阶段首先生成一段双层磷脂膜；其次双层膜不断延伸，将需要降解的细胞成分包裹形成自噬小体；然后自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,并借助溶酶体中的蛋白酶将自噬小体中的细胞成分降解(图3)。其中，在自嗤小体的生成过程中，ATG4B扮演着重要角色。如图4所不，在自嗤小体形成过程中，ATG4B首先将其底物蛋白LC3切去一段，使其由LC3-I(18Kda)变为LC3-II (16Kda)，然后由Atg3/Atg7及Atg5/Atgl2在LC3-II的C端连接上一段脂链，并将LC3-II锚定在自噬小体的膜上。LC3蛋白在这一过程中的变化是细胞自噬过程的标志性事件，因此被用于鉴定细胞内自噬水平的高低，即LC3-II的量越高代表自噬水平越高，也意味着ATG4B活性越高。3. ATG4B对LC3的酶解作用LC3又称为自卩遼相关蛋白8 (Autophagy related protein 8, ATG8),是细胞自卩遼发生过程中的关键蛋白，是ATG4B的特异性酶解底物。研究表明，ATG4B在LC3中的酶解位点位于其116位的甘氨酸残基，其中的TFG三肽是ATG4B酶解识别的基本底物序列(图5)，因此TFG三肽可单独作为ATG4B的底物使用。4. ATG4B活性检测方法由于ATG4B在细胞自噬发生过程中的重要作用，目前通常将细胞内ATG4B的活性水平作为细胞自噬水平的指标，常用的检测方法包括以下几种(I)蛋白质免疫印迹法(Western blot)通过分离细胞并制备蛋白质样品，电泳分离后使用LC3的抗体检测细胞内LC3-I与LC3-II之间的变化来判断细胞自噬的发生与ATG4B活性。是目前细胞自噬检测中最常用方法，优点是直观、清晰，缺点是无法精确定量，操作繁杂。(2)基于TFG三肽的活性检测
由于TFG三肽可作为ATG4B的底物直接作用，因此将TFG三肽的C末端用荧光素标记(如AFC)后可用于检测ATG4B活性。但由于TFG三肽不能自由穿过细胞膜而进入细胞，因此需将细胞裂解后，把细胞裂解物与检测底物孵育，然后再检测相关荧光值的变化，从而反映ATG4B活性水平。此方法优点是可以直接定量细胞内ATG4B活性，方法相对简单；缺点是无法直接测定活细胞内的ATG4B活性。(3)基于LC3蛋白的FRET检测Min等报道，将LC3蛋白的N端与C端分别偶联绿色荧光蛋白与黄色荧光蛋白，表达的重组蛋白可作为检测底物而测定ATG4B活性。由于检测底物上标记有两种荧光蛋白，其发射波长会发生能量转移(FRET)，而ATG4B切除底物后将C端释放而引起荧光变化可作为检测指标。此方法优点是可直接定量细胞内ATG4B活性，并可高通量检测；缺点是需要制备稳定表达GFP-LC3-YFP重组蛋白的细胞系，质量无法控制，操作繁杂。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种检测活细胞内ATG4B活性的多肽，所述多肽用于检测活细胞内ATG4B活性，具有操作简单，快速，检测结果客观、准确的优点。本发明所述多肽为融合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。本发明以ATG4B作用的底物序列TFG为基础，在ATG4B作用的底物序列TFG的N端偶联穿膜肽RKKRRQRRR与氨基酸残基G，得到上述的融合肽。本发明的第二个目的是提供一种包括带有标记物的上述多肽的试剂盒，所述试剂盒用于检测活细胞内ATG4B的活性。所述标记物为检测用小分子化合物。所述标记物为检测用小分子化合物。所述检测用小分子化合物为荧光素或硝基苯胺盐。试剂盒的基本组成包括带标记物的多肽用无菌水配成终浓度为ImM ;PH值为
7.5 反应缓冲液(IOOmM H印es、20%甘油、O. 5mM EDTA、5mM DTT)。本发明所述多肽用于试剂盒时，在多肽的N端和C端附加标记物，用于标记背景参照信号和检测信号，本发明所述的标记物可以是检测用小分子化合物，如荧光素或PNA(对硝基苯胺盐)等。用标记物标记多肽N端和C端色彩可以不同，其N端荧光作为背景参照信号使用，C端荧光作为检测信号使用。也可以在多肽C端单独连接用于标记检测信号的标记物，使用细胞数量或总蛋白量作为背景参照信号。本发明提供的多肽用于检测活细胞内ATG4B活性，检测方法适用于细胞流式分析、荧光分光光度计检测分析等。本发明的优点是①无需裂解细胞，可以直接检测活细胞内ATG4B活性客观性强，全部检测使用仪器完成，结果为数值，最大程度避免了人为主观因素；③操作相对简单、快速，可以在2小时内完成测定。
本发明所达到的技术效果可直接检测活细胞内ATG4B活性，并且能简单、快速、客观地反映活细胞内ATG4B活性。
图I为ATG4B蛋白中二级结构组成示意图；图2为ATG4B蛋白的空间结构示意图；图3为ATG4B蛋白参与的细胞自噬过程示意图；图4为ATG4B在自噬小体形成过程中的作用；图5为ATG4B对底物LC3的酶解示意图； 图6为Western blot分析细胞自卩遼水平变化；图7为细胞裂解物中ATG4B活性测定；图8为本发明所述多肽的穿膜功能；图9为荧光分光光度法测定ATG4B活性；图10为流式细胞法测定ATG4B活性。
具体实施例方式
相关材料、试剂、仪器说明细胞人宫颈癌Hela细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞DMEM培养基购自美国Hyclone公司，货号SH30022. OlB细胞饥饿培养基HBSS :购自美国Hyclone公司，货号SH30030· 02B胰酶购自美国Hyclone公司，货号SH30042. 01PBS缓冲液购自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZLI_9061细胞裂解液RIPA :购自北京碧云天生物科技有限公司，货号P0013BLC3抗体购自美国Cell signaling technology公司，货号2775S,使用浓度I 1000β-actin 抗体购自美国 Thermo Scientific 公司，使用浓度 I : 3000蛋白质含量测定试剂盒BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)，购自北京碧云天生物科技有限公司，货号=POOlO突光酶标仪SpectraMax Gemini XPS plate reader,美国倒置荧光显微镜OLYMPUS IX-81，日本流式细胞分析仪Beckman XL,美国实施例I一、多肽的设计以ATG4B作用的底物序列TFG为基础，在其N端借肽键直接偶联一段穿膜肽RKKRRQRRR与氨基酸残基G，形成一段新型的多肽(融合肽)(由上海吉尔生化有限公司合成)。所述多肽氨基酸序列为RKKRRQRRRGTFG，分子量为1701. 02。实施例2二、多肽底物的设计与合成将多肽的N端和C端标记物标记，得到多肽底物。所述标记物为检测用小分子化合物，如荧光素或硝基苯胺盐(PM)等，本实施例的标记物采用荧光素。标记多肽N端和C端的荧光素色彩不同，N端荧光作为背景参照信号使用，C端荧光作为检测信号使用。还可以在融合肽C端单独用荧光素标记作为检测信号，使用细胞数量或总蛋白量作为背景参照信号。本实施例多肽的N端用FITC绿色荧光标记，C端用AMC蓝色荧光标记。当然，多肽的N端和C端还可以用其它标记方法，如N端用FITC标记后，C端可配合使用红色荧光罗丹明标记；N端用红色荧光罗丹明标记后C端可配合使用FITC或pNA或AFC标记等；也可以单独在C端使用罗丹明或FITC或pNA或AFC等标记。本实施例设计的多肽底物结构如下 FITC-RKKRRQRRRGTFG-AMC (底物 I)多肽底物的分子量为2361. 77，由上海吉尔生化有限公司合成。底物I为固体黄色粉末，经HPLC检测纯度为97. 30%。合成量10. 8mg,溶于4. 573ml无菌水中，终浓度为ImM，存放于-20°C冰箱。为验证底物I的功能及优势，同时还委托上海吉尔生化有限公司合成了底物2作为实验对照，底物2的结构如下FITC-GTFG-AMC (底物 2)底物2分子量为1040. 15，为黄色固体粉末，纯度95. 67%，合成量10. Omg，溶于
9.6ml无菌水中，终浓度为ImM，存放于_20°C冰箱。底物2中的多肽氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。实施例3三、多肽可检测细胞裂解物中ATG4B活性I.细胞自噬诱导模型为了检测本发明所述多肽是否具有检测ATG4B活性的能力，首先构建了细胞自噬诱导模型。将人宫颈癌细胞Hela以IXlOVml的比例接种至6孔细胞培养板中，每孔2ml。过夜培养后将培养基去掉，对照组仍用正常培养基培养，实验组细胞经PBS洗涤后换用HBSS (含钙、镁离子与IOmM的Hepas缓冲液)培养基分别培养2，3，4小时，作为细胞饥饿模型。诱导结束后，收集各组细胞，裂解后用蛋白质免疫印迹法测定LC3变化情况。结果如图6所示，随诱导时间增加，LC3-II蛋白的表达量升高，表明ATG4B活性增强，细胞自噬水平增加，以饥饿3小时为最佳诱导条件。2.细胞裂解物中ATG4B活性测定将对照组及实验组细胞去培养基，用PBS洗2次，加入细胞裂解液于冰上裂解IOmin0将细胞裂解液吸出，各取50 μ I与底物I或2(2 μ 1，ImM)混匀后在37°C培养箱中作用40min，然后在荧光分光光度计上以320nm激发波长、400nm发射波长进行荧光测定。同时使用考马斯亮蓝法测定细胞裂解液中蛋白质含量，对测定的荧光值进行标准化。测定结果如图7所示，底物I与2均可以很好的测定细胞裂解物中ATG4B活性，两者间不存在显著差异，且测定的趋势与蛋白质免疫印迹分析结果相吻合，说明底物I可以作为ATG4B的底物进行活性测定。实施例4四、多肽具有穿膜功能为测定本发明所述多肽是否能穿过细胞膜进入细胞内，将人宫颈癌细胞Hela以IXlO5M的比例接种至6孔细胞培养板中，每孔2ml。过夜培养后将底物I与底物2按I μ M的浓度分别加入培养基中进行培养，分别于20min，40min, Ih后将培养基去除并用PBS洗涤3次后在荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光情况，结果如图8所示。从图8可看出，对照组底物2完全不具有穿膜功能，而实验组的底物I具有明显的穿膜功能，且随孵育时间增加其穿膜效应增强。实施例5五 、多肽可检测活细胞内ATG4B活性I.荧光分光光度法测定活细胞内ATG4B活性按照细胞自噬诱导模型，对照组为正常培养细胞，实验组为Hela细胞饥饿3小时。随后在对照及实验组的细胞培养基中添加底物1，浓度为I μ μΜ，在37°C培养箱中继续作用I小时，去培养基，用PBS洗3次后用胰酶将细胞消化下来，用PBS重悬细胞后取100 μ μ I直接在荧光荧光分光光度计上以320nm激发波长、400nm发射波长测定蓝色荧光值，同时以488nm为激发波长，525nm为发射波长测定绿色荧光值。蓝色荧光值的测定结果将空白值去除后以绿色荧光值进行标准化，然后与对照组进行比较分析，结果见图9。从图9可看出，经饥饿诱导后，活细胞内ATG4B活性明显升高，与实例2中的结果相一致，说明新型多肽完全可用于活细胞内ATG4B活性的检测。2.流式细胞仪测定活细胞内ATG4B活性细胞处理同I。将细胞重悬于PBS中后直接用于流式细胞分析，蓝色荧光的激发波长为320nm，发射波长为400nm，分别计数实验组及对照组细胞中的蓝色荧光阳性细胞数，结果见图10。从图10中可看出，饥饿诱导后蓝色荧光阳性细胞群明显右移，比例显著升高，表明细胞内ATG4B活性显著升高，与荧光分光光度计测定的结果相符。结论与正常的ATG4B底物序列(底物2)相比，本发明所述的融合肽底物(底物I)不但能够检测细胞裂解液中中ATG4B活性，而且还可以进入活细胞内部直接测定ATG4B活性，检测方法适用于荧光分光光度计法与流式细胞仪法。
权利要求
1.一种多肽，其特征在于该多肽为融合肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一种试剂盒，其特征在于包含带有标记物的权利要求I所述的多肽。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述标记物为检测用小分子化合物。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述检测用小分子化合物为荧光素或硝基苯胺盐。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的的基本组成为用无菌水配成终浓度为ImM的带标记物的多肽PH值为7. 5的反应缓冲液=IOOmM H印es、20%甘油、O.5mM EDTA、5mM DTT。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于检测活细胞内ATG4B的活性。
全文摘要
本发明涉及一种能够特异性检测活细胞中ATG4B酶活性的新型多肽的制备及应用，特别涉及一种新型小肽的设计、合成以及该小肽在检测与ATG4B活性相关的细胞自噬水平方面的应用。本发明所述多肽用于检测活细胞内ATG4B活性，具有操作简单，快速，检测结果客观、准确的优点。
文档编号C07K19/00GK102643350SQ201210112740
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者何凤田, 倪振洪, 连继勤 申请人:中国人民解放军第三军医大学